细胞介导的免疫应答检验及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明主要涉及用于诊断、监视或治疗的方法和试剂盒，其测量针对体外试剂(原 文为"agent in vitro"，也可称为"体外因子"）的细胞应答性。具体地，本发明提供用于测 量从受试者收集的小样品全血中的针对抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的系统。该方法 和试剂盒将在全血样品分析中找到广阔应用，所述全血样品具有包括来自婴儿和儿童或其 它受试者的一系列不同体积，其中所述样品体积是受限的或其中需要小样品体积。
【背景技术】
[0002] 本说明书中作者引用的出版物的参考书目集中在说明书的末尾。
[0003] 本说明书对任何之前出版物(或从其衍生的信息），或任何已知的事物的引用，不 是并且也不应该看作是之前出版物(或从其衍生的信息），或公知常识的已知事物形成为本 说明书涉及到努力方面的承认或供认或任何形式的暗示。
[0004] 免疫应答的功能在于消除入侵的病原体或毒素。在某些情况下免疫应答对有机体 是非常破坏性的，并且存活依赖于免疫系统从非自体区分自体的能力。例如当免疫系统对 自体过度应答时产生自体免疫疾病。某些免疫应答针对相对无害的非自体分子。例如哮喘 和枯草热，涉及对非自体的免疫应答，其中所述免疫应答比病原因子(causative agent)更 衰弱。通常，先天的免疫系统筛选出针对非病原性有机体的应答，并且有助于防止针对此类 无害试剂的适应性免疫应答。
[0005] 适应性免疫应答由淋巴细胞例如执行抗体应答的B淋巴细胞或执行细胞介导的应 答的T淋巴细胞来执行。B淋巴细胞产生有助于使病原体和毒素失活的免疫球蛋白。T细胞直 接与呈递于宿主细胞表面上的非自体分子(抗原)反应，其与提供"自体"分子指令系统的主 要组织相容性(MHC)分子有关。在两种情况下，产生对非自体分子的特定表位特异的细胞应 答，并提供免疫应答网络和免疫效应子分子。
[0006]因此，用于诊断或监视感染或评价受试者建立(mount)针对非自体的免疫应答的 能力的一种方法为确定受试者是否已经建立了针对抗原刺激的免疫应答。由于T细胞应答 包括产生效应子T细胞，所述效应子T细胞能够对抗原应答或能够被刺激来通过产生免疫效 应子分子对抗原应答，可以在体外测定应答于特定抗原的这些分子的产生，作为细胞介导 的免疫应答的测定。然而，由于非自体抗原性分子通过抗原呈递细胞呈递至T细胞，存在复 杂的和必须在体外成功地发生的细胞与分子的相互作用以产生用于检测的充分的免疫效 应子分子。
[0007] 用于检测细胞介导的免疫应答的大多数体外方法包括使用各种分离技术从全血 中纯化外周血单核细胞。此类检验包括铬释放检验、细胞毒性检验、MHC I类四聚体检验、用 于IFN-y或其它细胞因子的检验，其中ELISP0T提供良好的实例。ELISP0T方法固定抗原呈 递细胞，并且已经用于检测应答于抗原性刺激产生特定细胞因子的T细胞的数量。
[0008] 如果使用全血，通常将其稀释于培养基中以稀释红细胞，这被认为降低该检验的 敏感性。使用未稀释全血的管内细胞介导的免疫应答检验描述于国际公开No.W0 2004/ 042396,申请人为Cellestis Limited，在此将其全文引入以作参考。国际公开No.WO 2004/ 042396公开了使用血液收集管以用于样品与抗原和简单糖一起孵育，并且使用该试管系统 与其中将血液转移到24-孔微量滴定板并在24-孔微量滴定板中孵育的检验相比，显示增强 的敏感性。
[0009] 对于人类和牲畜动物中的全血检验而言，至少从受试者中取3毫升血液，以提供充 足的材料来进行细胞介导的免疫应答检验。通常通过静脉血取样、借助于经常在真空下的 用针刺入收集血管来取该量。
[0010] 检测免疫效应子分子的各种方法，例如酶联免疫吸附检验(ELISA)、放射免疫检验 (RIA)、或血细胞计数法可以使用小体积，然而，对于进行体外细胞介导的免疫应答检验的 抗原性刺激阶段的改进系统，在本领域存在需要。具体地，需要允许以小体积血液进行的全 血测试的方法，例如通过外周毛细血管取样获得的那些。筛选小样品血液的能力将极大地 便利儿童或其它血液可能受到限制或难于获得的受试者的取样，并且允许无需静脉采血的 血液取样，其通过使用毛细血管血例如通过拇指、足跟、耳垂或其它方便位点的点刺测试 (prick test)获得的那些，并且用于测试在单次小容量抽血中（single blood draw of low volume)的包括有丝分裂原和半抗原刺激物的多种或一系列抗原。
【发明内容】
[0011] 本发明部分基于以下令人惊奇的发现:可以在来自受试者的非常小体积的全血中 产生和检测细胞免疫应答，并且其不必须为静脉或动脉血。这意味着收集血液用于进行细 胞介导的免疫应答的检验可以使用，例如点刺取样外周毛细血管血液来实现，其通常产生 约1毫升或更少的体积。此外，该非常小的全血样品可以就它们产生免疫效应子分子的能力 来测试，便于从小样品中多次测试。
[0012] 在一个广泛的实施方式中，本发明提供用于在来自受试者的样品中测定细胞介导 的免疫应答的方法，其中所述样品包括被试剂(agent)例如抗原刺激后分泌免疫效应子分 子的细胞。在一个特定实施方式中，本发明提供用于在从受试者收集的全血样品中测定细 胞介导的免疫(CMI)应答的方法，其中所述全血样品包括被抗原刺激后能够产生免疫效应 子分子的免疫系统的细胞，所述方法包括：（i)使来自外周毛细血管的全血样品或来自受试 者动脉或静脉的低于〇.5mL全血在基本上无需稀释样品下在孵育容器中与抗原一起孵育； 和(ii)检测或测定免疫效应子分子或能够产生效应子分子的核酸分子的存在，所述效应子 分子指示受试者建立细胞介导的应答的能力。
[0013] 在另一实施方式中，该方法包括：（i)将来自外周毛细血管的全血样品或来自受试 者动脉或静脉的低于〇. 5mL的全血收集到容器；（ii)使全血与抗原和抗凝血剂一起孵育;和 (iii)检测或测定免疫效应子分子或能够产生免疫效应子分子的核酸分子的存在，所述免 疫效应子分子指示受试者建立细胞介导的应答的能力。
[0014] 该方法将在选择用于治疗患有例如以下疾病的受试者的合适的治疗策略中发现 广泛应用:炎性疾病状况，病原性感染例如由细菌、病毒、寄生虫或真菌病原体引起的那些， 自体免疫失调，免疫缺陷，过敏或癌症或发展此类疾病的倾向。
[0015]在优选的实施方式中，该方法包括收集和/或孵育毛细血管血液样品，或用毛细管 取样装置从受试者收集样品。
[0016]在某些实施方式中，该方法包括：在样品的形状包括已经被优化的尺寸 (dimension)的条件下将样品与试剂一起孵育。在某些实施方式中，就特定受试者或受试者 群优化所述尺寸。在其它实施方式中，就特定细胞样品优化所述尺寸。在某些实施方式中， 尺寸为样品的高度。在另一实施方式中，优化体积。在进一步的实施方式中，还优化外周血 单核细胞(PBMC)或其它免疫细胞的浓度。所述"优化"是指与其他测试的值或范围相比所选 尺寸值或范围提供最佳的细胞应答。这样，在某些实施方式中，所述样品包括使用本文公开 的方法已经预选择来提供最佳细胞应答的尺寸。
[0017] 如在实施例1中所列举，标准缀合物联免疫检验测定（standard conjugate-linked immunoassay testing)证明： 在少至 0 ? 5mL，0 ? 4mL，0 ? 3mL，0 ? 2mL和0 ? lmL的血液孵 育总体积中产生IFN-y。描述于实施例2至4的进一步的实验显示:孵育少至20iU和/或具有 4mm样品高度的血液样品能够产生充分的免疫效应子分子以用于诊断检验。最佳结果在约 6mm至约12mm或约5mm至约18mm以及中间值的样品高度下获得，而不依赖于收集或孵育的样 品体积。
[0018]因此，在某些实施方式中，孵育容器适于保持样品的最佳形状，其中所述形状具有 选自以下一种或两种或更多的尺寸：（i)最大圆直径低于约6mm; (ii)高度至少约4mm至6mm， 最大高度约12mm至20mm;或（i i i)体积低于0.5mL，任选地低于约400iil。
[0019]在另一方面，本发明提供用于在来自受试者的全血样品中测定针对试剂(agent) 的细胞介导的应答的试剂盒，所述试剂盒包括:与能够刺激免疫细胞分泌免疫效应子分子 的试剂分开或一起容纳的收集容器，以及进一步任选地包括使用说明书。在某些实施方式 中，将该样品从收集容器转移到一个或多个用于与抗原一起孵育的容器，并且所述试剂盒 包括一个或多个收集容器和一个或多个孵育容器。方便起见，收集容器包括抗凝血剂。在其 它实施方式中，孵育容器包括抗原和任选的简单糖例如右旋糖。
[0020] 因此，本发明提供用于测定从受试者收集的全血样品中的细胞介导的应答的试剂 盒，所述试剂盒以多组分形式包括：（i)一个或多个收集和/或孵育容器，其适合容纳或孵育 外周毛细血管全血样品或低于〇. 5mL的静脉或动脉血；（ii)一种或多种测试抗原，用于分析 针对其的体外应答，以及任选的对照抗原；（i ii)反应试剂(reagents )，用于测定免疫效应 子分子的存在或水平的升高；（iv)任选的一套包括本文所述方法之一的说明书。
[0021] 在某些实施方式中，孵育容器适于保持样品的最佳形状，其中所述形状具有选自 以下一种或两种或更多的尺寸：（i)最大圆直径低于约6mm; (ii)高度至少约4mm至6mm，最大 高度约12mm至20mm;或（i i i)体积低于0.5mL，任选地低于约400iil。
[0022] 说明书，例如可以包括收集全血和将血液在收集/孵育容器中混合以将抗凝血剂 与该血液混合的说明。在其它实施方式中，说明书包括将全血样品与抗原和与任选的对照 抗原或有丝分裂原一起孵育的说明。在其它实施方式中，说明书包括将孵育容器离心和收 集血浆的说明。在某些实施方式中，说明书包括检测血浆中的免疫效应子分子的说明。
[0023] 在某些实施方式中，标记收集容器以将样品高度确定为约12mm。在某些实施方式 中，试剂盒包括多个标记的相同和/或不同尺寸的收集容器。在某些实施方式中，试剂盒包 括毛细管取样装置。在另一实施方式中，试剂盒包括一种或多种用于诊断的测试抗原和任 选的作为对照抗原的有丝分裂原，以用于分析针对其的体外应答。任选地，试剂盒进一步包 括适于测定免疫效应子分子或其编码分子的存在或水平升高的反应试剂，包括阳性和阴性 对照。在某些实施方式中，试剂盒进一步包括适于进行用于免疫效应子检测的检验的反应 试剂。在一种实施方式中，所述检验为用于IFN-Y、或下游效应子分子的检验。在优选的实 施方式中，反应试剂包括用于检测IFN- y，TNF或GM-CSF的抗体缀合物。在示例性的实施方 式中所述抗体缀合物检测IFN-y。此类检验包括例如基于ELISA或ELISPOT的检验或本领域 已知的类似检验。在另一实施方式中，所述检验为用于编码免疫效应子分子，例如IFN-y的 RNA的逆转录-扩增检验。此类检验中本领域是已知的，并且描述于例如Sambrook， Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd Edition,CSHLP，CSH，NY，20〇]^PIAusubel (Ed)Current Protocols in Molecular Biology,5th Edition,John ffiley&Sons,Inc,NY, 2002〇
[0024]在另一方面，本发明包括可以自动化或半自动化的方法、计算机程序、计算机产 品、计算机以便于从受试者检验的结果的解释。
[0025]上述简述不是并且不应以任何形式看作本发明所有实施方式的穷举列举。
【附图说明】
[0026] 图1为用于执行由存储介质编码的指令的系统的图解表示。
[0027] 图2为磁性存储介质的截面的图解表示。
[0028] 图3为光学可读数据存储系统的截面的图解表示。
【具体实施方式】
[0029]除非另外指出，本文所用的所用科学技术术语具有与本发明所属领域的技术人员 通常理解相同的含义。虽然与本文所述类似或等同的任何方法或材料可用于本发明实践和 测试中，但还是描述优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语如下定义。
[0030]术语〃约〃规定前述术语数值中的一些变化或校正。其涉及数量(quant i ty )、体积、 水平、值、百分比、尺寸、大小或量(amount)，其可以相对于列举的术语以多至35% ,30%， 25% ,20%，15%，10% ,5% ,4%或3%变化。这样，术语〃至少约6臟〃包括4mm或5臟以及6臟 和大于6mm的高度，而〃约12mm 〃包括13mm, 14mm, 15mm或16mm或小于12mm的高度。此外，术语 覆盖单位数值的分数部分，例如6.5mm或6.9mm等。在优选的实施方式中，变化是较小的，并 且限制至数值中的10 %或15 %的变化。
[0031]本文使用冠词"a"和"an"(对