一种植物根特异性启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物根特异基因启动子及其应用，尤其设及来源于大麦根特异表达基 因HVTIP2 ;1上游序列的根特异性启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是位于基因转录启始位点上游的一段DNA分子，控制基因在特定组织、发 育阶段W及环境条件下表达。作为基因工程的关键性调控元件，启动子决定外源基因的表 达方式和转录效率，在转基因动植物新品种培育和转基因生物反应器研发领域发挥重要的 作用。
[0003] 按照基因表达的方式，通常将植物启动子分为组成型启动子、组织特异性启动 子和诱导型启动子=大类[王关林，方宏赞，2002,植物基因工程原理与技术（第二版）， 北京，科学技术出版社]。目前植物基因工程中常用的启动子是组成型表达启动子，外源 基因在植株全方位的高效表达会大量消耗植株体内的基础物质，对转基因植株的其它代 谢活动W及正常生长发育带来不利影响。组织特异性启动子驱动的基因表达仅限于某 些特定器官或组织部位，避免了植物营养与能量的不必要浪费，又能满足在特定组织器 官大量表达外源基因的需要[宋扬，周军会，张永强.植物组织特异性启动子研究，生物 技术通报，2007 (6) : 21-24]。该类启动子除了具有一般的启动子结构如TATA盒和CAAT 盒外，同时还存在几种控制组织特异性表达的元件[YamamotoYT,h^orCG,AcedoGN etal.Characterizationofcis-actingsequencesregulatingroot-specificgene expressionintobacco,ThePlantCell, 1991,3:371-382.]。已有研究报道在植物的维 管束、薄壁组织、花粉、种子和胚乳组织中驱动基因特异表达的启动子。
[0004] 植物的根具有吸收水分和无机盐、固定植物，并在干旱、盐碱和重金属±壤条件下 保护植物地上部分，对于植物的生长发育具有重要的生物学意义。此外，根还是某些物种 重要的营养物质储存器官。组织特异表达基因是克隆组织特异性启动子的重要资源，基于 基因巧片数据的基因差异表达生物信息学方法为快速鉴定组织特异性基因提供了强有力 工具（YangXL,XuHL,LiWH,etal.Screeningandidentificationofseed-specific genesusingdigitaldifferentialdisplaytoolscombinedwithmicroarraydata fromcommonwheat,BMCgenomics, 12:513-514.)。利用拟南芥根特异表达基因AtW服Y6 的启动子驱动细胞分裂素降解基因（CK幻在烟草和拟南芥根中特异性表达，使根系生 物量增加60%，提高了植株抗干旱和抗重金属胁迫的能力[了0m&§W，化化aN，Ireen K.Root-specificreductionofcytokinincausesenhancedrootgrowth,drought tolerance,andleafmineralenrichmentinArabidopsisandtobacco，Plant Cell, 2010, 22(12):3905-3920.]。
[0005] 已报道的根特异性表达启动子主要源自拟兰芥、烟草等模式植物，利用农作物源 的根特异性启动子不仅有助于阐明根发育相关的基础理论问题，更可W有针对性地调节目 的基因表达、改善植物的品质、产量和抗病（逆）能力，因而成为农作物性状改良与新品种 培育的强有力工具，具有广泛的应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种农作物源的根特异性启动子及其应用。
[0007]本发明所提供的植物根特异性启动子，来源于大麦化ordeumvulgare)，是至少含 有自序列表中序列1的5'端第745-1258位核巧酸序列的按照序列1的核巧酸排列方式 向3'端延长，长度为514至1258bp的脱氧核巧酸片段。
[0008] 所述启动子，它的核巧酸序列优选为下述序列之一：
[0009] 1)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核巧酸组成的DNA分子；
[0010] 2)由序列表中序列2所示的脱氧核糖核巧酸组成的DNA分子；
[0011] 3)与具有1)-2)中任意所述的序列的核巧酸在严格杂交条件下能够杂交的DNA分 子。
[0012] 所述高严谨条件可为用0. 1XSS阳（或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在65°C下杂 交并洗膜。
[001引 4)与1)或2)限定的DNA序列有90%w上的同源性且能调控目的基因在植物的 根中特异表达的DNA分子。
[0014] 所述启动子克隆方法的步骤如下：
[0015] 1)根据HVTIP2 ;1基因的mRNA转录起始位点上游序列，设计两条上游引物1310F1 和1310巧W及一条共用的下游引物1310R，并在上、下游引物5'端分别引入化ndin和化0 I限制性内切酶位点；
[0016] W大麦基因组DNA为模版，通过PCR方法扩增两条不同长度的启动子片段。
[0017] 所述PCR反应体系为；模板DNA500ng，上、下游引物（lOyM)各lyiaOXPCR Buffer(含Mg") 2y1，dNTP(2. 5mM) 1. 6y1，Ex-TaqDM聚合酶巧U/y1) 0. 2y1，加双蒸水 至 20y1。PCR程序为；98°C5min;94°C30s，55°C30s，72°C90s，35 个循环；72°C延伸lOmin。
[0018] 2)克隆方法进一步包括PCR产物回收和质粒重组，具体为；PCR扩增产物经2%的 琼脂糖凝胶电泳分离，将目的条带的回收产物与PMD19-T载体连接，利用连接产物转化大 肠杆菌感受态细胞，经藍白斑筛选获得阳性克隆。
[0019] 含有上述启动子的表达盒、重组表达载体均属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明的启动子是根特异性表达启动子。利用植物表达载体，将本发明的启动子 序列构建到任何目的基因上游，导入植物细胞，可获得根特异性表达的转基因细胞系及转 基因植株。携带有本发明序列的植物表达载体可通过使用Ti质粒、直接DNA转化、微注射、 农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被 转化的植物宿主既可W是玉米、水稻、小麦等单子叶植物，也可W是大豆、油菜、棉花等双子 叶植物。
[0021] 本发明提供农作物来源的根特异性表达启动子，可应用于培育在植物根中特异表 达目的基因、生物安全性高的转基因植物品种或生物反应器。
【附图说明】
[0022] 图1HVTIP2 ;1基因在不同组织中的差异表达示意图；
[0023]G1-G3:为大麦幼苗的根、茎、叶；G4-G8:成株期大麦的根、茎、叶、花和节间；G8:幼 嫩种子
[0024] 图2植物表达载体pCAM-Hvl310pl、pCAM-Hvl310p2的酶切鉴定示意图；
[00巧]泳道1，3:分别为酶切前的表达载体pCAM-Hvl310pl、pCAM-Hvl310p2
[0026] 泳道2, 4;分别为酶切后的表达载体
[0027] 图3pCAM-Hvl310pl和pCAM-Hvl310p2转基因株系的GUS染色示意图；
[002引每组图片由上到下依次是根、茎、花和叶器官
[0029] 图4pCAM-Hvl310pl和pCAM-Hvl310p2转基因株系的GUS定量测定示意图。
【具体实施方式】
[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用W解释本发明，并不用于限 定本发明。实施例中所用菌株和试剂均为实验室的常规材料。
[0031] 实施例1、本发明的启动子的获得及其功能验证
[0032]l、HvTIP2 ;1启动子全长序列的获得
[0033]本发明利用PLEXdb数据库化ttp://www.plexdb.org/plex.地P?dat油ase= Barley)的BB3基因表达巧片数据和基因数字化差异显示技术，筛选到一个大麦根特异表 达的水孔蛋白基因HVTIP2 ;1，经实时巧光定量RT-PCR分析，证明该基因的转录表达具有根 特异性且受生长发育调控，在成株期中的表达量明显高于苗期。
[0034] 根据大麦全基因组序列预测的HvTIP2 ;1基因（morex_contig_51093为该基因在 大麦基因组上的基因座位号）序列，推测出HVTIP2 ;1的启动子序列，在HVTIP2 ;1基因转录 起始位点上游1258bp位置设计引物：
[00巧]1310F1:5 ' -AAGCTTCGAAGGAAAGGCATTAGAAA-3 '化indlll);反向引物设计在HvTIP2;l基因转录起始位点；1310R:5' -CCATGGTGCGGATGATTACCA