一种粉果番茄材料的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，设及一种利用CRISPR/ 化s9系统进行的粉果番茄材料的制备方法。
【背景技术】
[0002] 番茄是世界范围内广泛种植的最主要蔬菜作物之一。果实颜色是番茄的重要经济 性状，不同地区的消费者对番茄果实颜色的喜好不同。在欧洲和北美洲，消费者比较喜欢红 果番茄，而亚洲的消费者比较喜欢粉果番茄。过去几十年的番茄商业育种主要集中在对红 果番茄的改良，优良的粉果番茄相对较少。目前，中国的育种家多集中在培育具有红果背景 的粉果资源，适应消费者的需求。
[0003] 红果和粉果番茄的差异主要是由果皮中的黄酬类物质决定的。在红果番茄的果皮 中，黄酬类色素的积累量比较多，使得果皮为黄色，果实呈现红色。但是，粉果番茄的果皮中 并无黄酬类物质的存在，因而果皮为透明状，果实呈现粉色。番茄果皮中黄酬类物质的积累 主要是由转录因子S1MYB12所调控的，红果对粉果呈显性，因而可W通过对S1MYB12基因进 行基因组编辑改变果实的颜色。
[0004] 通过传统回交的方法将一个优良红果番茄自交系改造成粉果番茄自交系需要至 少3 - 4年的时间，包括一次杂交、至少5次回交和1次自交，既费时又费工。通过最新的基 因组编辑技术可W将该过程缩短至1年W内。基因组编辑技术（genomeediting)是一种 可W在基因组水平上对DM序列进行改造的遗传操作技术。CRISPR/tas9系统（clustered regularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/Cas9endonuclease)是目前最热口 的基因组编辑工具之一。该技术的工作原理是核酸酶化s9蛋白在向导RNA(skxrtguide RNA，sgRNA)的引导下，对目的基因进行切割，导致DM双链断裂，双链断裂DM在修复时会 引入碱基的插入、替换、缺失等变异，从而实现目的基因的定点突变。相比TALEN、ZFN等其 他基因编辑手段，CRISPR/tas9系统操作简单，成本低。在过去两年内，CRISPR/tas9技术因 其独特的优势得W快速发展，目前该技术已经在细菌、动物、人类和植物中取得成功。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种粉果番茄材料的制备方法，W克服现有技术制备粉果番 茄周期长不足。
[0006] 本发明首先对控制番茄果皮的转录因子S1MYB12进行序列分析，查找PAM序列， 即5 '-NGG-3'的序列（N代表A、T、C、G任一种核巧酸），将NGG之前19bp的序列定义为 SgRNA。WSgRNA作为查询序列，在番茄参考基因组中进行BLAST,确定特异匹配的SgRNA序 列。经过筛选多个SgRNA，发现在S1MYB12基因第3外显子上一个SgRNA祀向S1MYB12基因 具有高特异性。
[0007] 本发明提供了S1MYB12基因第3外显子在制备粉果番茄材料中的用途，所述 S1MYB12基因第3外显子的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本发明提供了特异性祀向S1MYB12基因第3外显子的sgRNA，其特征在于，其DM 序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 含有本发明上述sgRNA的DM序列的CRISPR/tas9载体也属于本发明的保护范 围。
[0010] 本发明提供了上述含有DNA序列如SEQ ID NO. 2所示的sgRNA的CRISPR/tas9载 体在制备粉果番茄材料中的应用。
[0011] 本发明提供了上述含有DNA序列如SEQ ID NO. 2所示的sgRNA的CRISPR/tas9载 体在作物改良育种中的应用。
[001引本发明提供了上述含有DNA序列如SEQ ID NO. 2所示的sgRNA的CRISPR/tas9载 体在番茄改良育种中的应用。
[0013] 本发明还提供了一种粉果番茄材料的制备方法，包括W下步骤：
[0014] (1)利用农杆菌侵染法将上述含有DNA序列如SEQ ID NO. 2所示的sgRNA的 CRISPR/tas9载体转化到红果番茄中，获得TO代转基因番茄植株；
[0015] (2)将S1MYB12基因序列发生突变的TO代植株自交获得T1代植株；
[0016] (3)从T1代中筛选不含有外源转基因成份但是S1MYB12基因发生纯合突变且果实 为粉色的植株即得粉果番茄材料。
[0017] 步骤（1)所述的红果番茄为果实为红色的纯合自交系材料。
[001引步骤做的筛选方法为；步骤做的筛选方法为：利用PCR扩增S1MYB12基 因的特异片段，片段大小为879bp，正向引物；ACCAAGCGATGAGAAGTTACC ;反向引物； AATCTCCTCGAGTCTTGGCC，然后对PCR产物进行测序，将测序结果与野生型S1MYB12基因进行 序列比对，检测在SgRNA的位置是否有碱基突变，如果有碱基突变，意味着成功对S1MYB12 进行了编辑。
[0019] 步骤（3)所述的外源转基因成份是指化s9外源蛋白。
[0020] 本发明利用CRISPR/tas9基因组编辑技术对控制果实颜色的转录因子S1MYB12进 行了编辑，造成了该转录因子发生了移码突变，果实颜色由红色变为粉色。本发明提供的特 异度高的SgRNA祀向性强，可用于制备粉果番茄，应用于番茄改良育种。本发明制备粉果番 茄材料的方法简单易行，一年之内即可获得目的基因发生改变的植株。虽然创制新材料的 过程中应用到了转基因，但是终产品并不含外源转基因成份，使制得的粉果番茄材料安全 无风险。
【附图说明】
[0021] 图1是TO代转基因植株的基因型，与野生型相比，植株3含有一个突变型，在 SgRNA的位置发生突变。
[00巧图2是野生型番茄（红色）与S1MYB12基因突变型（粉色）番茄表型，其中A为 野生型红果，B为突变型粉果。
【具体实施方式】
[0023] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0024] 实施例1含特异sgRNA的CRISPR/化s9载体的构建
[0025] 对控制番茄果皮的转录因子S1MYB12进行序列分析，查找含PAM序列，即 5'-NGG-3'的序列（N代表A、T、C、G任一种核巧酸），将NGG之前19bp的序列定义为sgRNA。 WsgRNA作为查询序列，在番茄参考基因组中进行BLAST,获得一个特异匹配的sgRNA序列， 其DNA序列如SEQIDNO. 2所示，位于该基因的第S个外显子（如SEQIDNO. 1所示）上。
[0026] 体外合成sgRNA序列，通过In化Sion酶连接到CRISPR/tas9载体上，构建重组载 体，并将重组载体转化到农杆菌GV3101菌株中。
[0027] 实施例2粉果番茄材料的制备与鉴定
[002引利用农杆菌侵染法将实施例1制得的载体转化到红果番茄Moneymaker的子叶中， 通过再生获得TO代转基因番茄植株。
[0029] 对TO代植株进行检测，分析再生植株中S1MYB12基因序列，获得1株S1MYB12基 因发生改变的转基因植株，命名为植株3。植株3为纯合突变（图1)。将该植株种植于温 室，果实成熟时观察果实颜色，植株3的果实变为粉色（图2)。然后，将TO代植株进行自 交，获得了T1代的种子。为了在T1代中获得不含外源转基因片段的个体，通过PCR方法扩 增T1 代植株中的CRISPR/Cas9 载体序列（正向引物；CCGGGGATCCTCTAGAAGCTTCGTTGAACAA CGG;反向引物；CGTCGGGCCCTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGG。反应程序；94°C预变性 3 分钟； 94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，35个循环；72°C延伸5分钟。结果发现， 本实施例植株3的T1代植株中1/4的植株（12/50)不含外源转基因化s9片段。
[0030] 之后，检测S1MYB12的突变是否稳定遗传到不含外源转基因成份的T1植株 中。采用PCR扩增S1MYB12基因片段，正向引物；ACCAAGCGATGAGAAGTTACC;反向引物； AATCTCCTCGAGTCTTGGCC，扩增片段大小为879bp。然后对PCR产物进行测序，将测序结果 与野生型S1MYB12基因进行序列比对，检测在sgRNA的位置存在碱基突变（见图1)，说明 CRISPR/tas9产生的突变可W从TO代稳定地遗传到T1代。不含外源转基因成份且S1MYB12 发生纯合突变地T1代植株即为新的粉果番茄材料。
[0031] 本发明方法中，从构建CRISPR/化s9载体，将其转化到红果番茄Moneymaker的子 叶中，再生获得TO代转基因番茄植株该段过程需要6个月，TO代植株进行自交，获得了T1 代的种子所需时间为4个月，对T1代进行筛选需时为1个月，完成整个过程需11个月，即 1年W内完成了粉果番茄新材料的创制，大大缩短了改良过程。
[0032] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，该对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的该些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. S1MYB12基因第3外显子在制备粉果番茄材料中的用途，所述S1MYB12基因第3外显 子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 特异性靶向S1MYB12基因第3外显子的sgRNA，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO. 2所示。3. 含有权利要求2所述SgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9载体。4. 权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体在制备粉果番茄材料中的应用。5. 权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体在作物改良育种中的应用。6. 权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体在番茄改良育种中的应用。7. -种粉果番茄材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 利用农杆菌侵染法将权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体转化到红果番茄中，获得 TO代转基因番茄植株； (2) 将TO代植株自交获得Tl代植株； (3) 从Tl代中筛选不含有外源转基因成份但是S1MYB12基因发生纯合突变且果实为粉 色的植株即得粉果番茄材料。8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述的红果番茄为果实为红色 的纯合自交系材料。9. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)的筛选方法为：利用PCR扩 增S1MYB12基因的特异片段，片段大小为879bp，正向引物：ACCAAGCGATGAGAAGTTACC ;反向 引物：AATCTCCTCGAGTCTTGGCC，然后对PCR产物进行测序，将测序结果与野生型S1MYB12基 因进行序列比对，检测在sgRNA的位置是否有碱基突变，如果有碱基突变，意味着成功对 S1MYB12进行了编辑。
【专利摘要】本发明提供了一种粉果番茄材料的制备方法，属于植物基因工程领域。本发明方法包括以下步骤：(1)对控制番茄果皮的转录因子SlMYB12进行序列分析，确定特异的sgRNA序列；(2)构建含有sgRNA和Cas9蛋白的表达载体；(3)利用农杆菌侵染法将重组载体转化到红果番茄中，获得T0代转基因番茄植株；(4)将SlMYB12基因序列发生突变的T0代植株种植于温室，自交获得T1代植株，从T1代中筛选不含有外源转基因成份但是SlMYB12基因发生纯合突变且果实为粉色的植株，即粉果番茄材料。本发明方法成本低，缩短制备周期，一年之内即可获得粉果番茄材料，且该粉果番茄不含有外源基因，安全无风险。
【IPC分类】C12N15/29, C12Q1/68, A01H5/00, C12N15/82, C12N15/113, C12N15/84
【公开号】CN104988160
【申请号】CN201510463523
【发明人】黄三文, 张春芝, 宋晓燕, 伦尧尧
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月31日