一种从葡萄酒中提取葡萄基因组dna的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从葡萄酒中提取葡萄基因组DNA的方法，包括如下步骤，1)DNA富集；2)多糖的去除；3)DNA粗提；4)DNA纯化；5)DNA回收，获得葡萄基因组DNA。本方法提取出的DNA溶液澄清透亮，提取纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好，并具较好的完整性。
【专利说明】-种从葡萄酒中提取葡萄基因组DNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种从葡萄酒中提取葡萄基因组DNA的方 法。
【背景技术】
[0002] 葡萄酒的分子鉴定包括葡萄酒中葡萄DNA的提取和下游分子生物学分析两个部 分，其中从葡萄酒中获得高质量的葡萄DNA是进行下游分子生物学分析的基础。植物基因 组DNA提取方法已较为成熟，基于CTAB法和SDS法等传统方法，适于不同类型植物材料的 DNA提取方法已经广泛应用，甚至开发成为商品化的植物DNA提取试剂盒。然而，这些DNA 提取方法均不适用于葡萄酒中的葡萄DNA提取。
[0003] 葡萄酒为高度深加工产品，其生产过程历经发酵、转瓶、陈酿、澄清和过滤等诸多 环节，成品葡萄酒中DNA含量极微，且由葡萄浆果引入葡萄酒中的大量的多酚类（单宁）、多 糖、有机酸等复杂的化学物质，严重影响DNA提取质量及下游的分子生物学分析，目前尚未 见报道一种能够达到应用水平的葡萄酒DNA提取方法，也没有成熟的商品化试剂盒。2000 年至今，关于果汁、新酒或陈酿的葡萄酒中DNA提取及分析的研究报道层出不穷。已有研究 表明：即使经过发酵，葡萄酒中依然存在微量的葡萄DNA，采用分子生物学手段进行用果汁 或葡萄酒中的葡萄DNA分析是可行的。从葡萄酒中提取出足量且优质的葡萄DNA和筛选出 葡萄特异性的PCR引物是应用分子生物学手段鉴别葡萄酒中葡萄品种的前提，也是目前葡 萄酒基因鉴伪技术研究的关键点和难点。在成功的提取出适宜进行下游分子生物学实验的 葡萄DNA后，可以进行葡萄特异性基因的检测，以判断是否用葡萄原汁酿造；可以进行微卫 星位点扩增，通过与相关葡萄微卫星位点数据库比对，从而鉴别出葡萄酒中的葡萄品种。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从葡萄酒中提取葡萄基因组DNA的方法，该方法提取 纯化效率高，得到的DNA浓度高、纯度好，并具较好的完整性。
[0005] 本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：
[0006] 一种从葡萄酒中提取葡萄基因组DNA的方法，包括如下步骤，
[0007] 1)DNA富集：向20?30mL葡萄酒中加入180?220ii g糖元、0? 5?1. 2v/v%的 3 -巯基乙醇和0. 7?1倍体积的异丙醇，混匀后，置于-65°C?_75°C冰箱中1?1. 5h，然 后移至-18°C?-20°C沉淀12h?24h，使葡萄酒中的DNA沉淀，之后离心，收集沉淀；此步 骤能够有效的富集葡萄酒中残存的葡萄DNA碎片，缩短DNA富集所需的时间。由于葡萄酒 中含有较多的酚类物质，容易褐化，色素较难清除，采用该特定步骤，添加用量的试剂，可有 效避免酚类氧化，且助于DNA沉剂。
[0008] 2)多糖的去除：向步骤1)获得的沉淀中加入0.8?lmL去多糖缓冲液，冰浴、混 匀、离心、弃上清，向其中再次加入去多糖缓冲液，冰浴、混匀、离心、弃上清；
[0009] 3)DNA粗提：向其中加入55?65°C预热的700?800 i! L粗提缓冲液，混匀，于 55?65°C水浴30?40min，期间颠倒混匀3?4次，然后离心，收集上清液；
[0010] 4)DNA纯化：向步骤3)获得的上清液中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合 液，混匀后离心，收集上清液，向上清液中加入RNase A溶液进行酶解，然后加入等体积的氯 仿/异戊醇混合液，混匀后离心，取上清；
[0011] 5)DNA回收，获得葡萄基因组DNA。
[0012] 优选地，所述步骤1)中，在DNA富集沉淀后，溶液在4°C条件下6, 000g?7, 000g 离心30min?40min，收集沉淀。
[0013] 优选地，所述步骤2)中，所述的去多糖缓冲液溶剂是水，溶质是如下终浓度的物 质：80 ?120mmol/L pH 值为 8. 0 的 Tris-HCl、4 ?6mmol/L EDTA-Na2、0. 20 ?0? 25mmol/L NaCl和质量体积比为1. 5?2. 5%的PVP-40T。步骤2)中加入一定量的PVP能络合多酚和 萜类物质，可阻止多酚物质氧化为醌，能有效防止多酚的污染；添加本发明特定的去多糖缓 冲液，能有效的去除色素、多糖和酚类物质，提取液会明显变得澄清。
[0014] 优选地，所述步骤2)中，多糖去除的具体步骤如下：
[0015] a)首先向装有上述DNA沉淀的50mL离心管中加入0. 8mL?lmL预冷的去多糖缓 冲液，将离心管壁上的沉淀全部冲洗下来，将沉淀全部转移至2mL离心管中，冰浴5?8min， 期间颠倒混匀1次；
[0016] b)将冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g离心5?8min，弃上清；
[0017] c)在50mL离心管中再次加入0. 5?0. 8mL预冷的去多糖缓冲液，将沉淀全部转移 至步骤a)中所述2mL离心管中，吹打混匀沉淀和溶液后冰浴5?8min，期间颠倒混匀1? 2次；
[0018] d)冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g离心5?8min，弃上清。
[0019] 优选地，步骤3)中，所述的粗提缓冲液溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：18? 22mmol/L EDTA、8 ?12mmol/L pH 值为 8. 0 的 Tris-HCl、l. 2 ?1. 6mol/L NaCl、l. 8 ? 2. 2w/v% CTAB、0. 8 ?1. 2v/v%巯基乙醇、1. 8 ?2. 2w/v% PVP-40T、18 ?22mg/mL 蛋白酶 K。在 Tris-HCl-EDTA(pH 8. 0)的弱碱性缓冲液中，1. 8% -2. 2% (w/v)的 CTAB 配合 1. 2 ? 1. 6mol/L NaCl可以有效的从葡萄酒中提取出DNA。
[0020] 优选地，所述步骤3)中，离心的条件为：在4°C 12, 000g?13000g离心8?10min。
[0021] 优选地，步骤4)中所述的DNA纯化按照如下步骤进行：
[0022] a)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，涡旋震荡混匀后，在4 °C条件下 12, 000g?13000g离心8?10min，所述苯酚/氯仿/异戊醇混合液中，苯酚、氯仿和异戊 醇的体积比为25 :24 :1 ;
[0023] b)吸取上清液至另一新的1. 5mL离心管，加入5?8 ii L浓度为10mg/mL的RNase A于37°C酶解20?30min，所述RNase A的浓度为10mg/mL ;
[0024] c)加入等体积的氯仿/异戊醇混合液涡旋震荡混匀后，在4°C条件下12, 000g? 13000g离心8?10min，取上清，所述氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1〇
[0025] 经DNA提取缓冲液裂解得粗提DNA后，用苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)与氯仿 /异戊醇（24:1)分次抽提，可以进一步去除蛋白质和酚类等杂质。
[0026] 优选地，步骤5)中所述的DNA回收按照如下步骤进行：
[0027] a)向步骤4)获得的上清液中加入0. 1倍体积的摩尔浓度为3?5mol/L的醋酸钠 溶液、5?8 y g糖元和0. 6倍体积的异丙醇，于-18°C?_20°C沉淀DNA 12?24h ;
[0028] b)在4°C条件下12,000g?13000离心5?8min，收集DNA沉淀，弃上清，用洗涤 缓冲液洗涤沉淀，之后在4°C条件下13, 000g离心2min，收集沉淀；
[0029] (：)用75￥八％的乙醇洗涤沉淀，然后在41：条件下12,000?13,00(^离心21^11、 挥去乙醇，加入50 ii L Tris-EDTA在65°C下水浴15min溶解DNA。
[0030] 优选地，所述醋酸钠溶液的pH值为5. 0?5. 5。
[0031] 优选地，所述洗涤缓冲液含有70?76v/v%的乙醇和8?12mmol/L的醋酸铵，溶 剂为水。
[0032] 试验结果表明，与现有技术相比，本方法提取出的DNA溶液澄清透亮，提取纯化效 率高，得到的DNA浓度高、纯度好，并具较好的完整性。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1 :实施例1中红葡萄酒VvNCED基因实时荧光PCR检测结果；
[0034] 图2 :实施例2中白葡萄酒VvNCED基因实时荧光PCR检测结果；
[0035] 图3 :实施例1中红葡萄酒VrZAG62微卫星位点分析的结果图；
[0036] 图4 :实施例1中红葡萄酒MMD7微卫星位点分析的结果图；
[0037] 图5 :实施例2中白葡萄酒VrZAG62微卫星位点分析的结果图；
[0038] 图6:实施例2中白葡萄酒MMD7微卫星位点分析的结果图；
[0039] 图7 :5种方法提取白葡萄酒VvNCED基因实时荧光PCR检测结果，其中，1-阳性对 照，2-实施例2提取，3?7为方法1-4提取结果（和阴性对照曲线有重叠）；
[0040] 图8 :5种方法提取红葡萄酒VvNCED基因实时荧光PCR检测结果，其中，1-阳性对 照，2-实施例1提取，3?7为方法1-4提取结果（和阴性对照曲线有重叠）。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于以 下实施例。
[0042] 实施例1提取纯化市售红葡萄酒中的DNA
[0043] 1、提取纯化市售红葡萄酒中的DNA
[0044]1)、DNA 富集
[0045] 取30mL葡萄酒于50mL的离心管中，依次分别加入220ii g糖元、0? 5% 3 -巯基乙 醇（V/V)和0. 7倍体积的异丙醇，充分混匀后，置于-75°c冰箱lh，然后移至-18°c沉淀约 12h，使葡萄酒中DNA沉淀，之后在4°C条件下7, 000g离心40min，收集沉淀。
[0046] 2)多糖的去除
[0047] 向步骤1)获得的沉淀中加入0. 8mL预冷的去多糖缓冲液[80mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，6m mol/L EDTA-Na2,0.25mmol/L NaCl，1.5% (w/v)PVP-40T]，用移液抢 吹打将离心管壁上的沉淀全部冲洗下来后，尽量全部转移至2mL离心管中，冰浴5min，期间 颠倒混匀1次。
[0048] 将2mL离心管在4°C 13, 000g离心5min，弃上清。
[0049] 在50mL离心管中再次加入0. 5mL预冷的去多糖缓冲液，用移液抢吹打再次将离心 管中的沉淀全部转移至2mL离心管中，用移液抢吹打混匀后冰浴5min，期间颠倒混匀1?2 次。
[0050] 将2mL离心管在4°C 13, 000g离心5min，弃上清。
[0051] 3)DNA 粗提
[0052] 加入65°C预热的 700ii L粗提缓冲液[18mmol/L EDTA，8mmol/L Tris-HCl pH 8. 0， 1.2mol/L NaCl 和 1.8% (w/v)CTAB，并在使用前加入 0.8% (v/v)巯基乙醇，1.8% (w/v) PVP-40T，蛋白酶K(18mg/mL)]，涡旋振荡混匀，于55°C水浴40min，期间颠倒混匀3次。在 4°C 12, 000g离心lOmin，将上清液转移至另一洁净的2mL离心管。
[0053] 4) DNA 纯化
[0054] 加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)，涡旋震荡混匀后，在4°C条件下13, 000g 离心8min。
[0055] 吸取上清液至另一新的1. 5mL离心管，加入5 ii L RNase A(10mg/mL)于37°C酶解 30min〇
[0056] 加入等体积氯仿：异戊醇（24 :1)涡旋震荡混匀后，在4°C条件下13, 000g离心 8min，取上清。
[0057] 5)DNA 回收
[0058] 加入0? 1倍体积醋酸钠（3mol/L, pH = 5)，5 ii g糖元和0? 6倍体积的异丙醇， 于-20°C过夜沉淀DNA约24h。
[0059] 在4°C条件下13, 000g离心5min，收集DNA沉淀，弃上清，用洗涤缓冲液（76%乙醇 和12mmol/L醋酸铵）洗漆沉淀，并在4°C条件下13, 000g离心2min。
[0060] 收集沉淀，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，并在4°C条件下13,000g离心2min。
[0061] 风干或用核酸真空干燥仪烘干乙醇，加入50iiL TE，65°C水浴15min充分溶解 DNA。
[0062] 实施例2提取纯化市售白葡萄酒中的DNA
[0063] 1、提取纯化市售白葡萄酒中的DNA
[0064] 1)、DNA 富集
[0065] 取20mL葡萄酒于50mL的离心管中，依次分别加入180iig糖元、1.2% 巯基乙 醇（V/V)和1倍体积的异丙醇，充分混匀后，置于-65°C冰箱1. 5h，然后移至-20°C过夜（约 24h)，使葡萄酒中DNA沉淀，之后在4°C条件下6, 000g离心30min，收集沉淀。
[0066] 2)多糖的去除
[0067] 向步骤1)获得的沉淀中加入lmL预冷的去多糖缓冲液[120mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，4mmol/L EDTA-Na2,0.2mmol/L NaCl，2.5% (w/v)PVP-40T)]，用移液抢吹 打将离心管壁上的沉淀全部冲洗下来后，尽量全部转移至2mL离心管中，冰浴8min，期间颠 倒混匀1次。
[0068] 将2mL离心管在4°C 12000g离心8min，弃上清。
[0069] 在50mL离心管中再次加入0. 8mL预冷的去多糖缓冲液，用移液抢吹打再次将离心 管中的沉淀全部转移至2mL离心管中，用移液抢吹打混匀后冰浴8min，期间颠倒混匀1?2 次。
[0070] 将2mL离心管在4°C 12000g离心8min，弃上清。
[0071] 3)DNA 粗提
[0072] 加入 55°C 预热的 800ii L 粗提缓冲液[22mmol/L EDTA, 12mmol/L Tris-HCl pH 8. 0, 1. 6mol/L NaCl 和 2. 2% (w/v)CTAB，并在使用前加入 1. 2% (v/v)巯基乙醇，2. 2% (w/ v) PVP-40T，蛋白酶K (22mg/mL)]，涡旋振荡混匀，于65 °C水浴30min，期间颠倒混匀3?4 次。在4°C 12, 000g离心lOmin，将上清液转移至另一洁净的2mL离心管。
[0073] 4) DNA 纯化
[0074] 加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)，涡旋震荡混匀后，在4°C条件下12000g 离心lOmin。
[0075] 吸取上清液至另一新的1. 5mL离心管，加入8 ii L RNase A(10mg/mL)于37°C酶解 20min〇
[0076] 加入等体积氯仿：异戊醇（24 :1)涡旋震荡混匀后，在4°C条件下12000g离心 10min，取上清。
[0077] 5)DNA 回收
[0078] 加入0? 1倍体积醋酸钠（5mol/L, pH5. 5)，8 ii g糖元和0? 6倍体积的异丙醇， 于-18°C沉淀DNA约12h。
[0079] 在4°C条件下12000离心8min，收集DNA沉淀，弃上清，用洗涤缓冲液（70%乙醇和 8mmol/L醋酸铵）洗漆沉淀，并在4°C条件下13, 000离心2min。
[0080] 收集沉淀，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，并在4°C条件下12,000g离心2min。
[0081] 风干或用核酸真空干燥仪烘干乙醇，加入50iiL TE(Tris-EDTA)，65°C^Km25min 充分溶解DNA。
[0082] 实施例3 (对实施例1、2的提取结果进行检测）
[0083] 3.1、DNA 浓度检测
[0084] 用NAN0DR0P1000对从葡萄酒中提取出的DNA进行浓度测定，结果如下表1所示：
[0085] 表1 DNA提取结果
[0086]
【权利要求】
1. 一种从葡萄酒中提取葡萄基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤， 1. DNA富集：向20?30mL葡萄酒中加入180?220ii g糖元、0? 5?1. 2v/v%的￠-巯 基乙醇和0. 7?1倍体积的异丙醇，混匀后，置于-65°C?-75°C冰箱中1?1. 5h，然后移 至-18°C?-20°C沉淀12h?24h，使葡萄酒中的DNA沉淀，之后离心，收集沉淀； 2) 多糖的去除：向步骤1)获得的沉淀中加入0. 8?lmL去多糖缓冲液，冰浴、混勻、离 心、弃上清，向其中再次加入去多糖缓冲液，冰浴、混匀、离心、弃上清； 3. DNA粗提：向其中加入55?65°C预热的700?800 ii L粗提缓冲液，混匀，于55? 65°C水浴30?40min，期间颠倒混匀3?4次，然后离心，收集上清液； 4. DNA纯化：向步骤3)获得的上清液中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，混 匀后离心，收集上清液，向上清液中加入RNase A溶液进行酶解，然后加入等体积的氯仿/ 异戊醇混合液，混匀后离心，取上清； 5. DNA回收，获得葡萄基因组DNA。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，在DNA富集沉淀后，溶液在4°C 条件下6, 000g?7, 000g离心30min?40min，收集沉淀。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的去多糖缓冲液溶剂 是水，溶质是如下终浓度的物质：80?120mmol/L pH值为8. 0的Tris_HCl、4?6mmol/L EDTA-Na2、0. 20 ?0? 25mmol/L NaCl 和质量体积比为 1. 5 ?2. 5%的 PVP-40T。
4. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，多糖去除的具体步骤 如下： a) 首先向装有上述DNA沉淀的50mL离心管中加入0. 8mL?lmL预冷的去多糖缓冲液， 将离心管壁上的沉淀全部冲洗下来，将沉淀全部转移至2mL离心管中，冰浴5?8min，期间 颠倒混匀1次； b) 将冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g离心5?8min，弃上清； c) 在50mL离心管中再次加入0. 5?0. 8mL预冷的去多糖缓冲液，将沉淀全部转移至 步骤a)中所述2mL离心管中，吹打混匀沉淀和溶液后冰浴5?8min，期间颠倒混匀1?2 次； d) 冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g离心5?8min，弃上清。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的粗提缓冲液溶剂是水， 溶质是如下终浓度的物质：18?22mmol/L EDTA、8?12mmol/L pH值为8. 0的Tris-HCl、 1. 2 ?1. 6mol/L NaCl、l. 8 ?2. 2w/v% CTAB、0. 8 ?1. 2v/v%巯基乙醇、1. 8 ?2. 2w/v% PVP-40T、18 ?22mg/mL 蛋白酶 K。
6. 根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，离心的条件为：在 4°C 12, 000g ?13000g 离心 8 ?10min。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的DNA纯化按照如下步骤 进行： a) 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，涡旋震荡混匀后，在4 °C条件下 12, 000g?13000g离心8?10min，所述苯酚/氯仿/异戊醇混合液中，苯酚、氯仿和异戊 醇的体积比为25 :24 :1 ; b) 吸取上清液至另一新的1. 5mL离心管，加入5?8 y L浓度为10mg/mL的RNase A于 37°C酶解20?30min，所述RNase A的浓度为lOmg/mL ; c)加入等体积的氯仿/异戊醇混合液涡旋震荡混匀后，在4°C条件下12, OOOg? 13000g离心8?lOmin，取上清，所述氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24 : 1〇
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述的DNA回收按照如下步骤 进行： a) 向步骤4)获得的上清液中加入0. 1倍体积的摩尔浓度为3?5mol/L的醋酸钠溶 液、5?8 y g糖元和0. 6倍体积的异丙醇，于-18°C?_20°C沉淀DNA 12?24h ; b) 在4°C条件下12, 000g?13000离心5?8min，收集DNA沉淀，弃上清，用洗漆缓冲 液洗涤沉淀，之后在4°C条件下13, 000g离心2min，收集沉淀； c) 用75v/v%的乙醇洗漆沉淀，然后在4°C条件下12, 000?13, 000g离心2min、挥去 乙醇，加入50 ii L Tris-EDTA在65°C下水浴15min溶解DNA。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述醋酸钠溶液的pH值为5. 0?5. 5。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液含有70?76v/v% 的乙醇和8?12mmol/L的醋酸铵，溶剂为水。
【文档编号】C12Q1/68GK104450683SQ201410810893
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】刘津, 高苏娟, 刘青, 卢丽, 张隽, 陈源树, 李婷, 顾瑜娟, 何日荣, 高东微 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 仲恺农业工程学院