一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合的制作方法

本发明属于生物基因领域，尤其涉及一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合。

背景技术：

ephrin为eph受体家族的配体成员，主要表达于细胞表面，ephrin配体有8个成员，根据它们与细胞膜的附着方式，将其分为ephrina和ephrinb两个亚族。其中ephrina亚族有5个成员，即ephrina1-a5。

suo等研究发现，给小鼠喂食高水平的膳食维生素a能增强wnt信号从而激活毛囊干细胞，成年小鼠受伤皮肤过量表达wnt可以增加再生毛囊的数量，而wnt的受体卷曲蛋白1或2的激活能刺激ephrina3的表达。yamada等研究还发现ephrina3在雄激素性脱发患者的毛乳头细胞中的表达量明显下降。ephrina3的表达在出生后6天的小鼠上升，14天时达到高峰，在生长期的晚期突然下降，而在第二个生长期的初期又陡然上升。但总体来说皮肤中ephrina3的表达与毛发周期是相一致。在0.5天的小鼠背部皮肤中，ephrina3表达在表皮和毛钉的毛囊的上皮细胞中。在毛囊发育的静止期到生长期的过渡期(20天)，ephrina3在新发育的次级毛芽中和毛囊的中部表达(例如隆突区)。在第二个生长期，ephrina3在毛基质细胞中高度表达，而在毛乳头中无表达。ephrina3的表达量在毛发的生长期初期陡然升高，生长期中期达到高峰，静止期又突然下降，研究还发现ephrina3蛋白在毛囊发育中呈时空特异性表达，注射ephrina3的新生小鼠皮肤毛囊的分化进程明显加快，而且毛囊的数量也明显增多。因而，ephrina3可以加快毛囊的生长和增加毛囊的密度，表明epha-ephrina信号通路与毛囊发育紧密相关。现在以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录pcr需要电泳检测，准确度不够高。

综上所述，现有技术存在的问题是：现在以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录pcr需要电泳检测，准确度不够高。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合。

本发明是这样实现的，

一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合，包括绵羊ephrina3基因的特异性引物和gapdh基因的特异性引物；所述绵羊ephrina3基因的特异性引物的核苷酸序列为seqidno.1和seqidno.2；所述gapdh基因的特异性引物的核苷酸序列分别为seqidno.3和seqidno.4。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合的构建方法包括：

皮肤组织总rna的提取及cdna的合成：利用trizol法提取皮肤组织总rna，并经bioanalyzer2100检测合格后用于cdna的合成；cdna第一链的合成，按照罗氏反转录试剂盒的说明书进行；

实时荧光定量pcr的反应体系：每个样品设置三个重复，以gapdh为内参基因；采用2-△△ct法计算相关基因的表达量；

实时荧光定量pcr反应程序。

进一步，2^-△△ct法计算相关基因的表达量，具体包括：首先△ct＝目的基因平均ct值-内参基因平均ct值；

其次，-△△ct＝实验组△ct-对照组△ct；

最后计算目的基因相对于内参基因的表达量2^-△△ct。

进一步，所述按照罗氏反转录试剂盒的说明书进行，具体包括：采用罗氏的sybr@premixextaqtmⅱ(2×)，采用20μl反应体系；荧光定量pcr仪采用rochelightcycler480ⅱ。

进一步，所述实时荧光定量pcr反应程序，包括：

94℃预变性10min，

94℃变性30s，

60℃退火30s，

72℃延伸40s，运行40个循环。

进一步，所述实时荧光定量pcr反应程序运行结束后进行融解曲线分析，检测引物扩增的特异性。

本发明的优点及积极效果为：荧光定量pcr方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单,可应用sybrgreen染料法检测，无需使用荧光探针，采用荧光定量pcr相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助ephrina3表达水平的研究，整个pcr反应过程只需1.2小时即可完成。gapdh为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达，且表达量一般是恒定的，故在荧光定量计算过程中经常作为标准化的内参。

附图说明

图1是本发明实施例提供的为不同时期细毛羊体侧部皮肤中ephrina3相对表达量图。

图2是本发明实施例提供的用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合的构建方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

目前，现在以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录pcr需要电泳检测，准确度不够高。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。

本发明实施例提供的用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合包括绵羊ephrina3基因的特异性引物和gapdh基因的特异性引物；所述绵羊ephrina3基因的特异性引物的核苷酸序列为seqidno.1：f：gccccatcaagttctcgg；

seqidno.2：r：cggagtgcgatgtggagg；

所述gapdh基因的特异性引物的核苷酸序列分别为seqidno.3：f：aagttcaacggcacagtca；

seqidno.4：r：accacatactcagcaccagc。

如图2所示，本发明实施例提供用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合的构建方法包括：

s101：皮肤组织总rna的提取及cdna的合成：利用trizol法提取皮肤组织总rna，并经bioanalyzer2100检测合格后用于cdna的合成；cdna第一链的合成，按照罗氏反转录试剂盒的说明书进行。

s102：实时荧光定量pcr的反应体系：每个样品设置三个重复，以gapdh为内参基因；采用2^-△△ct法计算相关基因的表达量。

s103：实时荧光定量pcr反应程序。

2^-△△ct法计算相关基因的表达量，具体包括：首先△ct＝目的基因平均ct值-内参基因平均ct值；

其次，-△△ct＝实验组△ct-对照组△ct；

最后计算目的基因相对于内参基因的表达量2^-△△ct。

所述按照罗氏反转录试剂盒的说明书进行，具体包括：采用罗氏的sybr@premixextaqtmⅱ(2×)，采用20μl反应体系；荧光定量pcr仪采用rochelightcycler480ⅱ。

所述实时荧光定量pcr反应程序，包括：

94℃预变性10min，

94℃变性30s，

60℃退火30s，

72℃延伸40s，运行40个循环。

所述实时荧光定量pcr反应程序运行结束后进行融解曲线分析，检测引物扩增的特异性。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明通过设计绵羊ephrina3基因的特异性引物和gapdh基因的特异性引物，将其用于ephrina3基因表达水平的检测。本发明的工作原理是应用荧光定量pcrsybrgreen荧光染料的方法根据相对定量原理，即2-△△ct法确定基因表达水平。

本发明包含ephrina3一对引物。根据genebank中绵羊相应基因的核苷酸序列，采用primer5.0软件设计引物，相关基因的基本信息见表1。

表1

图1为本发明实施例中不同时期细毛羊体侧部皮肤中ephrina3相对表达量。

本发明实施例中采用罗氏的sybr@premixextaqtmⅱ(2×)，采用20μl反应体系。荧光定量pcr仪采用rochelightcycler480ⅱ。利用本发明的特异性引物组合和方法检测细毛羊皮肤中ephrina3基因表达水平时，基本操作为：

1)皮肤组织总rna的提取及cdna的合成：

利用trizol法提取皮肤组织总rna，并经bioanalyzer2100(agilent,ca,usa)检测合格后用于cdna的合成。cdna第一链的合成，按照罗氏反转录试剂盒的说明书进行。

2)实时荧光定量pcr的反应体系，每个样品设置三个重复，以gapdh为内参基因。采用2^-△△ct法计算相关基因的表达量。反应体系如表2所示：

表2实时荧光定量pcr反应体系

3)实时荧光定量pcr反应程序：(1)94℃预变性10min，(2)94℃变性30s，(3)60℃退火30s，(4)72℃延伸40s，运行40个循环。可在运行结束后进行融解曲线分析，检测引物扩增的特异性。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例一

不同时期细毛羊体侧部皮肤中ephrina3相对表达量

提取皮肤总rna后，经effendorfbiophotometerplus分光光度计检测，od260/280在1.8-2.0，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，28srna和18srna均较明亮，且28s与18s两条带的比值接近2：1。结果表明，所提取的总rna完整性较好，且浓度和纯度可以满足后续试验要求。

ephrina3和内参基因gapdh的熔解曲线峰值图上只有1个明显的峰，表明在实时荧光定量pcr过程中荧光信号均来自特异性扩增产物，ephrina3和内参基因gapdh均没有产生非特异性扩增及引物二聚体，数据可靠，可以进行下一步的数据分析。

如图1所示，ephrina3基因在细毛羊皮肤中的表达情况：胎龄120d时显著高于胎龄90d时(p<0.01)，出生后1d时显著低于胎龄120d时(p<0.01)；出生后一个月时和出生后1d时差异不显著(p>0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>申请人名称：青岛农业大学

<120>一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合

<160>4

<210>1

<211>18

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列gccccatcaagttctcgg

<210>2

<211>18

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列cggagtgcgatgtggagg

<210>3

<211>19

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列aagttcaacggcacagtca

<210>4

<211>20

<212>核苷酸

<213>人工序列

<400>基因序列accacatactcagcaccagc。