一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法与流程

本发明涉及生物免疫领域，更具体地说涉及一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法。

背景技术：
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家蚕是世界上饲养最多的昆虫，利用家蚕幼虫栽培北虫草有着丰富的可利用资源。再者，近几年蚕桑业也面临着严重的滑坡，如何提升蚕桑产业的附加值迫在眉睫，利用家蚕幼虫栽培北虫草不仅成本较低，而且营养价值也不低于野生的冬虫夏草，社会与经济效益显著，就一张蚕种的产值来算一笔经济账，一般春蚕饲养1张蚕种，张种产量100斤左右，茧价2000元/担，一张种收入2000元，用一张五龄幼虫蚕种栽培北虫草，可得到干体蚕虫草14斤左右，以每斤500元计算，一张种的产值7000元，是丝茧育的3.5倍，可大大的提升蚕桑产业的产出值。

技术实现要素：
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本发明的目的就是针对现有技术的不足，而提供一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法。本发明具有步骤简单，使用方便，可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升效果，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外，北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用的优点。

本发明的技术解决措施如下：

一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本发明包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、I gG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。

上述技术方案中，所述北虫草多糖粗提物制备的步骤包括：将北虫草3000g,粉碎,用石油醚脱脂3次,每次10.5L,共去掉脂质601.5g；残渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，减压浓缩至1.25g/ml。

上述技术方案中，所述实验动物及其免疫的步骤包括：将ICR小鼠35只随机分成7组,每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA(10μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理盐水溶液,对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液，2周后进行二免,二免后3周采血,制备血清。

上述技术方案中，所述I gG效价的测定的步骤包括：在96孔酶标板每孔加入100μL包被液(含5μg OVA/mL的0.05mol/L碳酸盐缓冲液),置4℃孵育18h后,洗涤液(pH 7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS 封闭液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释,使血清稀释度为1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB(四甲基联苯二胺)底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。

上述技术方案中，所述IgG亚类测定的步骤包括：在已包被抗原OVA的96孔酶标板上加入1:800倍稀释的待检血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:600稀释的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入1:4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。

上述技术方案中，所述淋巴细胞转化试验的步骤包括：将小鼠脱颈椎处死，75％酒精液浸泡5-10min，无菌操作取小鼠脾脏，加入1mL Hank’s研磨，研磨均匀后将脾细胞吹悬入平皿，过200目铜网后转移入10mL离心管；1500rpm离心10min；PBS洗涤2次；细胞计数后，调整细胞浓度至2.5×10⁶/mL，按100μl/孔的量加入96 孔细胞培养板中；用细胞培养液配制各种刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS终浓度为5μg/mL，ConA终浓度为7.5μg/mL，设阴性对照和空白对照)；37℃、5％CO₂培养箱中培养48h；在培养结束前4h，每孔加入50μl MTT(2mg/mL)；然后将培养板取出，离心(1 500rpm，10min)沉淀细胞，轻轻倾去培养液上清，纸巾吸干；每孔加入150μl二甲基亚砜，避光充分振荡，直至蓝色颗粒完全溶解，570nm波长酶标仪检测OD值；计算淋巴细胞刺激指数(Stimulation index，SI)：

SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。

上述技术方案中，所述细胞因子mRNA检测的步骤包括：

(a)、脾淋巴细胞体外刺激；

(b)、Total RNA提取；

(c)、反转录；

(d)、引物及探针设计；

(e)、Real-time PCR反应体系及条件；

(f)、相对定量计算方法。

本发明的有益效果在于：

本发明步骤简单，使用方便，可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升效果，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外，北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用。

附图说明：

图1为本发明研究技术路线示意图；

图2为不同剂量虫草多糖佐剂组与阳性对照组小鼠血清IgG抗体水平对照示意图；

图3为不同剂量虫草多糖佐剂组与阳性对照组小鼠血清IgG1和IgG2a抗体水平对照示意图；

图4为淋巴细胞转化试验结果示意图；

图5为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IFN-γ表达水平示意图；

图6为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IL-12表达水平示意图；

图7为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IL-10表达水平示意图；

图8为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IL-4表达水平示意图。

具体实施方式：

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述，但本发明所要求保护的范围并不局限于实施方式所涉及之范围。

实施例：一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本发明包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、I gG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。

所述北虫草多糖粗提物制备的步骤包括：将北虫草3000g,粉碎,用石油醚脱脂3次,每次10.5L,共去掉脂质601.5g；残渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，减压浓缩至1.25g/ml。

所述实验动物及其免疫的步骤包括：将ICR小鼠35只随机分成7组,每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA(10μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理盐水溶液,对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液，2周后进行二免,二免后3周采血,制备血清。

所述I gG效价的测定的步骤包括：在96孔酶标板每孔加入100μL包被液(含5μg OVA/mL的0.05mol/L碳酸盐缓冲液),置4℃孵育18h后,洗涤液(pH 7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS封闭液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释,使血清稀释度为1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB(四甲基联苯二胺)底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。

所述IgG亚类测定的步骤包括：在已包被抗原OVA的96孔酶标板上加入1:800倍稀释的待检血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:600稀释的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入1:4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。

所述淋巴细胞转化试验的步骤包括：将小鼠脱颈椎处死，75％酒精液浸泡5-10min，无菌操作取小鼠脾脏，加入1mL Hank’s研磨，研磨均匀后将脾细胞吹悬入平皿，过200目铜网后转移入10mL离心管；1500rpm离心10min；PBS洗涤2次；细胞计数后，调整细胞浓度至2.5×10⁶/mL，按100μl/孔的量加入96孔细胞培养板中；用细胞培养液配制各种刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS终浓度为5μg/mL，ConA终浓度为7.5μg/mL，设阴性对照和空白对照)；37℃、5％CO₂培养箱中培养48h；在培养结束前4h，每孔加入50μl MTT(2mg/mL)；然后将培养板取出，离心(1 500rpm，10min)沉淀细胞，轻轻倾去培养液上清，纸巾吸干；每孔加入150μl二甲基亚砜，避光充分振荡，直至蓝色颗粒完全溶解，570nm波长酶标仪检测OD值；计算淋巴细胞刺激指数(Stimulation index，SI)：

SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。

所述细胞因子mRNA检测的步骤包括：(a)、脾淋巴细胞体外刺激：将述分离到的脾淋巴细胞悬液调整细胞浓度至1×10⁷cell/ml，铺板培养于24孔板，每孔2ml。向培养板内加入刺激物(H1N1流感抗原)，至HA终浓度为2μg/ml，将细胞培养于37℃，5％CO₂的环境中，抗原刺激15h后离心收集细胞，加入RNA提取试剂溶解后保存细胞裂解液于-80℃；(b)、Total RNA提取：提取细胞总RNA，RNA提取效果电泳鉴定：使用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析；(c)、反转录：采用iScript cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录成cDNA，获得的cDNA样品置于-20℃保存备用；(d)、引物及探针设计：采用实时荧光定量双重PCR方法检测目的基因的相对表达量，以小鼠β-acting为内参基因，使用ABI 7300荧光定量PCR仪；目的基因探针5’端以FAM标记，β-actin探针5’端HEX标记，目的基因和内参基因3’端均采用BHQ-1标记。引物和探针序列设计采用软件Primer Express 3.0；基因产物均经过DNA测序鉴定；(e)、Real-time PCR反应体系及条件：采用总体积为25μl的反应体系,依次加入1×Taq-Man通用反应预混液、目的基因引物和探针、β-actin引物和探针、cDNA模板(2μl)。PCR反应程序采用标准TaqMan条件：95℃(15sec)，60℃(30sec)，45个PCR循环；(f)、相对定量计算方法：设定荧光阈值(处于基因扩增信号的对数增长期(logarithmic phase)内的某个阀值(thresholds)被指定为Ct值)，根据不同管内扩增曲线中对应荧光阈值确定样品Ct值，采用相关方法进行相对定量分析。

所述统计学分析，得出结论：

由图2可知北虫草多糖佐剂组均高于抗原单独免疫组，而中剂量虫草多糖佐剂组与阳性对照组小鼠血清IgG抗体水平要显著高于抗原单独免疫组；

由图3可知，北虫草多糖低剂量组小鼠血清中IgG1和IgG2a水均显著抗原单独免疫组小鼠，其它剂量多糖组在两种抗体亚类水平上均略高于抗原单独免疫组小鼠，铝胶仅能诱导Th2型免疫反应，而抗体亚类检测结果也反应出铝佐剂组小鼠仅有IgG1水平显著升高；

图4可知北虫草多糖佐剂组小鼠T/B淋巴细胞均被激活，尤其是中剂量组，对淋巴细胞的刺激指数显著高于抗原单独免疫组。本结果提示，北虫草多糖能有效激活机体免疫细胞，对机体细胞免疫反应有促进作用；

图5、图6、图7及图8可知：北虫草多糖粗提物佐剂组能有效诱导IFN-γ、IL-12、IL-4，尤其是中剂量多糖佐剂组，所诱导的各种细胞因子mRNA表达水平要显著高于抗原单独免疫组。铝佐剂仅能诱导Th2类细胞因子IL-4和IL-10mRNA的表达。

研究结论：

由实验结果可知，北虫草多糖作为蛋白类抗原的佐剂，能有效提高小鼠免疫应答能力，血清抗体水平检测结果可知，北虫草多糖能有效提高OVA免疫小鼠血清中特异性血清抗体及抗体亚类水平，一定剂量的多糖对IgG1和IgG2a均有促进分泌的作用。

由淋巴细胞转化水平检测结果可知，北虫草多糖能有效激活机体T/B淋巴细胞，进而为提高机体的免疫应答水平。

细胞因子检测结果表明，北虫草多糖能有效促进IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10等细胞因子mRNA的表达，尤其是中剂量多糖佐剂组，对两类细胞因子表达水平均有显著激活效应，

本实验以ICR小鼠为模型，经模式抗原OVA免疫后，提取北虫草多糖粗多糖、分别从小鼠体液免疫和细胞免疫两方面进行分析，检测了ICR小鼠48只，随机分成6组，分别为生理盐水组、10μg抗原组、10μg抗原混合不同剂量(低、中、高)北虫草粗多糖粗提物以及10μg抗原加上200μg铝佐剂作为阳性对照组，小鼠间隔2周皮下免疫2次，二免后2周采血测定血清特异性IgG、IgG亚类、淋巴细胞转化水平检测、细胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10)mRNA表达水平。结果表明，中剂量组能显著提高血清特异性IgG抗体及亚类水平、特异性T淋巴细胞转化水平、增强小鼠机体Th1/Th2混合型细胞免疫反应。本实验首次证实将北虫草多糖与抗原物质联合使用，能有效提高机体对疫苗的免疫应答反应。本实验结果将为进一步开发利用北虫草多糖提供科学依据；

由本实验结果可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升左右，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外，北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用。