一种适于茄果类主要蔬菜的高效、快速dna提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种改良DNA提取缓冲液及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] DNA是储存遗传信息的载体。在生物学的研究中，获得高质量的DNA尤为重要。现 在已经发表的植物基因组DNA提取方法已有多种。目前，研究者最常用的方法为CTAB法、 试剂盒法和SDS法。但CTAB法、试剂盒法和SDS法在进行植物基因组DNA提取的过程中有 步骤多、操作繁琐、耗时、使用高毒试剂等缺点。在需要获得大量DNA样品的实验中，DNA的 提取就成了难题。
[000引因此，一种高效、快捷、低成本、较无害的DNA提取方法对于需要大量提取植物DNA进行研究的研究者来说，就显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种改良DNA提取缓 冲液及其制备与应用。
[0005] 为了实现上述目的化及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种改良DNA提取缓冲液，每1000ml所述DNA提取缓 冲液中，含有焦亚硫酸钢10~30邑。
[0007] 优选地，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有焦亚硫酸钢10~20g。更优选， 20邑。
[0008] 进一步优选地，每1000ml所述DNA提取缓冲液中还含有Tris-肥1 200mmol、 化C1250mmol、邸ΤΑ25mmol、SDS5g。
[0009] 优选地，所述DNA提取缓冲液的溶剂为水。所述化is-肥1的抑为7. 5。
[0010] 本发明的第二方面，提供了前述改良DNA提取缓冲液的制备方法，亦即将各组分 按配比混合即可。 W11] 本发明的第Ξ方面，提供了前述改良DNA提取缓冲液在植物DNA提取中的用途。
[0012] 本发明的第四方面，提供一种植物DNA提取方法，所述方法采用前述改良DNA提取 缓冲液来提取植物DNA。
[0013] 优选地，所述方法，包括如下步骤：
[0014] 妨将新鲜的植物组织洗净、吸干，加入改良DNA提取缓冲液，研磨；
[0015] (6)将步骤（1)中研磨获得的样品水浴，加冰醋酸钟，震荡摇匀，离屯、，保留上清 液；
[0016] (7)在步骤（2)获得的上清液中加入异丙醇，离屯、，取沉淀；
[0017] (8)在步骤（3)获得的沉淀中加入乙醇，放置足够时间，将乙醇倒出，加入适量TE 或(1地2〇溶解，保存即可。
[0018] 优选地，步骤（1)中，所述植物组织为植物的叶子。
[0019] 优选地，步骤（1)中，所述植物选自茄果类。更优选地，所述植物选自番茄、黄瓜、 茄子之任一。
[0020] 优选地，步骤（1)中，每0. 07-0.Ig植物组织添加1ml的改良DNA提取缓冲液。
[0021] 优选地，步骤（1)中，每1000ml所述改良DNA提取缓冲液中含有焦亚硫酸钢10~ 30邑。
[0022] 更优选地，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有焦亚硫酸钢20邑。
[0023] 进一步优选地，每1000ml所述DNA提取缓冲液中还含有Tris-肥1 200mmol、 化C1250mmol、邸ΤΑ25mmol、SDS5g。
[0024] 优选地，所述Tris-肥1的抑为7. 5。
[0025] 优选地，步骤（4)中，采用70 %乙醇。
[0026]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0027] 茄果类植物DNA提取中由于褐色多酪类化合物的存在易出现变色现象，为避免运 种褐化影响后续的实验结果，本发明所采用的改良后的SDS法在提取缓冲液中加入1-3% (W/V)的焦亚硫酸钢，W助于除去多酪类杂质。同时，在提取DNA的过程中，本发明的改良 法较传统SDS法省去了加入等体积氯仿：异戊醇（24 :1)运一步骤，仅留下加入等体积异丙 醇运一步骤，W保证DNA析出。传统SDS法中加氯仿：异戊醇（24:1)，主要目的是提苯酪、 快速分层、去气泡，但改良法在提取液内加入1-3% (W/V)的焦亚硫酸钢时就已经起到了去 多酪杂质的作用。同时，改良法省去加入等体积氯仿：异戊醇（24:1)运一步骤，不但避免 了人体接触氯仿和异戊醇运种剧毒试剂，也节约了时间和耗材。经后续实验证明此改良法 的DNA提取获得率是其他传统方法的二到Ξ倍，并且仅需其他传统方法的Ξ分之一到Ξ分 之二时长即可，获得的DNA质量完全能满足PCR的需求。
【附图说明】 阳02引 图1 种方法提取DNA所用时间比较（min)。
[0029] 图2 :不同提取方法获得的DNA在琼脂糖上的检测结果，其中，Μ:化2000marker; 1-5:CTAB法提取的DM;6-10 :试剂盒法提取的DM; 11-15 :本发明改良SDS法提取的DM。
[0030] 图3 :利用SSR标记进行番茄杂交种纯度检测的结果图。
[00川图4:利用SSR标记进行茄子杂交种纯度检测的结果图。 阳0巧图5:利用SSR标记进行黄瓜杂交种纯度检测的结果图。 阳03引图6 :W番茄为模板，采用本发明改良SDS法，W1% (W/V)焦亚硫酸钢的SDS提取 缓冲液W及3 % (W/V)焦亚硫酸钢的SDS提取缓冲液提取DNA，每个方法有5组平行样品， 得到的DNA溶液在1. 2 %的琼脂糖凝胶上进行电泳所得结果分别如左列1-5和右列6-10两 组所示，DNA条带清晰，DNA质量符合要求，Μ:DL2000marker。
【具体实施方式】
[0034] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0035]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0036]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。运些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor L油oratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons，化w York,1987and periodic updates ;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ;METH0DS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds. )，Academic Press，San Diego， 1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, C虹omatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press, Totowa，1999等。
[0037]下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如样品水浴、 DNA用70%的乙醇洗涂、DNA用TE溶解并保存、琼脂糖电泳等过程。 阳0測实施例1
[0039] W番茄为模板，用CTAB法（方法一）、试剂盒法（方法二）和本发明改良SDS法 (方法Ξ )分别提取5份样本的DNA。 W40]其中，CTAB提取方法（方法一）所用到的化学试剂包括：
[0041] 氯仿：异戊醇（24:1);异丙醇；75%乙醇；口'48;化(：1;邸了4-胞2.2&0;化13;冰 乙酸；棚酸；0 -琉基乙醇；NaAc;氯仿（立氯甲烧）；异戊醇；无水乙醇；漠酪蓝鴻脂糖； 薦糖；漠化乙锭巧B) ;RNase、化0H;肥1 (浓）；d地2〇 ;提取缓冲液0). 35MGlucose、Tris. 肥1、Na.邸TA、2%PVP、1 % (V/V)β-Me、d地20)(冰浴）【用前加β-琉基乙醇】、裂解缓冲 液65。(：（水浴）（1.41胞(：1、0.11化13.肥1、2〇1111胞.邸了八、2%押八8、2%?￥口、1%(￥/￥) β-Me、d地20)。
[0042]具体实验方法包括如下步骤：
[0043] (1)取lOOmg鲜嫩的叶子，放入研鉢中加入液氮进行研磨，直至粉碎；转移到2血 的离屯、管中； W44] 0)向阳管中加入800μL的提取缓冲液（使用前先冰浴lOmin并用震荡机混 匀）；离屯、4°C，10000r，15min;
[0045] (3)弃上清液，加入800μL裂解缓冲液；牙签揽拌混匀；65°C水浴30-40min，同时 每lOmin充分摇匀一次；
[0046] (4)加入等体积氯仿异戊醇（24 :l)800uL;颠倒摇匀50次；离屯、4°C，lOOOOr， 15min;吸上清液转移至1. 5血的离屯、管中；加入异丙醇化00yL，至少30min);沉淀析出， 静置；离屯、4°C，lOOOOr，lOmin;倒掉离屯、管中的溶液；
[0047]妨加75%乙醇，洗涂3min;倒出乙醇；通风楓中风干； W4引 （6)加入100μLTE溶解稀释。4°C保存。 W例其中，试剂盒提取方法（方法二）所用到的试剂包括：
[0050]Ezup柱式植物基因组DNA试剂盒（上海生物工程有限公司）：纯化套件（吸附柱+ 收集管），BufferPC