一种快速选育高品质直立穗水稻品种的分子标记及其方法与流程

文档序号：11767752阅读：340来源：国知局

本发明涉及的是作物生物育种的技术领域，尤其涉及的是一种快速选育高品质直立穗水稻品种的分子标记及其方法。

背景技术：

水稻是我国最重要的粮食作物，随着人们生活水平的提高，对稻米的需求量越来越大，由于耕地面积的限制，提高水稻单产尤为重要。穗型是影响水稻产量的重要因素之一，改善穗型结构有助于水稻产量的提高。在粳稻育种中，弯穗型品种到直立穗品种的选育是一个重要的转变，早在上个世纪80年代初就已提出培育直立穗粳稻品种的育种模式，直立穗品种有利于光能利用率的提高和光合产物的积累，表现出较高的产量潜力；近年来，育种家选育出大量直立穗品种，并得到大面积的推广应用，为提高水稻总产做出了重要的贡献。

在直立穗品种选育过程中，对直立穗性状的准确鉴定较为关键；直立穗性状易受环境和材料背景的影响，利用传统的方法鉴定可能会造成鉴定结果不准确，且不能准确区分直立穗和半直立穗性状，同时费时费力，因此，如何快速准确地鉴定直立穗性状尤为重要。随着水稻直立穗基因的相继克隆，利用分子标记辅助选择加快了直立穗品种的选育进度。然而，由于一些含有直立穗基因的品种往往伴随着如穗长变短、着粒密度变密、穗粒数减少等不利的产量性状，因此单纯的利用分子标记辅助选择往往不能得到期望的效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速选育高品质直立穗水稻品种的分子标记及其方法，以克服传统直立穗性状鉴定不准确，高品质直立穗品种育种方法费时费力等技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种快速选育高品质直立穗水稻品种的分子标记，所述分子标记为水稻直立穗基因ep2的一等位突变基因，所述水稻直立穗基因ep2的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述等位突变基因为水稻直立穗基因ep2的第6内含子与第7外显子连接处(如seqidno.1所示序列的第2891位点)的单碱基g突变为a，该突变导致ep2基因cdna剪切发生改变，进而形成直立穗的表型，突变后的分子标记的序列如seqidno.2所示；根据内含子和外显子分界线的gu-ag法则，每个内含子的开始两个碱基都是gu(或gt)，最后两个是ag，即，本发明所述的第6内含子与第7外显子连接处的碱基为ag，突变后的碱基为aa。

本发明还提供了利用上述分子标记快速选育高品质直立穗水稻品种的方法，包括以下步骤：

(1)将高产多抗的弯穗型水稻品种作为母本，将含有所述分子标记的直立穗品种作为父本，将母本与父本杂交，得f1代种子；

(2)将f1代种子种植成苗，根据杂种优势表现，去除杂株，选取农艺性状优良的组合，收获f2代种子；

(3)将f2代种子适时播种，单株移栽，在抽穗后30天左右选取表型为直立穗或半直立穗的单株，提取其叶片总dna并进行分子鉴定，选取含有所述分子标记的植株进行单株室内考种，考察穗长、千粒重、结实率和外观品质，保留穗长在17-21厘米，千粒重24-28克，结实率在88％以上，且外观品质优良的单株，得f3代种子；

(4)将f3代种子种植成系谱，继续按照步骤(3)的方法筛选目标品种，获得f4代种子；

(5)重复步骤(3)、(4)，获得fn代种子，即育成了含有所述分子标记且经高产改良的高品质直立穗水稻品种。

进一步地，所述步骤(1)中，高产多抗的弯穗型水稻品种包括：徐稻3号、南粳5055、镇稻14、宁1092、嘉花1号、垦特糯1号，含有所述分子标记的直立穗品种为农院238的突变品种，命名为f190。

进一步地，所述步骤(1)中，含有所述分子标记的直立穗品种的获得方法为辐射诱变方法或基因定点突变方法。

进一步地，所述步骤(3)中，分子鉴定的方法为：以水稻叶片总dna为模板，针对所述分子标记的突变位点设计dcaps标记引物，并作为特异性扩增引物，进行pcr扩增，用限制性内切酶酶切pcr产物，鉴定植株dna基因组中是否含有所述分子标记。

进一步地，所述dcaps标记引物为ep2-dcaps-1，其核苷酸序列如下所示：

seqidno.3：ep2-dcaps-1f：gacaactttttttttttgggtatccg

seqidno.4：ep2-dcaps-1r：atagatttgttgctggatgcacctt；

所述限制性内切酶为hpaii；

所述鉴定方法为：如果酶切条带为189bp，则该水稻植株为不含所述分子标记的纯合体，如果酶切条带为213bp，则该水稻植株为含有所述分子标记的纯合体，如果酶切条带包括189bp和213bp两条特征条带，则该水稻植株为含有所述分子标记的杂合体；

进一步地，所示步骤(5)中，fn代种子为≥f5代种子。

进一步地，所述方法还包括步骤(6)，将fn代种子作为亲本进行加代培养，获得稳定的高品质直立穗水稻品种。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明通过开发水稻直立穗基因ep2等位突变及其dcaps标记引物ep2-dcaps-1，提供了一种快速选育高品质直立穗水稻品种的分子标记及其方法，该标记引物ep2-dcaps-1能够在直立穗供体亲本f190与弯穗亲本之间区分出差异片段，准确快速地导入所需片段，实现直立穗基因ep2的遗传转育；本发明使用的分子标记ep2-dcaps-1是根据ep2基因内部序列设计而成，检测结果准确、可靠，同时该分子标记在f190与多个弯穗亲本之间具有多态性，可广泛应用于不同组合后代的直立穗选育；常规直立穗品种选育易受环境和材料遗传背景的影响，本方法利用分子标记辅助选择结合传统育种方法，目标明确，缩短育种周期，节约成本，有效地提高选择的效率，能够更迅速、更准确地选育出产量潜力高的直立穗品种。

附图说明

图1为利用ep2-dcaps-1标记引物进行单株选择的聚丙烯酰胺电泳结果。其中m为marker，1为含直立穗ep2等位基因的亲本f190，2为弯穗亲本嘉花1号，3-12为亲本190和嘉花1号的后代选择单株；hpaii(-)表示ep2-dcaps-1扩增后未加hpaii内切酶处理，hpaii(+)表示ep2-dcaps-1扩增后加入hpaii内切酶处理。

图2为利用ep2-dcaps-1标记引物进行单株选择的琼脂糖电泳结果。其中m为marker，1为含直立穗ep2等位基因的亲本f190，2为弯穗亲本嘉花1号，3-12为亲本190和嘉花1号的后代选择单株；hpaii(-)表示ep2-dcaps-1扩增后未加hpaii内切酶处理，hpaii(+)表示ep2-dcaps-1扩增后加入hpaii内切酶处理。

图3为培育的高品质直立穗品种与亲本的表型比较结果。其中1为直立穗亲本f190，2为弯穗亲本嘉花1号，3-6为本发明培育的含所述分子标记的后代。

具体实施方式

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品，所涉及的种质资源，如无特别说明，均来源于中国国家种质库。

2、方法

2.1含有所述分子标记的直立穗品种的获得

对农院238进行辐射诱变，发现一个直立穗表型的突变体f190，该突变体与野生型相比株高变矮，穗长和粒型变短，着粒变密，株型较紧凑，单株产量下降不显著。进一步利用图位克隆的方式发现控制该直立穗表型的基因与ep2基因为等位基因，f190中ep2基因在其第6内含子和第7外显子联接出有一单碱基g突变为a，即为含有所述分子标记的直立穗品种，该品种目前由安徽省农业科学院水稻研究所保存，安徽省农业科学院水稻研究所承诺可通过特定方式向公众提供该品种。

含有所述分子标记的直立穗品种还可以通过其他方式获得，比如中科院上海植物逆境生物学研究中心朱健康研究员领导的课题组研发的能对植物基因组定位修饰的crispr-cas技术，该技术可对基因组中的任何位点进行编辑，研究人员定点诱变水稻、拟南芥的多个基因，都获得了较高的突变率，并在第一代获得纯和和嵌合突变体，且呈现出预期的突变表型。

含有所述分子标记的直立穗品种的获得方法不限于上述两种方式，其他能够获得含有所述分子标记的直立穗品种的方法，均属于本发明的保护范围。

2.2引物设计

根据该分子标记的等位突变位点，利用dcaps标记在线设计软件，设计了3对dcaps标记引物，利用这3对dcaps标记引物在f190和其他弯穗亲本之间进行多态性筛选，发现只有ep2-dcaps-1标记引物在f190与徐稻3号、南粳5055、镇稻14、宁1092、嘉花1号、垦特糯1号品种之间存在多态性差异，可利用f190与上述6种品种进行直立穗水稻品种的选育，所述ep2-dcaps-1标记引物的核苷酸序列为：

seqidno.3：ep2-dcaps-1f：gacaactttttttttttgggtatccg

seqidno.4：ep2-dcaps-1r：atagatttgttgctggatgcacctt；

2.3选育高品质直立穗品种

(1)将高产优质的弯穗品种徐稻3号、宁1092、嘉花1号、垦特糯1号分别作母本，含有所述分子标记的直立穗品种f190作父本，2014年正季于合肥配组，分别得f1种子20粒以上。

(2)2014年冬季于海南陵水种植f1杂交种子，去除杂株，分别混收f2代种子。

(3)2015年正季于合肥种植f2代群体2000株以上，在抽穗30天左右选取直立穗或半直立穗单株，编号取样，共选择单株132株；室内利用所述分子标记的ep2-dcaps-1标记引物进行筛选，共检测出含有纯合或杂合分子标记的单株97份；对这97份单株进行室内考种，考察穗长、千粒重、结实率和外观品质，保留穗长在17-21厘米，千粒重24-28克，结实率在88％以上，且外观品质较好的单株，与对照当粳8号比较，筛选出32份符合要求的单株，即f3代种子。

其中，室内利用所述分子标记的ep2-dcaps-1标记引物进行筛选的方法，包括以下步骤：

①利用ctab法提取水稻叶片总dna，以水稻叶片总dna为模板，以如下所示的dcaps标记引物为特异性扩增引物，进行pcr扩增，检测并回收pcr扩增产物；

dcaps标记引物序列：

seqidno.3：ep2-dcaps-1f：gacaactttttttttttgggtatccg

seqidno.4：ep2-dcaps-1r：atagatttgttgctggatgcacctt；

pcr反应体系：

pcr扩增taq聚合酶购自promega公司，反应体系为20ul：模板dna为50-200ng(2-4ul)，前后引物各1ul，10×pcrbuffer2ul，25mmmgcl21.2ul，1mmdntp混合液0.6ul，taq酶0.2ul，加ddh2o补至20ul；

pcr反应条件：

94℃预变性5min；94℃30s，56℃退火30s，72℃30s，34个循环；72℃延伸5min，4℃10min；

②将扩增产物用内切酶hpaii酶切，进一步电泳区分条带；其中：

hpaii内切酶购自neb公司；

酶切反应体系为20ul，包括：pcr产物10ul，hpaii内切酶1ul，10×nebuffer2ul，加ddh2o补至20ul；

酶切反应条件为：37℃15min，4℃保存；

电泳检测方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳，其中，丙烯酰胺凝胶电泳凝胶制备过程较为复杂，但其一次可检测样品量较多；琼脂糖凝胶电泳凝胶制备较为简单，但一次检测样品较少；故当检测样品数大于300时利用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，样品数少于300利用琼脂糖凝胶电泳方法。

电泳检测结果如图1、2所示，其中：pcr扩增产物均为213bp，酶切产物条带为189bp的水稻植株为不含所述分子标记的纯合体，酶切产物条带为213bp的水稻植株为含有所述分子标记的纯合体，酶切产物条带包括189bp和213bp两条特征条带的水稻植株为含有所述分子标记的杂合体。

(4)2015年冬季于海南陵水种植筛选出的32份株系，系谱种植，每小区72株，9株×8行，单株取样，室内利用所述分子标记的ep2-dcaps-1标记引物进行筛选(方法同步骤(3))，每个小区混收含有所述分子标记的单株的种子(每株收50粒种子)，即f4代种子。

(5)2016年正季于合肥种植f4代32份株系，系谱种植，每小区72株，9株×8行，抽穗30天左右田间株系比较淘汰15份株系，剩余株系田间性状观察，最终选择114份农艺性状较好的单株，编号取样；室内利用所述分子标记的ep2-dcaps-1标记引物进行筛选(方法同步骤(3))，共检测出含有纯合或杂合ep2等位基因的单株87份，进一步室内考种(方法同步骤(3))，与对照当粳8号比较，筛选出21份符合要求的单株，其中8份含有纯合ep2等位基因，即f5代种子。

(6)2016年冬季于海南陵水种植筛选的种子，即获得所述高品质直立穗水稻品种，加代获得更稳定的f6代株系，分别混收1斤种子，进行下一步的品比试验，至此，高品质直立穗水稻品种的选育工作完成。

图3为将选育的高品质直立穗水稻品种与亲本f190、弯穗亲本嘉花1号表型比较结果，同时结合品比试验结果发现，本发明选育的水稻品种与亲本f190、嘉花1号相比，单株产量和表型均有明显改善。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

sequencelisting

<110>安徽省农业科学院水稻研究所

<120>一种快速选育高品质直立穗水稻品种的分子标记及其方法

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