一种在水稻幼穗特异表达的启动子及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种在水稻幼穗特异表达的启动子及其应用。

背景技术：

在植物生长所需各种大量元素中，氮素是植物生长中需求量最大且起着制约作用的重要元素，是限制植物生长和植物产量的首要因素，同时，氮素也是生态系统中最常见的限制性因子[剧成欣，张耗，王志琴，等．水稻高产和氮肥高效利用研究进展[j]．中国稻米，2013，19：16-21.]。适当增加氮肥施用量是使作物获得高产的主要措施之一，然而氮肥利用率低以及随着人们大量的施用氮肥，造成大量氮素的损失，由于其对大气和水体的排放，对环境带来了一系列令人堪忧的问题，继而对生态平衡造成不同程度的破坏。因而，提高农作物对氮素的吸收和再利用效率，不仅可以为今后的研究提供理论依据，对提高农作物产量和减少生态环境的污染也具有重要意义。

在高等植物中，土壤中的无机氮通过谷氨酰胺合成酶（gs）和谷氨酸合成酶（gogat）转化为有机氮。gs催化nh4⁺与谷氨酸（glu）产生谷氨酰胺（gln）；gogat将gln的酰胺基转移至α-酮戊二酸（2-og），随后产生glu[templesj,vancecp,ganttjs.glutamatesynthaseandnitrogenassimilation[j].trendsinplantscience,1998,3：51-56.]。gln然后用作有机氮化合物如氨基酸，核苷酸和叶绿素的生物合成的氮供体之一，因此，gs酶可能是植物氮代谢关键因素。细胞质gs1在根中的初级氮同化中起重要作用，gs2在通过植物光呼吸释放的nh4⁺再吸收中起重要作用[冯万军,邢国芳,牛旭龙,等.植物谷氨酰胺合成酶研究进展及其应用前景[j].生物工程学报,2015,31：1301-1312.]。

水稻gs1有3个同源基因分别是osgs1.1，osgs1.2和osgs1.3。tabuchi等研究发现在水稻中的osgs1.1在所有器官即根、叶片、叶鞘和小穗中表达，在营养阶段叶片中表达较高。而osgs1.2所有器官均检测到转录产物，幼苗期根系表达量较高[tabuchim,yamayat.assimilationofammoniumionsandreutilizationofnitrogeninrice(oryzasatival.)[j].journalofexperimentalbotany,2007,58：2319-2327.]。osgs1.3的时空表达特异性并不清楚。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种在水稻幼穗特异表达的osgs1.3基因的启动子，该启动子应用于转基因工程中，有良好的应用前景。

本发明的第一方面，提供一种在水稻幼穗特异表达的osgs1.3基因的启动子，其具有：i）seqidno.1所示的核苷酸序列；或ii）seqidno.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。

进一步地，本发明还提供含有上述启动子的载体、含有上述启动子的转基因细胞系以及含有上述启动子的工程菌。

进一步地，所述的表达载体的骨架载体优选为pcambia-1391z载体。

本发明还提供含有上述启动子的转基因株系。

本发明的第二方面，提供水稻幼穗特异表达的osgs1.3基因的启动子在调控下游基因表达中的应用。

本发明的第三方面，提供一种水稻幼穗特异表达的osgs1.3基因的启动子转基因植株的检测试剂盒，通过pcr，以待检转基因水稻生长30天的叶片dna为模板，利用所述引物对扩增，检测osgs1.3基因的启动子的表达，所述引物对为：

检测引物f：gatgttggcgacctcgtatt（seqidno.4），

检测引物r：tcgttatgtttatcggcacttt（seqidno.5），

若扩增出517bp的片段，则转基因植株为阳性植株。

实现本发明的技术如下：

本发明以水稻的成员osgs1.3基因的启动子为对象，首先将构建好的启动子-gus表达载体通过农杆菌介导转化到水稻成熟胚诱导的愈伤组织中，得到转基因植株后鉴定阳性植株，继而得到t1代转基因植株，得到t2代成熟种子。然后在t2代种子生长的不同时期分别进行gus组织化学染色，分别对其植株的根、茎、叶、穗等不同组织进行染色，检测gus表达活性，分析其组织表达特异性。结果发现该启动子是一个在幼穗中特异表达的启动子，能够启动下游基因在水稻的幼穗中特异性表达。将该启动子应用于转基因工程中，可以使其他目的基因的表达产物特异的在穗积累，增加局部表达量。因此，osgs1.3基因的启动子在转基因工程中有良好的应用前景。

本发明发现了osgs1.3基因的启动子能够启动下游基因在水稻的幼穗中特异性表达。将该启动子应用于转基因工程中，可以使其他目的基因的表达产物特异的在穗积累，增加局部表达量，有良好的应用前景。

附图说明

图1启动子-gus表达载体的转基因植株鉴定图。图中m为dna大小指示条带、1泳道为阴性对照，2-5各泳道均为t0代启动子-gus阳性植株检测，其中，泳道2、3、4、5有条带，为阳性植株。

图2转基因植株在根尖和侧根中gus表达活性情况。图中无蓝色，表示gus表达无活性，说明启动子在此部位不表达。

图3转基因植株在叶和茎中gus表达活性情况。图中无蓝色，表示gus表达无活性，说明启动子在此部位不表达。

图4转基因植株在灌浆期不同时期穗中gus表达活性情况。图中的蓝色深，表示gus表达活性高，说明启动子能够启动下游基因在幼穗中表达。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

【实施例1】osgs1.3基因的启动子-gus转基因植株的构建

提取水稻中花11的dna，利用扩增引物f（atgaattcatacctgtcggtagtcacgcta，seqidno:2）和扩增引物r（atccatggggcgactccaactcttcctcctcc，seqidno:3）通过pcr扩增osgs1.3基因的启动子序列后，利用ecori、ncoi酶切位点连入pcambia-1391z载体，构建出启动子-gus表达载体posgs1.3-p1391z，如图1所示。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，通过转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织将启动子-gus表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，通过pcr对t1代转基因植株进行检测。检测引物对为：

检测引物f：gatgttggcgacctcgtatt（seqidno.4），

检测引物r：tcgttatgtttatcggcacttt（seqidno.5），

若扩增出517bp的片段，则转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出株系基因不分离的纯合的转基因植株，如图1中所示。

【实施例2】转基因植株不同部位启动子-gus表达活性的检测

分别在小苗时期和生殖期对t2代纯合转基因植株的不同部位进行gus染色，如图2、3，具体过程如下：

收获鉴定成功的t2代种子后，将其浸泡在水中，并在37℃恒温培养箱中培养。待种子萌发阶段，在露白时期以及种子发芽时期分别进行gus染色。

待种子的芽长到2cm左右，将其播种到96孔板，在温室光照水培，待小苗时期，换用水稻营养液培养。待小苗长到一定15cm左右高度，对小苗的根尖、侧根和叶片进行gus染色。在生殖期，分别在幼穗期和成熟期对t2代植株的茎和穗等不同组织部位进行gus染色。

以上材料浸泡于gus染色液后并置于37℃保温至过夜。然后用75%酒精脱色3次后将其保存于4℃。将用酒精脱色后的材料置于显微镜下观察，蓝色部位为gus活性表达位点。

经过染色发现gus活性在幼穗中较高，如图4。

上述结果表明，该启动子是一个在幼穗中特异表达的启动子，能够启动下游基因在水稻的幼穗中特异性表达。将其应用于转基因工程中，可在水稻生殖生长阶段促进叶片营养物质通过向穗部的再分配，促进种子灌浆结实，也可以使其他目的基因的表达产物特异的在穗积累，增加局部表达量，因此在转基因工程中有良好的应用前景。

sequencelisting

<110>武汉生物工程学院

<120>一种在水稻幼穗特异表达的启动子及其应用

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