一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，属于植物基因工程领域。
技术背景
[0002]白藜芦醇，其化学名为3，5，4’_三羟基-反-二苯乙烯(3，5，4’_trihydroxysitlbene)，又名苗三酸，是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性，是一种天然的抗氧化剂，可以降低血脂，抑制血小板凝结，抗癌，抗炎，抗辐射，抗衰老，防治心血管疾病等。但自然界中存在的白藜芦醇的含量较少，利用生物技术生产白藜芦醇有望高效生产白藜芦醇。
[0003]为了提高植物材料白藜芦醇的含量，研究者进行了白藜芦醇合成的关键基因RESS遗传转化的研究。G1vinazzo等以35S启动子调控白藜芦醇合酶基因进行番前遗传转化，测定转基因番茄中的抗坏血酸盐与谷胱甘肽还原酶的总体水平，结果表明:转基因植物的抗氧化性较之野生型植物的抗氧化性有了显著的提高。Hilsken等人利用油菜种子特异表达启动子驱动白藜芦醇合酶基因表达，转化油菜，同时，阻断消耗白藜芦醇合酶底物的另一条支路，检测T0代油菜种籽中的Res含量，发现以鲜重计其最高含量为361yg/g，同时还获得到品质改善且保健性提高的油菜种籽。林荣华等以花生中的白藜芦醇合酶基因为目的基因，构建了含目的基因的植物重组表达载体PB6RS，利用电穿孔法将pB6RS质粒直接导入根癌农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导将pB6RS转化烟草(云烟85)，得到了阳性植株。但是目前利用烟草根特异表达启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因在烟草根部特异表达，并产生白藜芦醇的研究未见报道。
[0004]烟草是叶用作物，具有发达的根系，一般根被作为废弃物处理掉，若使烟草根生产白藜芦醇，则可能变废为宝，提高烟草的利用价值。本发明在分别克隆了烟草根特异启动子NtR2和花生AhRESS基因的基础上，以pBI121-GUSA为母体载体，通过酶切连接的方法构建了植物表达载体pBI 121-NtR2-AhRESS，之后转化根癌土壤杆菌C58，以叶盘法遗传转化烟草翠碧一号(CB-1)，获得了转基因烟草植株并对其进行了分子鉴定。提取转基因烟草阳性植株根、茎、叶各组织的RNA，分别进行RT-PCR，结果表明，花生AhRESS基因只在烟草根表达。提取转基因烟草根中的白藜芦醇，进行HPLC分析，发现转基因烟草只在根中合成了花生的白藜芦醇。本发明为利用转基因技术在烟草根大量生产白藜芦醇奠定了良好的技术基础和开发利用前景。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法。目的在于提供利用烟草根特异启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因只在烟草根部表达，以生产白藜芦醇的技术，以便高效利用植物基因工程手段高效生产白藜芦醇。本发明是利用已有的烟草根特异启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS(花生AhRESS基因)，通过根癌农杆菌介导遗传转化烟草生产品种翠碧一号(CB-1)，经PCR鉴定获得了转AhRESS基因烟草，通过RT-PCR技术分别分析转基因烟草的根、茎、叶表明AhRESS只在烟草的根特异表达，不在茎和叶表达，通过HPLC分析各器官的白藜芦醇含量发现花生白藜芦醇只在烟草根部表达。这为利用烟草根系生产白藜芦醇奠定了基础，并可大大提高烟草生产的价值。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，包括以下步骤: 包括以下步骤:
(1)克隆烟草根特异启动子NtR2和花生AhRESS基因；
(2)烟草根特异启动子NtR2驱动花生AhRESS基因表达载体pBI121-NtR2-AhRESS的构建；
(3)pBI121-NtR2-AhRESS经根癌土壤杆菌C58介导转化烟草，获得转基因烟草植株，并对其进行分子鉴定；
(4)对转基因植株进行分子检测，利用HPLC检测根中白藜芦醇的含量。
[0007]所述步骤(1)中烟草根特异启动子NtR2的序列为如SEQ ID No: 1所示。
[0008]所述步骤(1)中花生AhRESS基因的序列如SEQ ID No:2所示。
[0009]所述步骤(2)中烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体的出发载体为PBI121质粒载体，所述的根特异启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体的启动子是烟草根特异性启动子NtR2，所述的烟草根特异性启动子基因NtR2下游包含花生AhRESS基因。
[0010]步骤(2)具体方法包括以下步骤:
1)克隆烟草根特异启动子NtR2，并连接至pMD18-T载体中，得到pMD18_NtR2载体；
2)pBI121-NtR2-GUSA载体构建:将pBI 121载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，从pCAMBIA-1301载体中克隆GUSA基因连接至pBI121载体上，构建pBI121-GUSA;将pBI121-GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR2载体进行酶切反应，将NtR2启动子连接至pB 1121 -GUSA载体中，得到pB 1121 _NtR2_GUSA载体；
3)pBI121-NtR2-AhRESS载体的构建:克隆花生AhRESS基因，并连接到pBI121-NtR2-⑶SA载体中，得到pB 1121 -NtR2-AhRESS载体。
[0011]所述步骤(3)中pBI121-NtR2-AhRESS载体的遗传转化采用根癌土壤杆菌C58介导的叶盘法；用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的DNA进行PCR分子检测；用改良的CTAB法分别提取转基因植株叶片和根RNA，用逆转录试剂盒逆转录后进行RT-PCR，进行目的基因表达模式分析。
[0012]所述步骤(4)中转基因烟草根中白藜芦醇HPLC检测色谱条件为:色谱柱0DS，流动相乙腈:水=25:75，流速1.0 mL/min，检测波长306 nm，柱温25°C，进样量10 yL。
[0013]具体为:
1.烟草根特异启动子NtR2的克隆
利用CTAB法提取烟草叶片基因组DNA，以烟草根特异启动子NtR2特异引物NtR2_ Hindm-promter-F(5’ ACCAAAGCTTGAATATCTTCAGTATATTCGTTGTG 3’)，NtR2_ Xbal-promter-R(5’ ACCATCTAGAGTCTCCTTCTTAATTTTCTATCAAAG 3’)进行PCR扩增，所得到的特异片段即为NtR2启动子。所述烟草根特异启动子NtR2的序列为如SEQ ID No:1所示。
[0014]花生AhRESS基因的克隆
利用CTAB法提取花生叶片基因组DNA，以花生白藜芦醇合酶基因特异引物RS- BamH1-primer-F( 5’ TCGTGGATCCGCC ACCATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC 3’)，RS_Sac1-primer-R(5’ TCCTGAGCT CTTATATGGCCACACTGCGGAGAACG 3’)进行PCR检测。其回收产物即为花生RES基因编码框DNA序列。所述花生AhRESS基因的序列如SEQ ID No:2所示。
[0015]烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI 121-NtR2-AhRESS 的构建
(1)将烟草根特异启动子NtR2连接至pMD18-T载体中，得到pMD18_NtR2载体；
(2 ) pBI 121 -NtR2-GUSA载体构建:利用限制性内切酶BamHI及Sac I对pBI 121质粒载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，利用带有限制性酶切位点的特异引物从pCAMBIA1301载体中克隆GUSA基因，连接至酶切后的pB 1121载体上，得到pB 1121 -GUSA载体;利用限制性内切酶Hindm及Xhol将pBI121-GUSA载体进行酶切，切除35S启动子;将pMD18-NtR2载体利用限制性内切酶Hindm及Xhol进行酶切，获得NtR2启动子，