专利名称：使用泛dr结合肽改变免疫应答的制作方法
背景技术：
本发明是1993年9月14日申请的尚未授权的美国专利申请No.08/121,101的部分继续申请，上述申请在此被引作参考。
本发明涉及用于防止、治疗或诊断如自身免疫疾病、病毒病和癌症等病理状态的组合物和方法。尤其是，它提供了能够与特定的主组织相容性复合体(MHC)分子结合并诱导或抑制某种免疫应答的新型肽。
MHC分子被分为I类或II类分子。II类MHC分子由如巨噬细胞、树状细胞或B细胞等特化的抗原提供细胞(APC)表达。II类MHC分子通常与由来自外部的APC进入内吞路径的蛋白抗原被加工后产生的肽片段结合。然后，这些MHC-肽复合物被用以查找CD4＋T辅助细胞，后者由此被激活、增殖并扩增对被显示出的免疫原性肽的免疫应答。T细胞的激活要求T细胞受体(TCR)被它的配体，一种一个MHC分子和一个肽抗原形成的双分子复合体所结合(Shimonkevitz等，J.Immunol.133，2067-2074(1984)；Babbitt等，Nature 317，359-361(1985)；Buus，H.、Annu.Rev.Immunol.7，601-624)。
T细胞的不适当的激活是如自身免疫、同种移植排斥反应和过敏性应答等一系列免疫病理反应的原因之一。自身免疫病的实例有类风湿关节炎、多发性硬化和重症肌无力。涉及T细胞激活的过敏性应答有对各种花粉、尘螨等的过敏。另外，外源感染疾病会导致免疫病理反应(如莱姆病、肝炎、LCMV、链球菌感染后的心内膜炎或肾小球性肾炎)。人们已将如腹腔疾病和Crohn病那类食物过敏以及其它过敏性疾病与特定的MHC等位基因相关联或怀疑其具有自身免疫成分。
最常用的治疗这些症状的方法是抑制免疫系统，通常是靠使用免疫抑制药物。已有人提出与病症相关的MHC等位基因为已知情况下另一的治疗方法，它涉及对特定MHC等位基因的选择性封闭。但是，当涉及一些MHC限制时，必须有除选择性封闭以外的方法。
要求结合II类分子的肽的免疫化学研究已有开展。已经确定了几种小鼠和人的II类MHC等位基因的结合序列，最近，通过对天然加工过的肽的测序来进行的各种II类类型的结合区分析也有所描述(Rudensky等，Nature353，622-627(1991)；Chicz等，Nature358，764-768(1992)；Hunt等，Science256，1817-1820(1992)；Rudensky等，Nature359，429-431(1992))。
尤其是DR分子，已发现(Brown等，Nature364，33-39(1993))，占据MHC结合沟区一个相应的疏水穴的一个大疏水锚状结构是肽-DR相互反应的关键决定因子。其它几种锚结构也起着一定但较次要的作用，并帮助决定等位基因的特异性。最近，也有人Q强调肽分子C-末端半段的肽骨架直接以氢键与MHC结合沟区的璧结合(Krieger等，J.Immunol.146，2331-2340(1991)；O’Sullivan等，J.Immunol.146，1240-1246(1991)；O’Sullivan等，J.Im-munol.147，2663-2669(1991)；)。
虽然沿MHC等位基因产物的结合穴排列的等位基因特异性多型残基倾向于赋予每个等位基因结合唯一一组肽的能力，但在许多情况中，一个特定肽被证明可与一个以上的MHC特异型结合。记载得最好的是人的DR同种型的例子，其中指出，几个DR等位基因产物似乎能识别相似的结合区，而且，几个研究者分别报导了多种DR类型情况中某些抗原决定基的变性结合和/或识别，从而产生了某些肽可能代表着“通用”抗原决定基的概念(Busch等、Int.Immunol.2，443-451(1990)；Panina-Bordignon等，Eur.J.Immunol.19，2237-2242(1989)；Sinigaglia等，Nature336，778-780(1988)；O’Sullivan等，J.Immunol.147，2663-2669(1991)；Roache等，J.Immunol.144，1849-1856(1991)；Hill等，J.Immunol.147，189-197(1991))。但是，虽然以前报导的几种抗原决定基确实具有结合几种DR等位基因产物的能力，它们决不是通用的。
所以，本发明提供了被称为“泛DR结合肽”的DR结合肽，它们可以被多种DR等位基因产物识别。根据本发明，这类泛DR结合肽可被用作II类分子限定的T细胞的强免疫原，并可被用作有用的以肽为基础的人用免疫抑制剂、疫苗或治疗剂。
发明概述本发明提供了抑制或诱导病人体内T细胞活化的组合物和方法。这些方法包括服用治疗有效量的药物组合物，该组合物含某种药用载体和约4至20残基之间的肽，该肽可结合基本上被DR位点的所有等位基因编码的MHC分子上的抗原结合位置。这些肽被归为泛DR结合肽。泛DR结合肽可被用于抑制与免疫病理有关的免疫应答，如自身免疫、同种移植排斥反应和过敏性应答。
当被用于加强免疫应答时，泛DR肽可起到T辅助肽的作用并与CTL诱导肽一起服用。T辅助肽可与CTL诱导肽结合以形成抑制CTL/T辅助肽结合物。该结合物还可以进一步被修饰。例如，该结合肽可以被乙酰化、十六酰化或被某种脂肪酸酰化，或与载体结合。CTL肽也可以通过一间隔分子，如Ala-Ala-Ala与T辅助肽结合。或者，泛DR结合肽可被用于加强抗体应答。就CTL应答的诱导而言，泛DR肽可以与抗体诱导决定子结合或混合服用。
可用各种常规方法对泛DR肽进行描述。例如，优选的泛DR肽的结构式为R1-R2-R3-R4-R5，其方向为由肽的氨基端(R1)至肽的羧基端(R5)，其中R1是D-氨基酸，后面跟有一个丙氨酸或赖氨酸；R2是环己基丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸；R3是3或4个氨基酸，其中每个分别选自丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸组；R4是苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸、赖氨酸-苏氨酸或色氨酸-苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸这一组；R5由2至4个氨基酸构成，其后跟有一个D-氨基酸，2或4个氨基酸中的每一个分别选自丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸这一组。根据这个结构式，更为优选的泛DR肽的结构式为R1-R2-R3-R4-R5，其中R1是D-丙氨酸，后面跟有一个丙氨酸或赖氨酸；R2是环己基丙氨酸、或苯丙氨酸；R3是3或4个氨基酸，其中每个分别选自丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组；R4是苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸、赖氨酸-苏氨酸或色氨酸-苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸；R5是2至4个丙氨酸，其后跟有一个D-丙氨酸。
对泛DR肽的描述还可以使用蛋白质中常见氨基酸的单字母密码，并特别标示出D-氨基酸或非常见氨基酸。用这种常规法，本发明的优选泛DR肽包括如下这些oZXZZZKTZZZZo、oZXZZZZTLKZZo、oZXVZZZTLKZZo、oZXIZZZTLKZZo、oKXVZZWTLKZZo和oKFVZZWTLKZZo其中o是一个D-氨基酸，Z是丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸，K是赖氨酸，T是苏氨酸，L是亮氨酸，W是色氨酸，X是环己基丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。最优选的泛DR肽有aAXAAAKTAAAAa、aAXAAAATLKAAa、aAX-VAAATLKAAa、aAXIAAATLKAAa、aKXVAAWTLKAAa和aKFVAAWTLKAAa其中的a是一个D-丙氨酸，A是丙氨酸，X是环己基丙氨酸，K是赖氨酸，T是苏氨酸，L是亮氨酸，V是缬氨酸，I是异亮氨酸，W是色氨酸。
附图简述
图1A-1F所示的是对12个不同供者中3个的代表性应答。所测试的人PBMC T细胞系产生的抗原特异性T细胞应答发生在加入肽965.10(实心方框)、906.09(空心方框)、760.50(实心园)或破伤风类毒素830-843(空心园)的当天，第14天(第二次刺激，图1A、1B、1C)和第28天(第三次剌激，1D、1E、1F)。所示的是两个各自独立的试验。
图2A和2B所示的是人PBMC产生的抗原特异性T细胞应答的概括。图2A显示了第二次刺激的结果，图2B显示了第三次刺激的结果。所得的最大Δcpm标在纵坐标上。
图3A-3F显示了通过测定已接触抗原的小鼠淋巴结T细胞的增殖能力来反映的各种肽抗原决定基的体内免疫原性。给C57BL/6J小鼠注射20μg/鼠(空心三角)、1μg/鼠(实心方框)、50ng/鼠(空心方框)、2.5ng/鼠(实心园)或0.125ng/鼠(空心园)的TT830-843(图3A)、Ova323-336(图3B)、HBVc128-140(图3C)、965.10(图3D)、1024.03(图3E)和760.50(图3F)。10天后，取出脓肿的淋巴结并如实施例9所示检测T细胞的增殖。所表示的是二个独立实验的代表。
定义本文中的寡聚肽或肽指至少4个氨基酸或氨基酸类似物的链，以至少6个为佳，更好的是8至10个，有时是11至14个残基，但通常少于30个残基，更为通常的是少于约25个残基，以少于15个为佳，如8至14个残基。寡聚肽或肽的长度各异，可以是中性态的(不带电)也可以是其盐形式的，可以未经糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰，也可以含有上述修饰，只要修饰作用不损害在此所述的多肽的生物活性。
当提及某肽、寡聚肽或蛋白质中的氨基酸残基时，“氨基酸残基”、“氨基酸”和“残基”被互换使用，在本文中指通过一个酰胺键或一个类酰胺键与至少一个其它氨基酸或氨基酸类似物共价连接的氨基酸或氨基酸类似物。
本文中，如不加限定，“氨基酸”指“L-氨基酸”或L-氨基酸类似物。
虽然肽中最好基本不含其它天然蛋白及其片段，但在有些实施例中可以通过合成将肽与天然片段或颗粒复合。生物活性指与某相当的MHC分子结合的能力，以及对用于刺激CTL应答的肽而言的诱导T辅助细胞应答然后由此辅助诱导抗某靶抗原或抗原类似物的CTL应答的能力。对肽类似物拮抗剂而言，如果它能与天然肽竞争与MHC分子的结合并由此大大降低天然肽刺激T细胞应答的能力，它就是具有生物活性的。
本发明的“泛DR结合肽”是指可以高亲合力结合至少12个最常见DR等位基因(DR1、2w2b、2w2a、3、4w4、4w14、5、7、52a、52b、52c和53)产物中7个的肽。“高亲合力”在此定义为结合时的IC50％小于300nM。
在本公开内容的全文中，以IC50值表示结果。设定试验进行条件(即限定MHC分子和标记的肽的浓度)，这些值近似于KD值。应当注意，如果试验条件变化，IC50值常会发生急剧的改变，它还取决于所用的具体试剂(如MHC制剂等)。例如，过高浓度的MHC将会增加某特定配体的测得的表观IC50。
为避免不确定性，另一种表示结合数据的方法是表示为相对于某参照肽的相对值。在每次试验中都包含参照肽。由于某个具体的试验敏感性或高或低，待测肽的IC50会有所变化。但是，对参照肽的相对结合率不会变化。例如，在会令参照肽的IC50提高10倍的条件下进行的试验中，待测肽的所有IC50也将变化约10倍。所以，为了避免不明确性，对某肽是好的、一般的、弱的或非结合肽的评定必须以它相对于标准肽的IC50的IC50为基础。
如果某具体试验中的标准肽的IC50与表1中所报导的不同，则应当认识到，必须通过某相应的因数校正用于评定好的、中等的、弱的或非结合肽的阈值。
表I
<p>本发明的“CTL诱导肽”是源于潜在的靶抗原的特定抗原决定基区的肽，如肿瘤相关抗原，包括但不限于肾细胞癌、乳腺癌、癌胚抗原、黑色素瘤(MAGE-1)抗原、前列腺癌特异抗原、肝炎C抗原、埃-巴二氏病毒(EB病毒)抗原、HIV-1和HIV-2抗原和乳头状瘤病毒抗原。
“分离的”或“生物纯的”指基本或完全不含可见于其天然态中的常伴成分的材料。所以，本发明的肽不含在原环境中常与它们缔合的物质，如产抗原细胞上的MHCI类分子。即使某种蛋白已被分离成了一条均一的或主要条带，其中仍有5-10％的随所需蛋白共纯化的痕量天然蛋白污染。本发明的分离的肽不含这种内源共纯化蛋白。
“T细胞克隆”指单个纯淋巴细胞的子代，并可表达相同的免疫球蛋白或T细胞受体蛋白。本文中“纯”淋巴细胞的定义与在此引作参考的Stites等，Basic and Clinical Immunology，第8版，PrenticeHall，Englewood Cliffs，New Jersey(1994)中所述的相同。
本文中的“T辅助肽”指可被T细胞受体或T辅助细胞识别的肽。本发明的T辅助肽即泛DR结合肽。
优选实施例的说明在一个实施例中，本发明涉及使用泛DR结合肽防止T辅助细胞的激活来阻断免疫应答。因为它们的变性的II类分子结合能力，泛DR结合肽可作为治疗剂被用于抑制与同种移植排斥反应、变应性应答或自身免疫有关的T细胞介导的反应。
或者，泛DR结合肽可用作各种疫苗制剂中的助剂成分来增强对施用的免疫原的免疫应答。例如，将泛DR结合肽与CTL诱导肽一同施用来诱导对例如病毒感染细胞的CTL应答。或者，将泛DR结合肽与CTL诱导肽复合后施用来诱导某种CTL应答。在另一个实施例中，泛DR结合肽与某种抗体诱导肽复合或混合。Her-vasStubbs等，Vaccine，12867-871(1994)中描述了使用辅助肽来增强抗体对特定的抗原决定基的应答的实例。
用于描述肽化合物的命名法遵循常规法则，每个氨基酸残基的氨基在左(N-端)而羧基在右(C-端)。在氨基酸结构式中，每个残基通常以标准的三字母或单字母表示法表示。氨基酸残基的L-型由大写的单字母或开头大写的三字母标记表示，而那些D-型氨基酸的D-型由小写单字母或小写的三字母标记表示。甘氨酸没有不对称碳，所以简单地表示为“Gly”或G。
可用各种方法来制备本发明的肽。因为它们较短，可根据常规技术在溶液中或固体支持物上合成之。有市售的各种自动合成仪并可按已知方法进行使用。参见，例如，Stewart和Young，“固相的肽合成”，第2版，Pierce Chemical Co.(1984)，上述。
或者，可使用重组DNA技术，将编码感兴趣的免疫原性肽的一段核苷酸序列插入表达载体中，将此载体转化或转染合适的宿主细胞并在适于表达的条件下进行培养。这些步骤在本技术领域是公知的，Sambrook等的Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor Press，New York(1982)中有全面的描述，在此引作参考。所以，由一个或多个本发明肽序列的融合蛋白可被用于提供合适的T细胞抗原决定基。
由于编码所期待的长度的肽的序列可以化学合成，例如Mat-teucci等，J.Am.Chem.Soc.，1033185(1981)中的磷酸三酯法，可方便地通过替换编码天然肽序列的适当碱基来进行修饰。由此可用合适的接头将编码序列连入本技术领域的常用表达载体，和将载体转化进合适的载体来产生所需的融合蛋白。现在已有许多这样的载体和合适的宿主系统。为了表达融合蛋白，编码序列必须具有起始和终止密码子，启动子和终止子区，并常具有在所需的细胞宿主中进行表达的表达载体的复制系统。例如，在含有方便所需编码序列插入的限制性位点的质粒中具有与细菌宿主相容的启动子序列。所得的表达载体可被转化入合适的细菌载体。当然，使用合适的载体和调控序列，也可使用酵母或哺乳动物细胞宿主。泛DR结合肽本发明提供了扩展某初始肽的特异性的用以鉴定其修饰作用的方法。例如，国际申请WO92/02543，在此引作参考，描述了适用于鉴定可结合DR分子的肽的方法。该申请描述了将得自流感病毒(“HA”)的血凝素作为与HLA-DR发生特异性反应的肽来源。对蛋白片段进行反应性筛选以提供可结合合适的DR分子，如DR1、DR4w4或DR4w14的序列。
一旦可结合特定MHC分子的抗原或其肽被鉴定出来，可利用如合成重叠肽和/或使N-末端或C-末端缺失(缩短)或增加法来测定该抗原或肽的“核心结合区”。在核心结合区和关键接触残基的测定中，可使用一系列单氨基酸被取代的肽来测定静电荷、疏水性等对结合的影响。
在核心区内，“关键接触位”，即对保留与MHC分子的结合及抑制其向T细胞的供给能力来说必须存在于肽中的那些残基(或它们的功能对等物)，可利用单氨基酸取代、缺失或插入来鉴定。另外，还可以用某种特定氨基酸(如Ala)进行系统扫描以探察关键接触残基侧链的作用。
对除关键接触位外的以中性氨基酸进行的单个氨基酸取代较不敏感的本发明的肽被发现可耐受多取代作用。特别优选的多取代作用是小型、相对中性的部分，如Ala、Gly、Pro或类似残基。取代物可以是均寡聚物或杂寡聚物。被取代或增加的残基的数目和类型取决于关键接触位点间的必需间隔和欲得到的某种官能特性(如疏水性对亲水性)。
与母肽的亲合性相比，通过这种取代作用还可能获得提高的对MHC分子的结合亲和性。无论如何，这种“间隔”取代作用选用的氨基酸残基或其它分子片段必须避免可能导致会破坏结合的例如立体和电荷干扰。
也可以用D-氨基酸来探察单氨基酸取代作用的影响。可利用熟知的如Merrifield，Science，232341-347(1986)，Barany和Mer-rifield，“肽”，Gross and Meienhofer编，(N.Y.，Academic Press)，pp.1-284(1979)；和Stewart和Young，“固相的肽合成”，(Rockfo-erd，I11.，Pierce)，第2版(1984)中描述的肽合成法来进行这种取代作用，上述文献在此引作参考。
用于本主题发明的肽不必与在后文实施例部分所述的肽或CTL肽的特定抗原蛋白序列相同，只要主体化合物能与适当的MHC分子结合或提供对靶抗原蛋白的细胞毒性T淋巴细胞活性就行。所以，熟练技术人员可以认识到，可进行许多基本上不影响肽的活性的保守性取代作用。保守性取代作用是涉及以另一个生物和/或化学相似的氨基酸，如用另一个疏水性残基取代疏水残基，或另一个极性残基取代极性氨基酸的那些取代。
使用上述一般方法，可测得某特定的MHC等位基因的一个结合区。为了扩展对一个或多个等位基因产物表现出高度亲合性的肽的特异性，可进行上述的修饰作用，并进一步测试所得肽的结合性。然后选出对特定的MHC分子表现出明显较高的结合性的修饰肽。这种修饰作用可以用多少是随机的方式进行。修饰初始肽的一种方法是将两个或多个等位基因产物的结合区合并。
在另一种可用的方法中，含有对结合MHC是关键的侧链的锚残基被插入一个13个残基的聚丙氨酸肽。Jardetzky等，Nature，353，326-329(1990)，已经使用了这种方法，并证明，以一个优性的MHC接触残基(Tyr)修饰过的聚丙氨酸肽可使该肽具有对DR1的高亲合结合能力。也可使用环己基丙氨酸或苯丙氨酸取代酪氨酸作为主MHC接触残基。就肽与DR等位基因产物(它们能高度亲合结合HA肽)的结合能力而言，这些残基可以与Tyr互换，并且还可以与在DRβ链的第86位残基有一个G→V取代的MHC分子结合。这种改变影响到II类MHC分子的B结合穴，使得酪氨酸不再能够有效结合，但环己基丙氨酸或苯丙氨酸却可以结合。
可在各种系统中检测以上鉴定的肽的生物活性。典型的是，测试其抑制抗原特异性T细胞激活的能力。在一试验方案中，将过量的肽与已知表达MHC(如DR1)的抗原表现细胞，和具有已知抗原特异性(如破伤风病毒830-843)和MHC限定性(仍然是DR1)的T细胞克隆，和抗原肽本身(即，破伤风病毒830-843)一起孵育。将测试培养物孵育足够的时间以使T细胞增殖，例如4天，然后利用标准方法，如在孵育的最后18小时中以氚化胸腺嘧啶脉冲法来测定增殖情况。然后计算与没有抑制物的对照相比的抑制百分比。
肽在体外试验中抑制抗原表现的能力已被与其在体内抑制免疫应答的能力相关联。可以在动物模型中测定其体内活性，例如给予已知与被局限于可被肽识别的特定MHC分子结合的抗原和免疫调节肽。然后从动物体内取出T淋巴细胞，用某剂量范围的抗原培养。用常规方法，如(3H)-胸腺嘧啶脉冲法及与合适的对照的比较来测定对刺激作用的抑制。某些试验细节对本领域熟练技术人员来说将是显而易见的。也可参见Adorini等，Nature334，623-625(1988)，在此引作参考。
从美国菌种保存中心(“细胞系和杂交瘤目录”第六版，(1988)Rockville Maryland，U.S.A.，在此引作参考)中可得知并容易得到许多具有已确定的MHC分子，尤其是II类MHC分子的细胞。
本发明肽的一优选实施例中包含了对N-和C-末端残基的修饰。如本专业熟练技术人员可理解的，可修饰N-末端或C-末端来改变肽的物理或化学特性，例如影响结合率、稳定性、生物利用率、连接的便易性等。
以各种氨基酸类似物或D-氨基酸进行的肽的修饰，例如在N-或C-末端，可被用于例如提高肽的体内稳定性。这种肽可以“逆转”或“反向-逆转”的形式来合成，即，以D-氨基酸取代某序列氨基酸的L-氨基酸或逆转氨基酸的序列并以D-氨基酸取代某序列氨基酸的L-氨基酸。因为D-肽显著地耐受肽酶，所以在血清和组织中比它们的L-肽对等物稳定，与相应的L-肽相比，D-肽的生理条件下的稳定性可能不止于对亲合性差异的补偿。而且，取代或未取代过的含L-氨基酸的肽可以一个D-氨基酸的帽子来抑制外切肽酶对抗原性肽的降解作用。
可用许多方法来测定稳定性。例如，肽酶和许多生物培养基，如人血浆和血清已被用于测试稳定性。可参见如Verhof等，Eur.J.Drμg Metab.Pharmacokin.11，291-302(1986)；Walter等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.148，98-103；Walter等，Neuroendocrinology30，377-381(1980)；Verhoef等，J.Endocrinology110，557-562(1986)；Handa等，Eur.J.Pharmacol.70，531-540(1981)；Bizzoze-ro等，Eur.J.Biochem.122，251-258(1982)；Chang，Eur.J.Biochem.151，217-224(1985)，均被在此引作参考。
还可以在肽的C和N末端引入D-氨基酸残基来提高稳定性。以前的研究已经表明，当被培养在含血清的培养基中时，通过在C和N末端引入D-氨基酸来提高肽对外切肽酶活性的耐受性可相当大地延长含L-氨基酸的肽的体外和体内半寿期。
可通过改变某些氨基酸的顺序或组成来对本发明的肽或类似物进行修饰，很容易理解，某些对生物活性是决定性的氨基酸残基，如位于关键接触位的那些，其改变通常会对其生物活性产生不良影响。非关键性氨基酸则不必限于天然存在于蛋白质中的那些，例如可以是L-α-氨基酸或它们的D-异构体，但也可包括非蛋白氨基酸，如β-γ-δ-氨基酸及许多L-α-氨基酸的衍生物。如前所述，本发明的肽通常可含有L-氨基酸或D-氨基酸，但不能在核心结合区中含有D-氨基酸。
CTL肽CTL肽可与本发明的泛DR肽联合给药以强化免疫应答。一系列抗原蛋白的CTL抗原决定基可用于本发明的复合体。合适的抗原实例有前列腺特异性抗原(PSA)，乙型肝炎核心抗原和表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如MAGE-1)，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原和人乳头瘤病毒(HPV)抗原。
在某些实施例中，本发明的CTL肽来源于HBV表面抗原或病毒粒子多肽，核心区及核心前区内。在本文所述的更为优选的实施例中，CTL诱导肽源于HBenv309-368区(肽799.08)，HBenv392-348区(肽799.09)，HBenv349-368区(肽799.10)或HBc91-110区(肽802.03)，其编号根据Galibert等，Nature281，646(1979)，在此引作参考。
合成含有合适的抗原决定基的CTL肽，然后使用纯化的I型分子和放射性碘标记的肽和/或表达空I型分子的细胞，通过例如免疫荧光染色法、流动显微荧光测定法、肽依赖I型分子组装检测和由肽竞争引起的CTL抑制测试它们与I型MHC分子的结合能力。然后进一步评价那些结合在I型分子上的肽作为由被感染或免疫的个体产生CTL的靶的能力，以及它们作为潜在的治疗剂诱导初级的体外或体内CTL应答的能力，这可导致产生能与病毒感染的靶细胞和癌细胞反应的CTL群体。
可将一种或多种CTL肽与一种或多种泛DR肽以混合物形式联合给药，其中可以包含或不含肽之间的非共价结合。例如，可将这些肽中的一种或多种按如下所述进行脂化以便于肽之间的缔合。或者，可将肽共价连接以形成一种CTL/泛DR肽复合体。
为了便于CTL肽和泛DR肽的结合，可在CTL肽的末端添加附加氨基酸。附加残基也可因本文所述的原因或为了改善肽或寡聚肽等的物理或化学特性被用于与某载体、支承体或较大的肽偶合。可在肽或寡聚肽的C-末端或N-末端引入酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等氨基酸。另外，通过例如用链烷酰基(C1-C20)或巯基乙酰基乙酰化反应对末端-NH2的酰化或利用氨或甲基胺进行的末端羧基的酰胺化，可使肽或寡聚肽序列与天然序列有所不同。在有些情况中，这些修饰作用可提供与载体或其它分子连接的位置。
就泛DR肽而言，应理解，本发明的肽或其具有CTL激发活性的类似物可被修饰以提供其它希望具有的特性，例如在提高或至少基本保留未修饰肽的所有生物活性的同时改善其药学特性。例如，可通过对肽氨基酸序列的延长、缺失或取代，例如在由本文所揭示的序列得到的肽的氨基端或羧基端，或两端添加或缺失氨基酸来修饰肽。通常，有意使序列中模仿CTL激发抗原决定基的那部分与靶抗原蛋白序列的区别不大于约20％，除非为了改善肽的物理或化学特性，例如方便连接或偶合等而可能在其末端添加附加氨基酸。如果肽序列中的某些区域被发现具有病毒亚型中的多型性，可能需要改变一个或多个特定氨基酸以更有效地模仿不同病毒株或亚型的不同细胞毒性T淋巴细胞抗原决定基。
由本发明鉴定的含CTL抗原决定基的肽序列区中，如HBV特异性肽，存在有一些残基(或其功能基本相当的对等物)，它们可令肽保留其生物活性，即激发对病毒感染的细胞或表达病毒的细胞抗原的I型分子限定的细胞毒性T淋巴细胞应答的能力。可利用单氨基酸取代、缺失或插入来鉴定这些残基。另外，可通过利用某特定氨基酸(如Ala)进行的系统扫描探得残基侧链的影响。可耐受多重取代作用的肽通常发生了小型，相对中性分子的取代作用，例如Ala、Gly、Pro或类似残基。可被取代、添加或缺失的残基的数目及类型取决于关键抗原决定基点之间的距离和要求的构相或功能特性(例如疏水性对亲水性)。如有必要，还可通过这样的改变提高肽类似物，因提呈给CTL而与它的MHC分子的结合亲合性。通常，抗原决定基和/或具构相上的重要性的残基间的任何间隔取代、添加或缺失应选用可避免可能干扰结合的立体和电性干扰的氨基酸或其它组成部分。耐受取代作用，同时保留其要求的生物活性的肽也可象前文就泛DR肽所述的那样被合成为含D-氨基酸的肽。
本发明的肽可通过连键组合成聚合物(多聚物)，或配制成不彼此连接的组合物，例如混合物。当相同的肽相连接时，形成均聚物，可提供大量的重复抗原决定基单元。当肽不同时，例如代表不同病毒亚型、同一亚型中的不同抗原决定基、不同的HLA限制特异性或含特定T辅助抗原决定基的肽的混合物，可得到具有重复单元的杂聚物。除了共价连键，还可考虑形成非共价连键的分子间或结构间的结合键。
复合体的制备如上所述，CTL诱导肽可与泛DR结合肽共价连接以制备本发明中的复合体。特别优选的CTL诱导肽/泛DR结合复合体是通过一个间隔分子连接的。或者，CTL肽可以不通过间隔与泛DR结合肽连接。间隔通常由较小的中性分子构成，例如氨基酸或氨基酸类似物，它们在生理条件下基本不带电并可能具有线型或分支的侧链。间隔分子通常选自，例如Ala、Gly或其它由非极性氨基酸或中性的极性氨基酸构成的中性间隔基。在本文的某些优选的实施例中，Ala为中性间隔基。可以理解，随意提供的间隔基不一定由相同的残基构成，所以可以是杂合或均聚的寡聚物。优选间隔基的实例是Ala均聚物。如果有间隔基存在，它通常至少为1至2个残基，更通常的是3至6个残基。在其它实施例中，泛DR结合肽优先结合在CTL肽的氨基端。肽之间可以通过一中性连接基，例如Ala-Ala-Ala等连接，而且最好还含有一个与一个Lys残基的α和ε氨基相连的如软脂酸等的脂质残基(如后文所述)，该残基通常通过Ser-Ser等结合在肽复合体的氨基端。
CTL诱导肽可以直接或通过一个位于CTL肽的氨基端或羧基端的间隔基与泛DR结合肽连接。CTL诱导肽或泛DR结合肽的氨基端都可以是酰化了的。另外，CTL肽/泛DR结合复合物可以如后文将述的通过一个或多个连接残基，如Gly、Gly-Gly、Ser、Ser-Ser与某些链烷酰基(C1-20)脂质相连。
在某些实施例中，可能要求在本发明的药物组合物中包括至少一种帮助引发CTL的组份。脂质被证实是可以在体内帮助引发体内对病毒抗原的CTL的物质。例如，可将软脂酸残基连接在Lys残基的α和ε氨基，然后再通过一个或多个例如Gly、Gly-Gly、Ser、Ser-Ser等与一免疫原性肽连接。然后可将这种脂化的肽以被结合在某种脂质体中或乳化在某种助剂，如不完全Freund助剂中的胶束形式直接用于注射。在一个优选实施例中，一种特别有效的免疫原含有连接在Lys残基的α和ε氨基上的软脂酸，该残基通过连键，如Ser-Ser连在免疫原性肽的氨基端。
作为脂质引发CTL应答的另一实例，E.coli脂蛋白，如三软脂酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与合适的肽共价连接时可被用于引发病毒特异性CTL。可参见Deres等，Nature，342，561-564(1989)，在此引作参考。例如，本发明的肽可与P3CSS偶合，然后对个体使用这种脂肽以特异性地引发对靶抗原的CTL应答。而且，因为还可以用与表现某适当抗原决定基的肽结合的P3CSS来引发中和抗体，所以可将两种组份组合在一起更有效地诱发由感染引起的体液介导和细胞介导的应答。
药物组合物出于预防和/或治疗的目的，可将本发明的泛DR结合肽和由它们制得的药物和疫苗组合物用于哺乳动物，尤其是人。泛DR肽可被用于强化针对与肽一起使用的其它免疫原的应答。例如，CTL/泛DR结合肽混合物可被用于治疗和/或防止病毒感染和癌症。或者，可使用能诱导抗体应答的免疫原。可用泛DR肽和其它免疫原构成的免疫原性混合物来治疗的疾病的实例有前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、肾癌、宫颈癌、淋巴瘤、CMV和尖锐湿疣。
泛DR结合肽还可被用于治疗涉及T细胞不当反应性的各种疾病。可用泛DR结合肽治疗的疾病的实例有自身免疫疾病(如类风湿关节炎、多发性硬化和重症肌无力)、同种移植排斥反应、变应性应答(如花粉过敏)、淋巴疾病、肝炎、LCMV、链球菌引起的心内膜炎或肾小球性肾炎，以及食物过敏。
用于治疗时，本发明的免疫原性组合物或泛DR结合肽被用于已经患有癌症、自身免疫疾病或已被所研究的病毒感染的个体。只要合适，可单独使用泛DR结合肽或免疫原性复合体或结合其它疗法来对疾病潜伏期或发作期的病人进行治疗。
用于治疗时，给病人服用足量的含有免疫原性组合物的组合物以诱发对病毒或肿瘤抗原的有效CTL应答，从而治愈或至少部分抑制症状和/或并发症。与此类似，可给病人服用足量的含有泛DR结合肽的组合物以治愈或至少部分抑制疾病的症状及其并发症。足以完成上述功能的量被定为“治疗有效剂量”。为此用途的有效量将取决于例如肽组份、给药方式、接受治疗的疾病的所在阶段及严重性、病人的体重和总健康状况和开方医师的判断。
本发明的免疫原性组合物的治疗有效量通常在用于初次免疫(这是对治疗和预防性给药而言)时约为1.0μg至5000μg肽/70kg病人，然后的加强剂量根据数周至数月的强化进程约为1.0μg至1000μg肽。该进程取决于通过测定病人血液中特异性CTL活性而知的病人的应答和其它情况。
本发明的DR-结合肽的有效治疗量通常对70公斤体重病人每日约0.1mg到约2000mg肽范围，比较常用剂量为每日约0.5mg至约100mg肽。
必须记住，本发明的组合物常可用于重症病情，即危及生命或对生命有潜在危险的情况。在这种情况下，由于复合体外源物质最少而相对无毒的特性，治疗医师可能并可能认为必需使用大大过量的组合物。
为了预防性用途，在急性感染中，必须在疾病首次表现或被诊断出时，或手术去除肿瘤后，或刚确诊后开始给药。然后在至少症状被显著缓解并此后一段时间后再给以强化剂量。在慢性感染中，强化剂量前可能需要给以负荷剂量(loading doses)。
用本发明组合物治疗被感染个体可以加速急性感染个体中感染的消除。对那些可能(或先倾向于)发展成慢性感染的个体，组合物在防止急性感染向慢性感染转化的治疗方法中特别有用。如果在感染前或感染中诊断出有转化可能的个体，如本文所述，就可以给它们服用组合物，尽可能减少给较大群体用药的需要。
还可将肽混合物或复合物用于治疗慢性感染并刺激免疫系统杀灭病原携带者体内的病毒感染细胞。重要的是在制剂或剂型中提供足量的免疫加强肽以有效激发细胞毒性T细胞应答。所以，对于慢性感染的治疗，代表性的剂量约为70kg的病人每剂1.0μg至5000μg，最好约为5μg中1000μg。可能需要免疫剂量后长时间内既定间期例如1至4周地给以强化剂量以有效地免疫个体。在慢性感染中，给药必须持续直至临床症状或实验室试验显示病毒感染已消除或基本缓解并稳定了一段时间。
治疗用药物组合物可非肠胃、表面、口服或局部给药。最好，药物组合物为非肠胃给药，例如静脉内、皮下、皮内或肌内。所以，本发明提供了非肠胃给药的组合物，它们由溶解或悬溶在被认可的载体，最好是水性载体中的肽或复合物溶液构成。有许多可用的水性载体，例如水、缓冲水溶液、0.9％的盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸等。可使用常规的，熟知的灭菌技术对这些组合物进行灭菌，或者也可进行无菌过滤。所得的水溶液即可被包装使用，或冻干，在使用前将冻干制剂与无菌溶液混合。组合物中还可以按近似生理条件的要求含有如pH调节剂和缓冲液、渗透压调节剂、湿润剂等药用辅助物质，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨酯、油酸三乙醇胺等。
药物制剂中本发明的泛DR和/或CTL激发肽的浓度(按重量计)变化范围很宽，即从不足约0.1％，通常为或至少约为2％，至多达20％至50％或更多，并根据选定的特定的给药形式，首先根据液体体积、粘度等来选择。
本发明的肽和复合物还可以通过脂质体来给药，它们可使复合物定靶到特定组织，例如淋巴样组织或选择性地定靶到被感染细胞，并可延长肽组合物的半寿期。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散系、薄片层等。在这些制剂中，欲释放的肽被结合作为脂质体的一部分，脂质体可以是单独的或与某种分子一起，这种分子可与例如淋巴样细胞中的主要受体，例如与CD45抗原结合的单克隆抗体结合，或与其它治疗性或免疫原性组合物一起。所以，内含所需要的本发明的肽或复合物的脂质体可被导向淋巴样细胞位置，然后脂质体在那里释放出特定的治疗性/免疫原性肽组合物。由于本发明的脂质体是由标准成囊脂类形成的，这些脂类通常包括中性和带负电的磷脂和某种甾醇，例如胆固醇。对脂类的选择通常要考虑到例如脂质体的大小、脂质体在血液中的酸不稳定性和稳定性。有许多可用的制备脂质体的方法，正如以下文献中所述，如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9，467(1980)，U.S.专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369，在此引作参考。
为了定靶到免疫细胞，可将一配基加入脂质体，例如对要求的免疫系统细胞的表面决定基具有特异性的抗体或其片段。含有肽或复合物的脂质体悬溶液可通过静脉内、表面、局部等途径给药，剂量根据，尤其是给药方式、被释放的复合物和被治疗的疾病的阶段而不同。
对固体组合物而言，常用无毒固体载体包括，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，可混合任何常用赋形剂，例如前文所列的那些载体和通常为10-95％的活性成分，即一种或多种本发明的复合物，以25％-75％的浓度更好，从而形成药用无毒组合物。
对气雾剂给药而言，这些肽最好被精细粉碎并与某种表面活性剂和推进剂混合在一起。复合物典型的重量百分比为0.01％-20％，以1％-10％为佳。当然，表面活性剂必须是无毒的，并最好可溶于推进剂。这类试剂的代表为6至22个碳原子的脂肪酸，如己酸、辛酸、月桂酸、软脂酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸和油酸与某种脂族多元醇或它的环状酐形成的酯或半酯。可使用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可占组合物总重的0.1％-20％，以0.25％-5％为佳。组合物中的其余组份通常为推进剂。如有必要，还可包含某种载体，例如用于鼻内释放的卵磷脂。
本发明的另一方面涉及以本文所述的免疫原性上有效量的免疫原性的泛DR肽或CTL/泛DR肽复合物为活性成分的疫苗。复合物可与其自身的载体结合后或以活性肽单元的均聚物或杂聚物形式被引入包括人在内的宿主。这种聚合物的优点在于提高免疫反应以及当聚合物由不同的肽构成时附加的诱导可与病毒或癌细胞的不同抗原决定族反应的抗体和/或CTL的能力。可用的载体是本专业所熟知的，包括，例如甲状腺球蛋白、如牛血清白蛋白等白蛋白、破伤风毒素、如聚(赖氨酸谷氨酸)那样的聚氨基酸、乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒重组疫苗等。疫苗中还可含有生理可耐受的(被认可的)稀释剂，如水、磷酸盐缓冲液或盐水，通常还包括某种助剂。如不完全Freund助剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾等助剂是本专业所熟知的物质。另外，如前所述，可通过将本发明的肽与脂类，如P3CSS复合来引发CTL应答。在通过注射、喷雾、口服、脑内或其它途径用本文所述的肽组合物进行了免疫后，宿主的免疫系统立刻通过产生大量对要求的抗原具有特异性的CTLs来对疫苗产生应答，而宿主变得对以后的感染至少具有部分免疫力或防止发展成慢性感染。
可给对疾病，如病毒感染或癌症易感或有患病危险的病人服用含有本发明的泛DR肽的疫苗以诱导对抗原的免疫应答并由此加强病人本身的免疫应答能力。这样的用量被定为“免疫有效剂量”。使用中，确切的量仍然取决于病人的健康状况和体重、给药方式、制剂的特性等，但通常约为1.0μg至5000μg/70kg病人，更常用的约为10μg至500μg/70kg病人。
有时，可能需要将本发明的肽疫苗与诱导对特定病毒，特别是病毒被膜抗原的中和抗体应答的疫苗混合使用。
为了治疗或免疫的目的，还可以用已减弱的病毒宿主，如牛痘或禽痘来表达本发明的肽。这种方法涉及使用牛痘病毒作为表达编码本发明的肽的核酸序列的载体。在被引入一急性或慢性感染的宿主或未感染的宿主中后，牛痘病毒立刻表达免疫原性肽并诱导宿主的CTL应答。美国专利4,722,848中描述了在免疫方案中使用的牛痘病毒和方法，在此引作参考。另一种载体是BCG(卡介苗)。Stover等，Nature351，456-460(1991)对BCG进行了描述，在此引作参考。根据本文的说明，用于本发明的肽的治疗性给药或免疫的多种其它载体，如Salmonella typhi载体，对本专业熟练技术人员来说将是显而易见的。
也可将抗原复合物用于体外激发CTL。可将产生的CTL用于病人体内治疗慢性感染(病毒或细菌性的)或癌症，这种病人对其它治疗形式不应答，或对某种疗法中的肽疫苗不应答。对特定病原(感染原或癌症抗原)的体外CTL应答是通过将病人的CTL前体细胞(CTLp)与一抗原提供细胞(APC)及合适的免疫原性肽一起组织培养来诱导的。在培养了一段合适的时间后(通常为1-4周)，期间，CTLp被激活、成熟并增大成效应者CTL，这些细胞被输回病人体内，它们将在那里摧毁它们的特异性靶细胞(被感染细胞或癌细胞)。
本发明的肽还可被用于制造单克隆抗体。这种抗体可被用作潜在的诊断或治疗剂。
这些肽还可用作诊断剂。例如，某种本发明的肽可被用来测定某特定个体对使用肽或相关肽的疗法的敏感性，从而有助于改进现行治疗方法或测定某有效个体的预后。另外，这些肽还可用于预测哪个病人有较大的发展成慢性感染的危险。
提供以下实施例是作为说明而非限制。
实施例实施例I试验步骤I.细胞系和MHC的纯化多种细胞系被用作纯化的人和小鼠的II类分子的来源。以下被EB病毒转化的纯核子细胞系被用作人HLA Ill类分子(Valli等，J.Clin.Invest.91，616-628，1993)的来源LG2(DB1*0101(dR1))；3107(DRB1*1501(DR2w2b))；MAT(DRB1*0301(DR3))；PREISS(DRB1*0401(DR4))；BIN40(DRB1*0404(DRw14))；SWEIG(DRB1*11011(DR5))；PITOUT(DRB1*0701(DR7))；PF(DQA1*0301/DQB1*0301(DQ3.1))。有时，也可使用转染的成纤维细胞L416.3(DRB5*0101(DR2w2a))；TR81.19(DRB3*0101(DR52a))；和L257.6(DRB4*0101(DRw53))。至于小鼠II类分子，使用以下细胞系A20(IAd，IEd)(Sette等，Science258，1801-1804，1992)；CH12(IAk，IEk)(Sette等，1992)；LS102.9(IAx)(Wall等，Int.Imm.4，773-777，1992)；和DB27.4(IAb)(Wall等，J.Immuno.1524526-4536，1994)。
II.MHC分子的纯化MHC分子的纯化基本如Gorga等，J.Biol.Chem.262，16087-16094(1987)所述。简而言之，用LB3.1(全部DR，Valli等，J.Clin.Invest.91，616-628(1993))或IVD12(DQ3.1，Sidney等，J.Im-munol.152，4516-4525(1994))单克隆抗体通过亲合层析来纯化人II类分子。用MKD6(IAd，Sette等，Science258，1801-1804，1992)；10.3.6(IAk，Sette等，同上)；14.44(IEk和IEk，Sette等，同上)；和Y3JP(IAs，Wall等，Int.Imm.4，773-777，1992)单克隆抗体来纯化小鼠II类分子。
III.肽的合成利用标准Fmoc偶合循环程序(1.40版)，在一台AplliedBiosystem(Foste市，CA)430A肽合成仪上通过N-α-Fmoc-保护的氨基酸的序列偶合来合成肽。所有的氨基酸、反应试剂和树脂均得自Apllied Biosystem或Nova Biochem(San Diego，CA)。溶剂得自Burdich&Jackson。固态合成开始于一被适当取代的Fmoc-氨基酸-Wang树脂。起始树脂的加量为0.5-0.7mmol/g聚苯乙烯，每次合成中使用0.1或0.25毫当量。一典型的反应循环如下进行在25％的哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中反应5分钟以去除N-端的Fmoc基，然后再用25％的DMF溶液处理15分钟。用DMF洗涤该树脂5次。在树脂中加入过量4至10倍的预形成的合适的Fmoc-氨基酸的1-羟基苯并三唑酯的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，令混合物反应30至90分钟。用DMF洗涤树脂以备其后的延伸循环。对全保护的、树脂结合的肽进行一次哌啶循环以去除末端的Fmoc基团。用二氯甲烷洗涤产物并干燥。然后在20℃，在合适的清除剂(例如5％(v/v)的水溶液)存在下用三氟乙酸处理树脂60分钟。蒸发去除过量三氟乙酸后，用二乙醚洗涤粗肽，将其溶解在水中，然后冻干。利用反相HPLC将肽纯化至均一性＞95％，使用含0.8％TFA改性剂的H2O/CH3CN梯度，在一Vydac上进行，孔径300A，用C-18制备柱。在一分析反相柱上测试肽的纯度并利用氨基酸分析和/或测序确定肽的组成。合成中使用的环己基丙氨酸购自NofaBiochem(San Diego，CA)。在切下肽之前在树脂上完成软脂酸偶合来制备软脂酰化的肽。偶合以对称酸酐法进行，即过量两倍的软脂酸和一倍的二异丙基碳化二亚胺在二氯甲烷中反应1小时。
IV.MHC肽结合的测试在蛋白酶抑制剂混合物存在下，将纯化的小鼠或人的II类分子(5至500nM)与5nM125I-放射性标记的肽在含5％DMSO的PBS中孵育48小时。用氯胺-T法进行纯化肽的碘标记(Buus等，Sci-ence235，1353-1358(1987))。蛋白酶抑制剂的终浓为1nMPMSF，1.3nM1.10菲咯啉，73μM抑胃酶素A，8mM EDTA，6mMN-乙基马来酰亚胺，和200μM Nα-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯乙基丙酮。孵育混合物中去污剂的终浓为2.6％的毛地黄皂甘(IAd和IAk)或0.05％的NP-40(所有其它II类分子)。由Sephadex G-50或TSK2000柱上的凝胶过滤从游离肽中分离出II类分子-肽复合物，如现有技术所述计算被结合肽的所占百分数(Sette等，J.Immnol.142，35-40(1989))。在预备试验中，用固定量的放射性标记肽来滴定每种DR制剂以测定结合总放射性的10％至20％所需的II类分子浓度。所有以后的抑制和直接结合试验均用该II类分子浓度进行。在抑制试验中，抑制肽的试验浓度通常为120μg/ml至1.2μg/ml。然后以此数据作图，测出产生50％抑制的剂量。对每种肽进行2至4次完全独立的试验测试。
在本文中，＜50nM的结合为高亲合性结合而50-500nM的结合为中等亲合性结合。
V.DR限制的肽显示的抑制测试肽抑制MHC抗原显示功能的能力，方法是将用丝裂霉素C处理过的合适DR类型的EBV细胞(5×104/穴)与溶于RP-MI1640(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中的抑制肽培养在含10％人血清(Gemini Bioproducts，Inc.Calabasas，CA)的完全培养基中。常规地在96穴的U形底的测试板(Costar，Cambridge，MA)中对四份十倍稀释液滴定抑制肽，初始浓度为150μg/ml。与抑制肽一道，测试穴中还有亚适浓度的HA307-319肽(DR1，DR4w4，DR5，DR52b)或HA307-319，Y309＞F(DR4w14)，或Lol P1171-190(DR3)(Sidney等，J.Immunol.149，2634-2640(1991))，该浓度在无抑制肽时产生最大增殖应答的30-50％的。此浓度常规为50至200ng/ml。在含5％CO2的培养箱中将APC与各种肽在37℃培养2小时后，在每穴中加入2×104T细胞。所用的T细胞克隆为Cl1(DR1和DR52b(Krieger等，J.Immunol.146，2331-2340(1991)))；克隆42.19(DRw14)；克隆JK1(DR5)和细胞系132-132(DR3)。3天后测试T细胞的增殖。简而言之，加入T细胞24小时后，每穴加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/穴)(ICN，Irvine，CA)以进行最后18小时的培养。然后在玻璃纤维滤纸(LKB Wallac细胞收集器1295-001，LKB，Gaithersburg，MD)上收获细胞，然后测定胸腺嘧啶的掺入(LKB beta测试板计数器1205)。对抗原显示的抑制程度计算为抑制50％的增殖应答所需的抑制肽剂量。
实施例2“通用”肽抗原决定基的DR结合特异性几种小鼠和人的II类MHC等位基因产物的结合序列已被确定，而且最近，通过对天然加工过的肽的测序进行的II类类型的序列分析也有所描述(Rudensky等，Nature353，622-627(1991)；Chicz等，Nature358，764-768(1992)；Hunt等，Science256，1817-1820(1992)；Rudensky等，Nature359，429-431(1992))。
尤其是DR分子，已证实，占据MHC结合沟的相应疏水穴的大型疏水锚结构是肽-DR相互作用的最关键的决定基。其它几种锚结构也起着一定但较次要的作用，并帮助确定等位基因特异性。最近，也有人强调肽分子C-末端半段的肽骨架直接以氢键与MHC结合沟区的璧结合。
虽然沿MHC等位基因的结合穴排列的等位基因特异性多型性残基倾向于赋予每个等位基因结合一组特异的肽的能力，但在许多情况中，一个给定肽被证明可与一个以上的MHC特异型结合。最好的记载是人的DR同种型的例子，其中以前指出过，几个DR等位基因产物似乎能识别相似的序列，而且，几个研究者分别报导了多种DR类型中某些抗原决定基的变性结合和/或识别，从而产生了某些肽可能代表着“通用”抗原决定基的概念(Busch等、Int.Immunol.2，443-451(1990)；Panina-Bordignon等，Eur.J.Immunol.19，2237-2242(1989)；Sinigaglia等，Nature336，778-780(1988)；O’Sullivan等，J.Immunol.147，2663-2669(1991)；Roache等，J.Immunol.144，1849-1856(1991)；Hill等，J.Immunol.147，189-197(1991))。
使用实施例I第V段所述的试验方法确定了前述能结合一种以上DR分子的DR结合肽(HA307-319，TT830-843，CS378-398，MT17-31和HBVnc50-69)的DR结合能力。所得数据(表II，A部分)表明，虽然这些肽的确能结合几种试验的DR分子，但它们不能与其它的结合。例如，HA307-319可高亲合性(IC50％＜50nM)或中等亲合性(50-500nM)地与DR1，DR4w4，DR5，DR7和DR2w2a结合，与DRw53(2.2μM)结合很弱；但并未测得与其它4种DR特异型的结合。HBVnc50-69也可与10种被测DR特异型中的5种(DR1，DR2w2b，DR4w4，DR5和DR2w2a)以高亲合性或中等亲合性结合。TT830-843和CS378-398可与被测DR分子中的4/10(分别为DR1，DR5，DR7，DR2w2a和DR1，DR4w4，DR5，DR7)以高亲合性或中亲合性地结合，MT17-31可与10个DR类型中的3个高亲合性或中亲合性地结合。
总之，虽然前述这些“通用”抗原决定基与几种DR类型发生了结合，在它们的结合能力方面它们并不完全具有交叉反应性，因为被测DR特异型中至多50％可与一种给定的肽发生高至中等亲合性的结合。
实施例3对多种DR等位基因产物具有高亲合性的肽760.50和760.57的开发制成了一系列可与类风湿关节炎相关DR等位基因DR1，DR4w4，DR4w14产物高亲合性结合的肽。为了制备这些肽，我们使用了最早由Jardetzky等，EMBO J.91797-1803(1990)所描述的方法，其中，含有结合MHC的关键侧链的锚残基被插入一由13个残基构成的聚丙氨酸肽中。未授权的专利08/121,101描述了定名为760.50和760.57的这样两种肽，它们在其广泛的DR结合特异性方面具有特殊的意义。当测试其与一组10种纯化的DR分子的结合时发现，总的来说，这些肽与前述的“通用”肽相比，结合时的亲合性更高，特异性更广(表II，B部分)。760.50和760.57均无完全交叉反应性，因为对10种被分析的等位基因中的4种(DR2w2b，DR3，DR52a和DRw53)只测得了低亲合性的结合。表I各种肽抗原决定基与不同DR等位基因产物的结合能力肽 序列Drβ1 DRβ2单位基因产物 单位基因产物肽/限制性元素DR1DR2w2bDR3DR4w4 DR4w1DR5DR7DR52DRw53DR2w4 a 2aAHA307- PKYVKONTLKLAT 5(1)--(2)-- 45 -- 118385-- 2200 45319PHHTALROAILCWGEL 70 9.1 -- 85 505 2636762765 ND(4)211HBVnc50-MTLA 52 -- 3623 -- -- 20 25 -- -- 2069 OYIKANSK FIGITE 17 1820 -- 250 2272154147-- -- 1430TT830- DIFKKIAKMFKARRVFN 13 -- -- -- -- -- 2086266 6538 350843VVNRCS378YSGPLKA EIAORLEDV398MT(Y)1731B760.50 aA(X)AAAKTAAAAa(3 3.1 569 6410 2.8 6.9 6.11929400 560 57760.57)4.5 479 2550 2 3.1 5.478 -- 3300 5aA(X)AAAATLKAAaC906.09 aA(X)VAAATLKAAa0.6114 280 2.6 5.4 2.576 588 932.0906.11 aA(X)IAAATLKAAa0.3819 100 2.8 3.3 2.431 1120 411.3D965.10 aK(X)VAAWTLKAAa0.9140 86 1.1 9.1 9.1167979 7561024.03 aKFVAAWTLKAAa 1.2 27 1470 2 8 18 208797 420 11(1)nM IC50％值(2)短划表示无可测结合(＞10.000nm)(3)x＝环己基丙氨酸(4)ND＝未实验实施例4对多种DR等位基因产物高亲合性结合的肽906.09和906.11的开发为进一步扩展特异性而合成了906.09和906.11肽，其中，在760.57肽的4位引入了一个V或I。如表II的C部分所示，906.09和906.11肽都保持了对DR1，DR2w2a，DR4，DR5和DR7的良好的结合亲合性(0.3-0.8nM)。而且，对分子DR2w2b，DR3，DR52和DRw53分子的结合能力显著提高(10到25倍)(与760.50和760.57相比)，IC50％达20至1200nM。所以，10种被测DR特异性中的9种与这些肽发生了高至中等亲合性的结合，一种，DR52a发生了弱结合。
最后，这些数据说明了与绝大多数，如果不是全部，DR等位基因产物结合的肽的开发成功。由于这种在不同DR分子间的广泛交叉反应方式，我们已确定，906.09和906.11肽是泛DR结合肽。
实施例5还可与DQ3.1和小鼠II类分子结合的泛DR结合肽还为测定泛DR结合肽是否可与其它人II类同型或非人类II类分子结合而进行了试验。更具体地说，就泛DR结合肽与DQ3.1和几种小鼠II类特异型的结合进行了测定，如表III所示。作为参考，在表III的A部分还列出了前述小鼠II类抗原决定基的结合亲合性。所有这些抗原决定基均与它们的相关限制性因子发生了高或中等亲合性的结合，IC50％为20至400nM之间。已发现，通常，760系列肽(表III，B部分)与6种被测等位基因中的5种(IAb，IAd，IEd，IAs，IEk)发生中等亲合性结合，IC50％值为80至700nM。有意义的是，960系列肽(表IIIC部分)与上述等位基因发生了IC50％为10至100nM范围间的明显较高的亲合性结合，而且906.11还与IAk发生了中等亲合性结合。至于与DQ3.1的结合，760.50，760.57，906.09和906.11均被发现可与纯化的DQ3.1分子发生较高亲合性的结合(IC50％为30至120nM)。
作为对照，还测定了760和906肽与人I类分子的结合能力。未测得IC50高达10μM的与纯化的HLA-AL，-A2.1，-A3，-A11和-A24分子的结合(数据未示)。最后，这些数据表明906系列肽是泛II类(但非I类)MHC结合肽。表III各种肽抗原决定基与纯化的DQ3.1和小鼠II类分子的结合能力序列 ClassII等位基因产物DO3.1IAblAdIEdIAsIAklEkAHBVc128-140/IAb TPPAYRPPNAPIL ND(1)255 -- -- -- -- --Ova323-336/IAd，bISOAVHAAHAEINE577(2) 400 110-- 1038 1000 700Lambda rep.12-26/IE YLEDARRLKAIYEKKK --(3)--1100 170-- -- 28d.k HSLGKWLGHPDKF -- ＞3100 -- -- 86 -- --PLP139-151/IAs NTDGSTDYGILOINSR 37507000 1222 8500 -- 20 --HEL46-61/IAkB760.50aA(X)AAAKTAAAAa31 20068815549110,00 127760.57aA(X)AAAATLKAAa94 3771921721200 785260C 5260906.09aA(X)VAAATLKAAa48 31 38 31 1041333 11906.11aA(X)IAAATLKAAa115 28 25 13 98 15414D965.10aK(X)VAAWTLKAAa25 94 7333546133333 3261024.03 aKFVAAWTLKAAa 23 44 1133 3056 1059 -- 3500(1)ND＝未实验(2)nM IC50％ 值(3)短划表示无可测结合(＞10.000nM)
实施例6泛DR结合肽对T细胞增殖的抑制由于它们的变性II类分子结合能力，泛DR结合肽可被作为抑制涉及同种移植排斥反应、变应性应答或自身免疫的T细胞介导的反应的候选药物。所以，对这些肽在体外抑制抗原特异性T细胞增殖应答的能力进行了评价。用实施例I第V段所述的抗原显示抑制试验来进行这种评价。
与它们的MHC结合能力相一致，发现这些肽是由至少6种不同的DR分子(表IV)限定的人T细胞的强效抑制剂。更具体地说，高亲合性结合DR1，DR4w4，DR4w14和DR5的肽760.50和760.57可抑制由以上等位基因产物限定的T细胞增殖，IC50％为1.0至25μM。相反，这些肽只与DR3弱结合，IC50％为2.5至6.5μM，所以它们对DR3限制的T细胞反应抑制很弱(760.57的IC50％为220μM)或根本不抑制(760.50的IC50％＞250μM)。
906.09和906.11肽也可十分有效地抑制DR1，DR4w4，DR4w14和DR5的应答(IC50％为0.5μM-15μM)。正如预料的，具有中等DR3结合能力的906类似物也可抑制DR3限制的抗原显示，IC50％为30μM-60μM。
在同一组的试验中，我们还测试了760和906肽的抑制DR52b限制性应答的能力。由于我们还不能用分子结合试验来测定肽与DR52b分子的结合，所以该试验对我们来说是有意义的。所得数据表明906.09和906.11肽都能抑制DR52b分子中HA307-319克隆1的显示，该抑制具有较好的IC50％值，该值为1-2μM，由此可将其增加为这些肽的泛DR结合能力中的第11个等位基因。
最后，这些肽不能抑制应答多克隆有丝分裂原PHA的HA特异的、DR限制的T细胞克隆的增殖，也不能在最近记述的T细胞拮抗剂试验(De Magistris等，Cell68，525-634(1992))中起抑制作用，在这些试验中，肽在抗原刺激之后(不是同时)加入(数据未示)。这些发现排除了这种可能性，即前述结果可能是由某些760或906肽的某种非特异性细胞毒性引起的。表IV泛DR结合肽对T细胞增殖的抑制由以下等位基因限定的抗原表达实验中的抑制活性肽序列DR1DR3DR4w4DR4w14DR5DR52b760.50aA(X)AAAKTAAAAa4.3(1) ＞250 3.2 2.8 25＞180760.57aA(X)AAAKTLKAAa2.1 220 0.940.79 18 7.5906.09aA(X)VAAATLKAAa0.8831 0.580.43 11 1.6906.11aA(X)IAAATLKAAa1 56 0.740.59 13 1.7(1)μM IC50％
实施例7通过对具有广泛反应性的II类分子结合肽的修饰来产生泛DRT细胞抗原决定基本发明还考虑了泛DR结合肽的不同类型的用途，即将这些肽用于产生泛DR限定的T辅助抗原决定基，这些抗原决定基有助于体液和细胞毒性应答。因为泛DR结合肽中所有潜在TCR接触残基都是丙氨酸，可以推测，由于甲基侧链可能参与的有限的相互作用，引入更大型疏水性带电残基可能提高与T细胞受体的相互作用并由此提高它们的免疫原性。
根据这一推理，我们进一步修饰了906.09泛DR肽。通过在2，5和7位引入大型或带电侧基得到了几种类似物，根据对HA307-319肽的以前的分析，这些位点是潜在的TCR接触残基。相反，那些已知会影响DR结合的位置被保持原状(3，4，8，9和11)。另外，还生成了在3位带有天然氨基酸Phe而不是环己基丙氨酸的类似物。然后测定这些肽被保留的与多种DR等位基因产物结合的能力，再对那些DR结合能力无明显下降的肽测定其诱导免疫应答的能力。下文对其中最好的两种肽，965.10和1024.03的数据进行论述。
当测定这两种肽与HLA DR和小鼠Ia的结合(表II的D部分和表III的D部分)时发现，总的说来，它们保留了亲代肽906.09具有的对大多数DR等位基因产物的高结合力和广泛的反应性。例外的是1024.03，它只与DR3弱结合(1470nM)与DRw53的结合只是中等亲合(420nM)而不是高亲合。而且，965.10和1024.03肽对被测小鼠II类分子的结合能力大大降低。但是，对lAb等位基因产物的良好结合能力被保留，由此可用H-2b小鼠来测试这些肽的体内免疫原性(见下文)。最后，两种肽的良好的DQ3.1结合能力(在25nM范围内)也被保留。
实施例8泛DR结合肽的体外免疫原性就取自正常个体的PBMC中体外激发T细胞应答的能力，进行了泛DR结合肽965.10，和它的两个亲代肽906.09和760.50，及以前所述的天然抗原决定基TT830-843之间的比较。所用方案使用了用自体APC和肽抗原对PBL进行必需的反复激发，并被特别设计成可进行体外初级应答的研究。该方案如下所述，并附有试验结果。
A.试验方案使用根据Manca等，J.Immunol.146，1964-19719(1991)的改进方案体外刺激来自健康供体的PBMC。在Ficoll-Paque(Pharma-cia LKB，Uppsala，Sweden)上纯化外周血单核细胞(PBMC)，并加于24穴组织培养板(Costar，Cambridge，MA)中其中4穴，4×106/穴PBMC。加入终浓度为10μg/ml的肽。培养物在37℃，5％CO2条件下孵育。在第四天，加入终浓度为10ng/ml的重组IL-2。此后每隔三天吸除1ml培养基并补充以含IL-2的新鲜培养基。约在第14天和第28天再用抗原进行两次对T细胞的刺激。在一24穴组织培养板的3穴中用肽(10μg/ml)来刺激T细胞(3×105/穴)，以自体PBMC细胞为抗原显示细胞(2×106辐照过的(7500rad)/穴)。另外，在第14天和第28天，如下测定T细胞的增殖应答2×104T细胞/穴；以1×105辐照过的PBMC/穴为APC；在U形底的96格组织培养板(Costar，Cambridge，MA)上滴定得肽的终浓度为0.01-10μg/ml。如前所述，在第3天进行增殖的T细胞的收获。
B.结果图1显示了三个正常供体的代表性数据。图A至图C显示了两轮刺激后所得的数据，图D至图F显示了第三轮刺激后的数据。如所预计的，亲代肽760.50和906.09在这些试验中的免疫原性很弱。两种肽都不能在两轮刺激后诱导明显的(＞10,000cpm)应答。在第三轮刺激后，760.50在三供体之一中诱导了应答。天然“通用”抗原决定基TT830-843也不能在所有三个供体中产生中度明显的应答。与这些弱应答相反，所有三个供体仅在两轮刺激后均对修饰过的泛DR肽965.10产生了强烈应答。
图2A和图2B概括了全部所得的体外刺激作用数据(分别对应于第二次刺激和第三次刺激)。二次体外刺激后(图2A)，肽965.10是唯一能在大多数供体中(9/12)明显刺激T细胞的肽。TT830-843能在少数个体中(3/12)产生应答，但760.50和906,09均不能刺激任何应答(0/3)。通过第三次刺激(图2b)，965.10在12个被测供体的11个中产生了明显应答，TT830-843此时可在大多数供体(7/12)中产生明显应答；760.50在三个供体之一中诱导了应答，而906.09在三个被测供体中均不能刺激应答。
965.10肽早在二次刺激就具有扩增特异性T细胞群的能力，加上它在三次刺激后实际上在所有供体中产生了明显应答的能力表明了该肽与TT830-843，760.50或906.09相比有优良的免疫原性。
实施例9泛DR抗原决定基在小鼠体内的免疫原性在C57BL/6J(H－2b＋)小鼠体内试验了760.50、965.10和1024.03肽的体内免疫原性。
为了进行这些试验，在尾根给C57BL/6J(H－2b＋)小鼠皮下注射滴定剂量的各种肽(0.000125、0.0025、0.05、1和20μg/鼠)的100ul体积PBS/CFA(Difco，Detroit，MI)溶液。在第10天，收集各组(三鼠/肽剂量)的腹股沟淋巴结和主动脉侧淋巴结，混合并均化成单细胞悬溶液。将细胞洗涤两次后加在96穴微效价组织培养板上(1×106细胞/穴)。加入对数剂量肽滴定的免疫肽(0.01至100μg/ml)并如下进行标准的三天T细胞增殖试验。
在这些试验中，将非天然抗原决定基的活性与另两种另外的以前确定的天然IAb限定的抗原决定基Ova323-336和HBV核心128-140进行比较。这两种天然抗原决定基的结合亲合性低于(3至14倍)965.10(表III，A部分)。将不与IAb明显结合的TT840-843肽(数据未示)作为阴性对照。用不同量的肽(0.000125至20μg/鼠)的CFA溶液免疫各组鼠。免疫十天后收集脓肿的淋巴结并用不同剂量的抗原进行体外刺激。
如图3所示，发现，与其不能与IAb结合相一致，TT830-843不能产生特异性T细胞增殖应答。已知IAb限定的辅助抗原决定基Ova 323-336(图3，板块B)和HBVc125-140(图3，板块C)在两种用于免疫的最高肽剂量(1和20μg/鼠)下诱导了25,000至70,000cpm范围的应答。泛DR抗原决定基965.10(图3，板块D)和1024.03(图3，板块E)用低至0.05μg/鼠的免疫有效剂量激发了最强的应答幅度达100,000至150,000cpm。相反，肽760.50(图3，板块F)仅勉强具有免疫原性，只能在最高测试剂量(20μg/鼠)下诱导很弱的增殖应答。这些结果表明泛DR抗原决定基965.10和1024.03不论在体内及体外均具有高效辅助抗原决定基的功能。结合人免疫原性数据，它们也表明在潜在的TCR接触位置上的“免疫决定基”氨基酸残基的存在是产生强烈T细胞应答的重要因素。
实施例10泛DR肽行使小鼠体内CTL诱导辅助抗原决定基的功能通常假设，诱导T细胞增殖应答的能力是肽抗原决定基辅助能力的一个标记。我们试图通过测定965.10肽在产生CTL应答中提供帮助的能力来证实这点。用如下述方案进行CTL诱导试验。
A.CTL诱导方案通过在尾根皮下注射溶于PBS/5％DMSO并乳化在IFA(Dif-co，Detroit，MI)中的CTL和辅助抗原决定基混合物来免疫3至6个一组的C57BL/6J小鼠。11天后，将鼠杀死并制取脾细胞。加入被肽包裹的同源成脂多糖(LPS)细胞体外刺激脾细胞(3×107/10ml/T25烧瓶)。成LPS细胞在使用前72小时由重悬于含LPS(W Ecoli055B5)(Difco，Detroit，MI)(25μg/ml)和硫酸葡聚糖(Pharmacia，Uppsala Sweden)(7μg/ml)的培养基中的脾细胞中制取。准备总体积30ml浓度为1.5×106脾细胞/ml的培养物，并在T75烧瓶中于37℃，5％CO2条件下孵育72小时。
然后，对细胞进行辐照，洗涤并重悬成30-40×106细胞/ml。取每份1ml的悬液与100μg/ml的CTL抗原决定基在37℃，5％CO2条件下孵育1小时。将细胞洗涤一次后重悬为10×106细胞/ml。向合适的效应剂细胞中加入每烧瓶1ml体积的悬液并孵育6天。然后用EL4(b单倍体型)靶细胞(3×106细胞/ml)测定细胞毒性，这些细胞在51Cr铬酸钠和CTL抗原决定基肽存在下培养于37℃。60分钟后，将细胞洗涤3次并重悬在含10％FCS(Irvine Scientific，SantaAna，CA)，2mM L-谷氨酰胺(Irvine Scientific)，50μg/ml的庆大霉素(Irvine Scientific)和5×10-5Mβ巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)的RPMI-1640(Bio Whittaker，Walkersville，MD)中。然后，将1×10451Cr标记过的靶细胞加入U形底的96穴测试板中的效应剂细胞滴定液中，最终体积为200ul。在37℃，5％CO2中培养6小时后，每穴取0.1ml一份的上清液在Micromedic gamma计数器中进行放射性测定。由下式测定比溶胞率％比溶胞率＝100×(实验释放—自发释放)/(最大释放—自发释放)。数据的表示单位为溶胞单位/106效应剂细胞。一个溶胞单位任意定义为有或无肽存在时，在6小时内裂解1×14451Cr标记的靶细胞中的30％所需的淋巴细胞数。
我们用10nm剂量的Kb限定的(Carbonan和Bevan，J.Ewp.Med.169603-612(1989))脂化的CTL决定基(Ova257-264)，和不同量的IAb限定的辅助抗原决定基Ova323-336(Wall等，J.Im-munol.1524526-4536(1994))，HBV核心128-140，或965.10肽一起来免疫C57BL/6J鼠。11天后，用CTL抗原决定基Ova257-264体外刺激脾细胞，并将细胞培养6天，然后在一标准的6小时铬释放试验中进行测试。CTL靶细胞包括Ova257-264脉冲的EL4细胞和Ova257-264转染的EG7细胞。
B.结果表V显示了所得结果。泛DR抗原决定基965.10诱导的CTL应答被发现是剂量依赖方式的，当用5μg/小鼠的965.10肽和Ova257-264CTL抗原决定基一起注射时可测得最优的307溶胞单位。相反，不论就其辅助效应(分别提高四倍和三倍)还是诱导最优辅助活性所需的剂量(100μg/鼠)来说，Ova323-336和HBV核心128-140的辅助活性弱得多。
表V各种肽抗原决定基诱导CTL的辅助因子活性T辅助肽辅助肽的CTL应答最优剂量(mg/鼠) (△溶胞单位/E6细胞)- - 12+/-2OVA323-336 100 50+/-5HBV核心128-140 100 35+/-10965.10 5 307+/-55比溶胞率为按实施例10中所述计算而得。给出的是两个独立试验的代表性数据。
提供以上实施例是为了说明本发明而不是限定其范围。本发明的其它改变形式对本专业的一般技术人员来说是显而易见的，并被包含在所附的权利要求中。本文引用的所有出版物、专利和专利公开均被引作参考。
权利要求
1.一种组合物，其特征在于，它含有一种由2个D-氨基酸和11个L-氨基酸构成的肽，所述肽由氨基端向羧基端的结构式为R1-R2-R3-R4-R5，其中R1是一个D-氨基酸，其后是丙氨酸或赖氨酸；R2选自环己基丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；R3是3或4个氨基酸，其中每个氨基酸各自选自丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸；R4选自苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸、赖氨酸-苏氨酸和色氨酸-苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸；R5由2或4个氨基酸构成，其后为一个D-氨基酸，其中2或4个氨基酸中的每一个各自选自丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征还在于，其中R1是一个D-丙氨酸，其后是丙氨酸或赖氨酸；R2是环己基丙氨酸或苯丙氨酸；R3是3或4个氨基酸，其中每个氨基酸各自选自丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；R5由2或4个丙氨酸构成，其后为一个D-丙氨酸。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征还在于，其中的肽选自aAXAAAKTAAAAa、aAXAAAATLKAAa、aAXVAAATLKA-Aa、aAXIAAATLKAAa、aKXVAAWTLKAAa和aKF-VAAWTLKAAa，其中的a是D-丙氨酸，A是丙氨酸，X是环己基丙氨酸，K是赖氨酸，T是苏氨酸，L是亮氨酸，V是缬氨酸，I是异亮氨酸，W是色氨酸，F是苯丙氨酸。
4.一种药物组合物，其特征在于，它含有一种药用载体和根据权利要求1所述的肽。
5.一种含有CTL诱导肽和T辅助肽的组合物，其特征在于，其中的T辅助肽是根据权利要求1所述的肽。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征还在于，其中的CTL诱导肽是乙酰化、软胎酰化或用某种脂肪酸酰化的。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征还在于，其中的CTL诱导肽与T辅助肽连接而形成CTL/T辅助肽复合物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征还在于，其中的CTL/T辅助肽复合物被连接在某种载体上。
9.根据权利要求6所述的组合物，其特征还在于，其中的CTL诱导肽通过一间隔分子与T辅助肽连接。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征还在于，其中的间隔基是Ala-Ala-Ala。
11.一种抑制病人体内T细胞活化作用的方法，其特征在于，该方法包括给病人使用治疗有效量的药物组合物，该组合物含有药用载体和由约4至20个残基构成的肽，该肽能结合MHC分子上由DR位点的基本上所有等位基因编码的抗原结合位置。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征还在于，其中的肽是根据权利要求1所述的肽。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征还在于，其中的肽是根据权利要求3所述的肽。
14.一种在病人体内诱导激活T细胞克隆的方法，其特征在于，该方法包括给病人使用治疗有效量的药物组合物，该组合物含有由药用载体和由约4至20个残基构成的肽，该肽能结合MHC分子上由DR位点的几乎所有等位基因编码的抗原结合位置。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征还在于，其中的肽与CTL诱导肽结合。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征还在于，其中的肽是根据权利要求1所述的肽。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征还在于，其中的肽是根据权利要求3所述的肽。
全文摘要
本发明提供了在病人体内抑制或诱导T细胞活化作用的组合物和方法。方法包括给病人使用治疗有效量的药物组合物，该组合物含有药用载体和由约4至20个残基构成的肽，该肽能结合MHC分子上DR位点的等位基因编码的几乎所有抗原结合位置。这些肽被称为泛DR结合肽。可将这种泛DR结合肽用于抑制与自身免疫、同种移植排斥反应和变应性应答等免疫病理有关的免疫应答。这种肽也可与CTL肽组合使用以强化CTL应答。
文档编号C07K14/00GK1135181SQ94194128
公开日1996年11月6日 申请日期1994年9月14日 优先权日1993年9月14日
发明者A·塞特, F·C·A·加埃塔, H·M·格雷, J·悉尼, J·L·亚利山大 申请人:Cytel有限公司