专利名称：免疫应答的引发的制作方法
免疫应答的引发本申请中引用的所有专利和非专利参考文献在此通过引用整体并入。 发明领域本发明涉及使用恒定链连接的抗原的引发免疫应答的技术和方法(当这些用于引发使用任何合适疫苗的后续加强免疫接种时)。
背景技术：
疫苗接种是给受试者施用抗原材料(疫苗)，以便产生对疾病或状况的免疫。当用于刺激免疫应答时，抗原被称为免疫原，并且该过程被称为免疫接种。疫苗接种涉及一种或多种免疫原的施用，这可以以几种形式施用。疫苗接种要求实体免疫应答的建立。由感染或疫苗接种激活的免疫应答依赖于几种细胞类型例如τ、B和抗原呈递细胞，以及几种不同分子主要是抗原、MHC分子、T和B细胞受体及许多其他的相互作用。常规疫苗或第一代疫苗基于被杀死或减毒的致病菌株。这些通常具有减少的传染力，并且它们通常是无足够的免疫原性的，导致来自疫苗接种的不充分保护。基于来自致病生物的个别抗原蛋白质的第二代疫苗或亚单位疫苗的开发已揭示纯肽或碳水化合物趋于是弱免疫原。DNA疫苗或第三代疫苗具有诱导较广泛范围的免疫应答类型的能力，但维持在人中具有低免疫原性的潜在缺点。对于所有类型的疫苗，疫苗接种程序面对关于增加疫苗效力的未满足需要，以克服上述局限性且提供在疫苗接种过程中刺激免疫系统的更经济方法。本发明目标在于通过提供用于增加疫苗效力的解决方案来解决与疫苗的低免疫原性相关的问题。本发明目标在于通过提供用于引发免疫应答的解决方案来解决与疫苗的低免疫原性相关的问题。本发明因此涉及用核酸构建体引发免疫系统，所述核酸构建体包括MHC II类结合的恒定链/CD74 (本文被称为恒定链或Ii)或其变体，且编码至少一种抗原蛋白质或所述抗原蛋白质的片段，随后为后续加强疫苗接种，以增加所述疫苗的效力。根据本发明的疫苗可以涉及致病性抗原或癌抗原。本文呈现的数据显示使用包括恒定链或其变体的核酸构建体开发引发-加强方案并不简单。令人惊讶的是，本发明公开了可以改变来自恒定链的Ii-KEY(包括LRMK氨基酸残基)和/或Ii-CLIP结构域的部分，而不减少所述免疫引发的效应。不充分地解决这个问题的现有技术参考文献在下文讨论
WO 2007/062656 (Hoist等人)涉及开发改良DNA疫苗，以这样的方式刺激免疫应答， 所述方式增加应答的动力学，同时伴随扩大且改善应答。Holst等人发现抗原与恒定链的融合通过⑶4+T细胞独立机制显著增强随后的抗病毒⑶4+和⑶8+T细胞应答。Holmes 等人(J Clin Oncol. 2008，Jul 10 ;26 (20) :3426-33)描述了 Ii-key 杂合肽疫苗的首次人I期试验，其中Ii-key包括LRMK 4氨基酸序列，恒定链蛋白质的中心部分。Kallinteris 等人的发现(Expert Opin. Biol. Ther. 2006,6 (12):1311, 1321) 也涉及利用包括LRMK氨基酸的Ii-key部分用于增强疫苗效力。US 2008/0095798 (Humphreys等人)公开了用于增加疫苗针对病原体的效力的方法，通过首先用包括所述Ii-key肽的LRMK残基的Ii-Key杂合肽构建体引发受试者的免疫系统，并且随后施用针对病原体的疫苗以加强在引发步骤中产生的免疫应答。发明概述
本发明显示用核酸构建体引发免疫系统，所述核酸构建体包括至少一种MHC II类结合的恒定链/CD74 (本文被称为恒定链或Ii)或其变体，且编码至少一种抗原蛋白质或所述抗原蛋白质的片段，随后为后续加强疫苗接种增加所述疫苗的效力。根据本发明的疫苗可以涉及致病性抗原或癌抗原。令人惊讶的是，本发明公开了 Ii-KEY结构域(包括LRMK氨基酸残基)和/或 Ii-CLIP结构域的部分可以从恒定链中部分置换或省略，而不降低所述引发的作用。因此，本发明已解决了通过采用二步引发-加强方案的疫苗接种而产生的充分刺激免疫应答的问题，由此首先用包括恒定链或其变体的核酸构建体引发免疫系统，随后为以这样的方式使用任何类型的合适疫苗的后续加强免疫接种，所述方式增加应答的动力学，同时伴随扩大且改善应答。特别地，在此可提供用于直接、特异和快速刺激免疫系统的新型系统，以便改善所有动物例如人的疫苗接种方案。这个问题通过在权利要求中表征的本发明的实施方案得到解决。通过本发明，发现用基于Ii链的核酸构建体的引发显著增加在用疫苗后续加强后的抗原特异性CD8+ T细胞、⑶4+ T细胞和/或B细胞生成。因此，本发明的一个方面是提供包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，其中所述核酸构建体能够引发免疫系统，以增强在受试者中施用后续疫苗后的免疫接种。在一个实施方案中，本发明提供了包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，其中通过在受试者中施用后续疫苗，所述核酸构建体能够引发免疫接种。在一个实施方案中，在本发明的核酸构建体中包括的恒定链可以由其野生型序列加以改变，而不减少Ii的效应。因此，在一个实施方案中，包括LRMK氨基酸残基的Ii-KEY结构域已通过缺失或置换例如突变加以改变。在另一个实施方案中，Ii-CLIP结构域的部分已通过缺失或置换例如突变加以改变。Ii-CLIP结构域可以具体地通过将在位置91和99上的甲硫氨酸置换为丙氨酸而改变； 这令人惊讶地增加MHCII呈递。在另一个实施方案中，Ii可以具体地通过缺失Ii的前17个氨基酸而改变；这令人惊讶地增加记忆应答。由此可见这些改变各自可以分开或组合发生。在一个实施方案中，当用于引发针对病毒、微生物例如细菌或寄生虫的疫苗的免疫应答时，在本发明的核酸构建体中包括的恒定链由其野生型序列加以改变。在另一个实施方案中，当用于引发癌症疫苗或针对异常生理学应答的疫苗的免疫应答时，在本发明的核酸构建体中包括的恒定链可以由或不由其野生型序列加以改变。在另一个实施方案中，用于引发免疫应答的核酸构建体和用于加强免疫应答的后续疫苗的至少一个部分是等同的。引发物和加强物(booster)的所述至少一个等同部分可以是Ii或其变体、抗原肽或抗原肽的部分、或遍在的辅助T细胞表位。同样本发明的一个目的是提供包括如本文详述的核酸构建体的递送媒介物 (vehicle)，其中所述递送媒介物是基于RNA的媒介物、基于DNA的媒介物/载体、基于脂质的媒介物、基于聚合物的媒介物或病毒衍生的或DNA或RNA媒介物。在一个优选实施方案中，所述递送媒介物包括脂质体的形成、生物可降解聚合物微球体的形成、核酸构建体包被到胶体金颗粒上或掺入病毒衍生的DNA或RNA载体内。在另外一个优选实施方案中，所述核酸构建体或所述递送媒介物借助于针注射、 基因枪、射流注射(jet injection)、电穿孔、超声或水动力递送进行施用。因此，本发明的一个方面是提供通过包括这样的序列的核酸构建体刺激免疫应答的方法，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体。一个进一步目的提供刺激在这些中的任何或这些中的任何的任何部分内编码的核酸构建体或蛋白质的细胞内散布的装置(means)。本发明的另外一个目的是提供如由本文描述的核酸构建体编码的嵌合蛋白质。本发明的一个进一步方面是提供识别由本文描述的核酸构建体编码的嵌合蛋白质的抗体。本发明的一个方面是提供用于改善疫苗效力的方法，其包括施用如本文详述的核酸构建体。与本发明特别相关的是包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体， 其适合于引发免疫应答。本发明的另外一个方面是提供部分试剂盒(kit in parts)，所述试剂盒包括如本文描述的核酸构建体连同施用所述核酸构建体的医疗器械或其他装置，和/或合适疫苗， 和另外关于如何使用部分试剂盒的说明书。因此可见本发明提供了通过给动物施用如本文下文详述的核酸构建体用于加强动物中的免疫应答的方法。
图1 用基于I i链的裸露DNA疫苗的DNA引发。图2 在Ii序列中结构域和测试的突变的定位。图3 :Ii显著增加SIINFEKL/H_2kb OVA衍生表位的细胞表面呈递。
图4 :Ii仅以顺式工作。图5 =N末端缺失和置换不影响Ii刺激能力。图6 =C末端缺失和置换不影响Ii刺激能力。图7 仅N和C末端缺失降低Ii刺激能力。图8 Ad-I iGP和AchGP疫苗的剂量应答。图 9 Ad-GP、Ad-IiGP 和 Ad-IiCLIPGP 作用于 MHC II 类呈递的比较。图 10 :Ad-GP、Ad-IiGP、Ad-GPLamp-l 和 Ad-Ii Δ 17GP 在体内时间过程研究中的比较。图 11 Ad-GP、Ad-IiGP、Ad-Ii Δ 17GP、Ad-IiKEYGP、Ad-IiCLIPGP、Ad-Iil_117GP 和 Ad-Iil-199GP在体内应答中的比较。图12 =Ad-GP能够引发后续Ad-IiGP加强。图13 =Ad-IiGP不能引发后续Ad-GP或Ad-IiGP加强。图14 =Ad-GP和AdIi-Gp疫苗的剂量应答。图15 与包括残基50 - 215的恒定链变体(Π50-215)偶联的甘露糖受体，与腺病毒纤维蛋白质进一步偶联。
腺病毒一组包含双链DNA的病毒。腺病毒可以进行遗传修饰，使得其不能复制或条件性不能复制。以这种形式，作为腺病毒构建体或腺病毒载体，它们可以用作基因递送媒介物用于疫苗接种或基因疗法。腺病毒纤维蛋白质来自腺病毒的任何血清型的纤维蛋白质。它还称为腺病毒纤维结或具有异源结插入片段的腺病毒纤维结。佐剂其与施用的免疫原决定簇/抗原/核酸构建体的混合物增加或以其他方式修饰对于所述决定簇的免疫应答的任何物质。氨基酸任何合成或天然存在的氨基羧酸，包括在肽和多肽包括在体内合成的蛋白质和酶中存在的任何氨基酸，从而包括氨基酸的修饰。术语氨基酸在本文中与术语“氨基酸残基”同义使用，其意欲包含如所述已与至少一个其他种类例如2、例如3、例如超过3个其他种类反应的氨基酸。通用词氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其中任何可以以“D”或 “L”异构形式存在。氨基酸可以缩写为‘aa’。抗体免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整免疫球蛋白分子或其保留免疫学活性的片段。抗原可以与克隆分布的免疫受体(T细胞或B细胞受体)结合的任何物质。通常是肽、多肽或多聚体多肽。抗原优选能够引发免疫应答。加强通过加强物注射(shot)或剂量来加强是给予免疫试剂例如疫苗的一次或多次另外剂量，在用于引发免疫系统的物质的初始剂量后一段时间给予，以维持或增强通过相同(同源)或另一种(异源)免疫试剂的先前剂量引发的免疫应答。载体抗原与之偶联以帮助诱导免疫应答的实体或化合物。嵌合蛋白质由核苷酸序列编码的遗传改造蛋白质，所述核苷酸序列通过将2种或更多种完整或部分基因或一系列(非)随机核酸剪接在一起制备。补体其作用于“补充”抗体工作的复杂系列的血液蛋白质。补体破坏细菌，产生炎症，且调节免疫反应。细胞因子生长或分化调节剂，在本文中非限定使用，并且不应限制本发明和权利要求的解释。除细胞因子外，粘附或辅助分子或其任何组合可以单独或与细胞因子组合采用。CTL:细胞毒性T淋巴细胞。表达⑶8连同T细胞受体，且因此能够响应由I类分子呈递的抗原的T细胞亚组。递送媒介物由此核苷酸序列或多肽或两者可以从至少一种介质转运到另一种介质的实体。片段用于指出核酸或多肽的非全长部分。因此，片段自身也分别是核酸或多肽。异源加强或引发-加强其中用于加强免疫系统的物质不同于先前用于引发免疫应答的物质。同源加强或引发-加强其中用于加强免疫系统的物质与先前用于引发免疫应答的物质相同。个体鸟、哺乳动物、鱼、两栖类或爬行类包括人类的任何物种或亚种。恒定链与内质网和后续细胞区室中的MHC II分子结合且稳定其的整合膜蛋白质糖蛋白。此处术语恒定链涵盖所有天然存在或人工生成的与人恒定链具有特定相似性的全长或片段化的同源基因和蛋白质。恒定链在本文中缩写为Ii。分离的与本文公开的核酸、多肽或抗体结合使用的‘分离的’指已鉴定且从其天然的、一般的细胞环境的组分中分离和/或回收的那些。本发明的核酸、多肽和抗体优选是分离的，并且本发明的疫苗和其他组合物优选包括分离核酸、多肽或分离抗体。MHC 主要组织相容性复合物，存在MHC的2个主要亚类，I类和II类。裸露DNA:不与组蛋白结合的DNA;通常是低甲基化和富含CpG的DNA。裸露DNA 可以是环状或线性的，例如环状质粒。核酸传送遗传信息的核苷酸链或序列。就本发明而言，核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)或下述中的任何核糖核酸(RNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、嵌入核酸(ΙΝΑ)、 扭曲嵌入核酸(TINA)、己糖醇核酸(ΗΝΑ)、阿糖核酸(ΑΝΑ)、环己烷核酸(CNA)、环己烯基核酸(CeNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖基核酸(TNA)、缺口-聚体(Gap-mers)、混合-聚体 (Mix-mers)和吗啉代类物质(Morpholinos)。核酸构建体遗传改造的核酸。一般包括几种元件例如基因或其片段、启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸尾、接头、多聚接头、操作接头、多克隆位点(MCS)、标记、终止密码子、其他调节元件、内部核糖体进入位点(IRES)或其他。操作接头以保证核酸或多肽的生物加工的方式使核酸构建体或(嵌合)多肽的2 个部分结合在一起的核苷酸或氨基酸残基序列。病原体疾病的特异性成因剂，特别是生物剂例如病毒、细菌、朊病毒或寄生虫，其可以引起对其宿主的疾病，也被称为传染剂。肽限定序列且由酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。该术语与寡肽和多肽类似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以通过肽键或通过非肽键连接。术语肽还包含通过化学或酶催化反应引入的翻译后修饰，如本领域已知的。该术语可以指多肽变体或片段。
药物载体也称为赋形剂或稳定剂，在采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或个体是无毒的。通常生理学上可接受的载体是PH缓冲的水性溶液。生理学上可接受的载体的例子包括缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA ；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLURONI CStm0多个至少2个。引发用例如DNA初始引发免疫系统，以使免疫应答集中于所需免疫原。引发-加强用例如DNA初始引发免疫系统，以使免疫应答集中于所需免疫原，并且用疫苗随后加强免疫应答，导致由所述疫苗诱导的免疫应答中的增加。启动子RNA聚合酶在其上结合以起始通过一种或多种附近结构基因的信使RNA 转录的DNA链中的结合位点。信号肽决定蛋白质在细胞中的最终定位的短氨基酸序列，也被称为分选肽。合适疫苗用于根据本发明使用的任何疫苗，能够加强通过初始引发刺激的免疫应答，特征在于用于引发免疫应答的核酸构建体和用于加强免疫应答的后续疫苗的至少一个部分是等同的。引发物和加强物的所述至少一个等同部分可以是Ii或其变体、抗原肽或抗原肽的部分、或遍在的辅助T细胞表位。表面活性剂能够减少它溶解于其中的液体的表面张力的表面活性试剂。表面活性剂是包含其为亲水的极性基团和其为疏水的非极性基团，并且通常由脂肪链组成的化合物。疫苗能够在动物中诱导免疫应答的物质或组合物在该正文中也被称为免疫原性组合物。免疫应答是在生物中诱导记忆的免疫应答(体液/抗体和/或细胞免疫应答)， 导致传染剂由二次而不是初次应答对抗，从而减少其对宿主生物的影响。本发明的疫苗可以作为预防和/或治疗药物给予。组合物可以包括下述中的一种或多种一种或多种抗原、 包括与Ii可操作地连接的一种或多种抗原的核酸构建体、载体、佐剂和药物载体。变体给定参考核酸或多肽的‘变体’指这样的核酸或多肽，其展示出与所述参考核酸或多肽的一定序列同源性/同一性程度，但不等同于所述参考核酸或多肽。结构域、区域和基序在本文中可以互换使用。发明详述
本发明涉及包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽编码序列可操作地连接的恒定链或其变体。核酸构建体用于引发免疫应答，以加强后续加强疫苗接种的效应。免疫应答
疫苗可以在预防上使用它们在实际感染发生前给予；或在治疗上使用其中它们引发或加速对已在体内的病原体的免疫应答。2种疫苗接种方法要求实体免疫应答的建立。 通过感染或疫苗接种激活的免疫应答依赖于几种细胞类型例如T、B和抗原呈递细胞，以及几种不同分子主要是抗原、MHC分子、T和B细胞受体及许多其他的相互作用。
抗原是在抗原呈递细胞的表面上由MHC分子呈递的肽片段。抗原可以是外源的，即致病性来源，或源于生物自身，所谓的自体或自身抗原。MHC分子是由特异性染色体区域编码的多态基因家族的代表，所述特异性染色体区域称为“主要组织相容性复合物” ("major histocompatibility complex”)，因此为MHC。存在2类MHC分子，MHC I类(MHC-I) 和 MHC II 类(MHC-II)。T辅助细胞通过由MHC II类(MHC-II)分子呈递的抗原刺激，所述MHC-II分子位于抗原呈递细胞的表面上。MHC-II分子在内质网中合成。在合成过程中，它们以阻止MHC-II 分子负载有自体或自身抗原的方式与恒定链(Ii)组合。MHC-II分子通过恒定链中的信号序列转运至在特异性细胞区室中的细胞表面。随着区室通过加工其内含物而成熟，它从溶酶体发展到晚期内体(在与内吞囊泡融合后)到MHC II类区室(MIIC)。内吞囊泡包含外源抗原，即蛋白酶解切割的细菌肽片段。这些片段通过其降解制备，以负载到MHC-II分子上。 MHC-II分子通过恒定链在2部分过程中释放，这时恒定链首先通过蛋白酶解被降解，仅留下在MHC-II结合结构域中称为CLIP的肽，其次通过HLA-DM分子去除CLIP。MHC-II分子随后游离，以结合外源抗原，且在MIIC囊泡与质膜融合后，将其呈递在细胞表面上。这起始体液免疫应答，因为呈递的抗原刺激T辅助细胞的激活，这依次通过几种方式激活B细胞， 这最终分化成抗体分泌细胞。当T细胞毒性细胞的T细胞受体识别与在抗原呈递细胞上的MHC I类分子结合的抗原时，细胞免疫应答起始。MHC-I分子不与功能性类似与MHC-II结合的恒定链的分子结合。MHC-I加工成的抗原呈递分子另外不同于MHC-II分子的那种，因为MHC-I分子已在内质网中负载有抗原。由MHC-I分子呈递的抗原一般是通过蛋白质的蛋白酶体切割的肽片段，所述蛋白质已通过抗原呈递细胞自身合成。这些蛋白质可以是在细胞自身DNA中编码的异常蛋白质或衍生自病毒或其他病原体的蛋白质，所述病毒或其他病原体已感染细胞且寄生其蛋白质合成机制。MHC I类相关蛋白酶解系统存在于基本上所有细胞中。2类T细胞的功能是显著不同的，如由其名称所示的。细胞毒性T细胞通过细胞的直接裂解和通过分泌细胞因子例如Y-干扰素来消灭细胞内病原体和肿瘤。占优势的细胞毒性T细胞是CD8+ T细胞，这也是抗原特异性的。辅助T细胞也是裂解细胞，但其主要功能是分泌促进B细胞(抗体生产细胞)和其他T细胞的活性的细胞因子，并且因此它们广泛增强对于外源抗原的免疫应答，包括抗体介导的和细胞毒性T细胞介导的应答机制。CD4+ T细胞是免疫应答中的主要辅助T细胞表型。核酸构建体
本发明的一个方面涉及包括这样的序列的核酸构建体例如裸露DNA构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段简言之抗原可操作地连接的至少一种恒定链或其变体。在一个实施方案中，本发明涉及包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，其中所述恒定链或其变体不包括KEY区域的LRMK氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明涉及包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，其中所述恒定链或其变体包括CLIP区域的变体。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，其中所述恒定链或其变体不包括前17个氨基酸。在另外一个实施方案中，本发明涉及包括这样的序列的核酸构建体，所述序列编码与至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，其中所述核酸构建体用于癌症疫苗的引发。核酸构建体应理解为遗传改造的核酸。核酸构建体可以是非复制的且线性的核酸、环状表达载体或自主复制质粒。核酸构建体可以包括几种元件，例如但不限于基因或其片段、启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸尾、接头、多聚接头、操作接头、多克隆位点 (MCS)、标记、终止密码子、内部核糖体进入位点(IRES)和用于整合的宿主同源序列或其他限定元件。应当理解根据本发明的核酸构建体可以包括上述元件的任何组合的所有或亚组。用于改造核酸构建体的方法是本领域众所周知的(参见例如，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Sambrook 等人，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory, 第2版，Cold Spring Harbor, N. Y.，1989)。进一步地，根据本发明的核酸构建体可以无需模板而合成，并且可以得自各种商业供应者(例如Genscript Corporation)。在一个实施方案中，核酸构建体包括的核酸残基可以被修饰。所述修饰可以选自 乙酰化、甲基化、磷酸化、遍在蛋白化、核糖基化、硫化及其他。在一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体可以由DNA组成。在另一个实施方案中，核酸构建体可以由选自下述的核酸组成脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、嵌入核酸(ΙΝΑ)、扭曲嵌入核酸(TINA)、己糖醇核酸(HNA)、阿糖核酸(ANA)、环己烷核酸(CNA)、环己烯基核酸(CeNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖基核酸(TNA)、缺口 -聚体、混合-聚体、吗啉代类物质或其组合。如上所述，MHC II分子在加工过程中与恒定链结合，直至结合的恒定链降解，以允许外源抗原肽负载到MHC II分子上。当应用包括虔定經-接头-表位的‘外部’蛋白质构建体时，其中恒定链包括KEY区域(包括LRMK氨基酸残基)，所述蛋白质构建体在所述MHC II分子定位于细胞的细胞外表面上时将与MHC II分子(包含抗原)相互作用。因此，效应是外部的，并且依赖于蛋白质构建体(包括LRMK氨基酸残基)的恒定链KEY-残基竞争负载到MHC II分子上的能力。换言之，在细胞内加工过程中已负载到MHCII分子上的抗原必须被“倒出”(“tipped off”)或从细胞表面上的MHCII分子中去除，并且由包括虔定經-接头-表位的蛋白质构建体代替。这给出无法扩增的“1:1”_效应，并且它不变地依赖于来自恒定链的LRMK氨基酸残基的存在。根据本发明的核酸构建体涉及应用编码恒定链或其变体且还编码抗原肽或表位的‘内部’核酸构建体，即核酸构建体转染到受试者中细胞的细胞内间隙内。所述核酸构建体将使用细胞翻译机制，以产生虔定經-接头-表位或恒定链-表位产物，在所述MHC分子定位在细胞内例如在胞内体或MIIC中时，这将与MHCII分子或MHCI分子(不包含抗原) 相互作用。因此，效应是内部的，并且不依赖于蛋白质构建体(包括LRMK氨基酸残基)的恒定链KEY-结构域竞争负载到MHC分子上的能力。事实上，该效应不依赖于Ii-KEY区域及其LRMK残基的存在。此外，这给出可以扩增的效应，因为一个核酸构建体可以产生超过一种产物。核酸构建体的‘内部’使用具有优于蛋白质构建体的‘外部’使用的几个优点，如上详述1)扩增；小量核酸构建体的引入产生可以都与MHC分子结合的许多产物，这还可以是二次扩增的，因为与MHC结合的所述产物可以通过内在化进一步再循环，以最终增加其展示，2)细胞自身抗原加工系统的使用确保表位与MHC分子的正确和紧密结合，3)不需要 Ii-KEY区域的LRMK残基和天然Ii-CLIP结构域。密码子最佳化和简并核酸序列
功能蛋白质在异源宿主中的表达是现代生物技术的基石。不幸的是，许多蛋白质难以在其原始背景外表达。它们可以包含表达限制性调节元件，来自使用非经典核苷酸编码的生物，或来自具有在所需宿主中很少使用的密码子的普遍基因(gene rife)。基因合成速度和效率中的改善已致使可行的完整基因重新设计用于最大限度的蛋白质表达。例如，当在研究下的基因的密码子频率与宿主表达系统的密码子频率匹配时，蛋白质表达可以显著改善。例如，重新设计策略可以不仅包括最佳密码子偏好的使用，还包括mRNA结构元件的改变以及翻译和起始区的修饰。用于密码子最佳化的技术是本领域技术人员已知的，并且可以通过商业供应者例如GeMcript Corporation执行。应当理解根据本发明包括恒定链或其变体的核酸构建体可以以任何方式进行密码子最优化，以便通过翻译成蛋白质即氨基酸产生包括根据本发明的恒定链或其变体的氨基酸序列，所述恒定链对应于SEQ ID NO 2 (人Ii)中公开的氨基酸序列。同样地，根据本发明包括恒定链的核酸构建体可以以任何方式进行密码子最优化，以便通过翻译成蛋白质即氨基酸产生包括根据本发明的恒定链或其变体的氨基酸序列，所述恒定链对应于其中核酸构建体可以用于引发免疫应答的任何动物的氨基酸序列； 包括任何脊椎动物、哺乳动物、鱼或鸟。密妈子编密码子偏好已鉴定为在原核生物基因表达中的单个最重要因子。给定密码子在遗传密码中出现的程度在生物之间、在以高和低水平表达的蛋白质之间和甚至在相同操纵子的不同部分之间显著不同。关于这点的原因几乎是必然的，因为优选密码子与细胞内可用的同族tRNA丰度相关。这个关系用于最优化翻译系统且平衡密码子浓度与同工 tRNA (isoacceptor tRNA)浓度。替换很少使用的密码子一般而言，基因包含的罕见密码子越多，异源蛋白质将在那种特定宿主系统内以合理水平表达的可能性越小。如果罕见密码子成簇或在蛋白质的N 末端部分中出现，那么这些水平变得甚至更低。用更紧密地反映宿主系统的密码子偏好而不改变氨基酸序列的其他密码子替换罕见密码子可以增加功能蛋白质表达水平。/■/场履密妈子生物使用小于5% - 10%时机的任何密码子都可能引起问题， 不管它来自何处。再次，紧密或相邻密码子对蛋白质表达比它们分开可以具有更大的影响。 消除罕见密码子和可以作为终止信号阅读的密码子可以阻止低表达或不存在表达的情况。在哺乳动物宿主中表达病毒蛋白质如果基因正确制备，甚至病毒基因也可以在哺乳动物细胞系中成功表达。病毒基因的密集信息负荷频繁导致重叠的读码框。许多病毒基因还在编码序列内编码顺式作用的负调节序列。病毒基因可以重新合成，不仅只表达所需蛋白质，还破坏调节元件，从而增强蛋白质产生。病毒密码子最优化在DNA疫苗研究中是特别有用的，因为它增加靶的免疫原性。
真勉履激:尽管密码子偏好在基因表达中发挥很大作用，但表达载体和转录启动子的选择也是重要的。在蛋白质N末端区域周围的核苷酸序列对于罕见密码子的存在和紧邻起始AUG的密码子的特性是特别敏感的。在翻译和mRNA稳定性之间还存在一定相互影响。遗传密码的简并性
根据上文可见遗传密码具有冗余性但不具有多义性(ambiguity)。例如，尽管密码子 GAA和GAG都指定谷氨酸(冗余性)，但其中无一指定任何其他氨基酸(无多义性)(关于完全关联参见下文密码子表)。编码一种氨基酸的密码子可以在其3个位置中的任何中不同。遗传密码的简并性是解释沉默突变的存在的原因。因为4种碱基的三联体密码指定20种氨基酸和终止密码子，所以产生简并性。
权利要求
1.一种核酸构建体，其包括编码下述的序列a.与b可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，b.至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段，其中所述核酸构建体用于癌症疫苗的引发，和/或所述恒定链或其变体不包括前17个氨基酸，和/或所述恒定链或其变体不包括KEY区域的LRMK氨基酸残基，和/或所述恒定链包括CLIP区域的变体。
2.根据权利要求1的核酸构建体，其用作用于刺激免疫应答的引发物，从而增加后续施用的疫苗的效力。
3.根据权利要求1的核酸构建体，其中至少一种恒定链或其变体是生物特异性的。
4.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中至少一种恒定链或其变体是人源的。
5.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链的至少一个区域、肽或结构域加入、去除或置换所述至少一种恒定链的区域、肽或结构域。
6.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链的KEY区域的 LRMK氨基酸残基中的1、2、3或4个由其他氨基酸残基置换。
7.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链的KEY区域的 LRMK氨基酸残基中的1、2、3或4个由丙氨酸置换。
8.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链的KEY区域的 LRMK氨基酸残基中的1、2、3或4个是缺失的。
9.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链的CLIP区域在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸残基由其他氨基酸残基置换。
10.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链的CLIP区域在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸残基由丙氨酸置换。
11.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链的前17个氨基酸是缺失的(Δ17Ι )。
12.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述恒定链包括与来自另一种蛋白质的三聚结构域偶联的氨基酸残基编号50 - 118。
13.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述至少一种恒定链或其片段引起以⑶4+ T细胞依赖性和/或不依赖性方式的MHC-I和/或MHC-II依赖性免疫应答。
14.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段选自致病性生物、癌症特异性多肽和与异常生理学应答相关的蛋白质或肽。
15.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中来自致病性生物的所述至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段选自包括下述的病原体病毒、微生物和寄生虫。
16.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段来自哺乳动物生物，优选人病原体。
17.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段来自癌症特异性多肽。
18.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段来自选自下述的癌症特异性多肽HPV衍生的病毒癌基因E5、E6、E7 和 Ll ；存活素、Bcl-XL、MCL-I 和 Rho-C0
19.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段是与权利要求14 - 18所述抗原中的任何至少85%等同的抗原肽或蛋白质。
20.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中在所述恒定链或其变体和所述抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段之间的操作接头选自直接连接或由间隔区介导的连接。
21.根据权利要求20的核酸构建体，其中所述操作接头是间隔区。
22.根据权利要求21的核酸构建体，其中所述间隔区编码关于MHCII类分子的至少一个辅助表位。
23.根据权利要求21的核酸构建体，其中所述间隔区编码至少一个蛋白酶切割位点。
24.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中至少一种恒定链与至少2种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段可操作地连接。
25.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中使得所述构建体能够表达的启动子在所述至少一种可操作地连接的恒定链或其变体和至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段编码序列前。
26.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述启动子选自组成型启动子、诱导型启动子、生物特异性启动子、组织特异性启动子和细胞类型特异性启动子、CMV启动子、 SV40启动子和RSV启动子。
27.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其包括与抗原呈递和/或细胞内散布有关的基因。
28.根据前述权利要求中任一项的核酸构建体，其包括编码佐剂的基因。
29.—种递送媒介物，其包括根据前述权利要求中任一项的核酸构建体。
30.根据权利要求四的递送媒介物，其中所述媒介物选自基于RNA的媒介物、基于 DNA的媒介物/载体、基于脂质的媒介物、基于聚合物的媒介物和病毒衍生的DNA或RNA媒介物。
31.根据权利要求30的递送媒介物，其中所述递送媒介物是聚乙二醇化的载体或媒介物。
32.根据权利要求30的递送媒介物，其中所述基于脂质的媒介物是脂质体。
33.根据权利要求30的递送媒介物，其中所述基于聚合物的媒介物由选自下述的阳离子聚合物DNA载体形成聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二胺和聚丙胺树状聚体、聚烯丙胺、阳离子右旋糖酐、壳聚糖、阳离子蛋白质(聚赖氨酸、鱼精蛋白和组蛋白)、阳离子肽、多肽、脂多糖和多糖。
34.根据权利要求33的递送媒介物，其中所述递送媒介物是生物可降解聚合物微球体。
35.根据权利要求30的递送媒介物，其中所述递送媒介物包括将所述核酸构建体包被到胶体金颗粒上。
36.—种用于施用根据权利要求四-35中任一项的递送媒介物的方法，其中所述施用选自针注射、基因枪、射流注射、电穿孔、超声和水动力递送。
37.—种用于施用根据权利要求四-35中任一项的核酸构建体的方法，其中所述施用选自针注射、基因枪、射流注射、电穿孔、超声和水动力递送。
38.—种细胞，其包括如权利要求1 -观中任一项中定义的核酸构建体。
39.一种嵌合蛋白质，其包括至少一种可操作地连接的恒定链或其变体和至少一种抗原蛋白质或肽，编码其的序列如通过权利要求1 -观中任一项中的核酸构建体中的任何定义的。
40.一种抗体，其可以识别如权利要求39中定义的嵌合蛋白质。
41.根据权利要求40的抗体在用于检测所述抗体与之结合的蛋白质的测定中的用途。
42.一种组合物，其包括编码下述的核酸序列a.与b可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，b.至少一种抗原蛋白质或肽或所述蛋白质或肽的抗原片段。
43.一种用作药物的组合物，其包括编码下述的核酸序列a.与b可操作地连接的至少一种恒定链或其变体，b.至少一种多肽。
44.根据权利要求42和43中任一项的组合物，其包括如权利要求1- 28中任一项中定义的核酸构建体。
45.根据权利要求42- 44中任一项的组合物，其中所述组合物包括至少2种载体。
46.一种组合物，其包括根据权利要求39的至少一种嵌合蛋白质，如通过权利要求1 -观中任一项中的核酸构建体中的任何定义的。
47.根据权利要求42- 46中任一项的组合物，其中所述组合物包括佐剂。
48.一种部分试剂盒，其包括a.包括根据权利要求1-观中任一项的核酸构建体的组合物，b.用于施用所述组合物的医疗器械或其他装置，c.关于如何使用所述部分试剂盒的说明书。
49.根据权利要求48的部分试剂盒，其中所述试剂盒包括第二种活性成分。
50.根据权利要求49的部分试剂盒，其中所述第二种活性成分是合适疫苗。
51.一种用于增加疫苗效力的方法，其包括步骤a.提供根据权利要求1-观中任一项的核酸构建体、或根据权利要求42 - 47中任一项的组合物，b.通过施用步骤a)的核酸构建体或组合物引发受试者的免疫系统，从而刺激所述受试者中的免疫应答，和c.通过施用合适疫苗加强步骤b)的免疫应答。
52.根据权利要求51的方法，其中用于引发免疫应答的所述核酸构建体的至少一部分和用于加强所述免疫应答的所述疫苗是等同的。
53.根据权利要求52的方法，其中所述等同部分是所述抗原肽或蛋白质的部分。
54.根据权利要求52的方法，其中所述等同部分是遍在辅助T细胞表位。
55.根据权利要求51的方法，其中所述免疫应答是MHC-I依赖性的。
56.根据权利要求51的方法，其中所述免疫应答是MHC-II依赖性的。
57.根据权利要求51的方法，其中所述免疫应答是MHC-I和MHC-II依赖性的。
58.根据权利要求51的方法，其中所述免疫应答是T细胞依赖性的。
59.根据权利要求51的方法，其中所述免疫应答是CD4+T细胞依赖性的。
60.根据权利要求51的方法，其中所述免疫应答是CD4+T细胞不依赖性的。
61.根据权利要求51的方法，其中所述免疫应答是CD8+T细胞依赖性的。
62.根据权利要求51- 61中任一项的方法，其包括步骤a.提供根据权利要求42- 47中任一项的至少一种组合物，b.给受试者施用所述至少一种组合物至少一次用于动物的治疗或预防。
63.根据权利要求51- 62中任一项的方法，其中所述组合物施用于最可能是给定感染的接受器的区域。
64.根据权利要求51-63中任--项的方法，其中所述受试者是人。
65.根据权利要求51-63中任--项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
66.根据权利要求51-63中任--项的方法，其中所述受试者是雪貂。
67.根据权利要求51-63中任--项的方法，其中所述受试者是鱼。
68.根据权利要求51-63中任--项的方法，其中所述受试者是鸟。
全文摘要
本发明涉及使用恒定链连接的抗原的引发免疫应答的技术和方法，当这些用于引发使用任何合适疫苗的后续加强免疫接种时。
文档编号C12N15/62GK102292102SQ200980154924
公开日2011年12月21日 申请日期2009年11月20日 优先权日2008年11月21日
发明者R. 汤姆森 A., P. 克里斯滕森 J., 格鲁吉克 M., J. 霍尔斯特 P. 申请人:哥本哈根大学