一种检测鸡固有免疫相关受体的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽医生物技术领域的检测方法，特别涉及检测鸡固有免疫细胞受体的 荧光定量PCR试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 固有免疫已逐渐成为兽医免疫学研究中一个活跃的领域。Toll样受体 3 (Toll-like receptor 3, TLR3)、Toll 样受体 7 (Toll-like receptor 7, TLR7)和黑色素 瘤分化相关抗原5(Melanoma Differentiation-Associated protein 5，MDA5)是鸡体识别 RNA病毒感染的主要模式识别受体，它通过激活相应配体，启动固有免疫通路的信号传导， 进而诱导产生干扰素和促炎性细胞因子，最终促进抗病毒物质的产生。
[0003] 检测病毒感染或疫苗免疫对鸡固有免疫信号通路的影响，对于深入了解病毒的致 病机制，研究开发鸡用新型疫苗、免疫增强剂以及抗病毒药物，均具有非常重要的意义。荧 光定量PCR方法具有敏感、快速、实时和所需检测样品少等优点。如果能够开发出商品化的 荧光定量PCR系列试剂盒，用于鸡固有免疫信号通路中相关受体、配体、细胞因子及效应分 子的标准化检测，将为相关的科学研究和临床应用带来极大的便利。
[0004] 目前尚无商品化的检测鸡固有免疫细胞受体TLR3, TLR7和MDA5水平的试剂盒。 荧光定量PCR检测鸡TLR3, TLR7和MDA5表达水平的技术，仅被部分研究型实验室所掌握。 而且各实验室所采用的引物、反应体系及循环参数各不相同，导致了实验结果间的不可比 性。四川农业大学的汪铭书等公开了"检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂盒及其应 用"（申请号201410664799. 4)的专利申请，其中包含了检测北京鸭TLR3和TLR7基因转录 水平的检测方法。但是，固有免疫系统具有严格的动物种属的特异性，检测鸭固有免疫基因 的方法无法用于鸡固有免疫相关基因水平的检测。而且，其技术仅能用于鸭相关基因的相 对定量检测，不能用于绝对定量分析。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种鸡TLR3, TLR7和MDA5基因转录水平的SYBR Green I荧光定 量PCR试剂盒及其应用。本发明提供的检测方法灵敏度高、特异性强、线性浓度范围广、重 复性好、操作简便及省时，可用于多种样品类型鸡免疫细胞受体的绝对或相对定量检测。
[0006] 为了实现该目的，本发明设计和筛选了三对特异性引物，从新城疫病毒感染的鸡 胚尿囊液中分别扩增出鸡TLR3，TLR7和MDA5基因片段。然后，分别制备了这三个基因的质 粒标准品，用于荧光定量PCR反应条件的优选和标准曲线的建立。通过实际样品的检测应 用评估，表明发明所提供的试剂盒可以用作鸡正常生理状态、疫苗免疫以及疾病状态下，多 种样品类型中鸡TLR3, TLR7和MDA5基因的绝对或相对定量检测。
[0007] 本发明具体的技术方案如下：
[0008] 1.提供了检测鸡TLR3，TLR7和MDA5基因的荧光定量PCR特异性引物。本发明使 用Primer Premier 5. 0设计特异性PCR引物，经过多对引物的筛选、得到扩增效率和特异 性好的三对特异性引物。其核苷酸序列分别为：
[0009] 引物对一：
[0010] TLR3 Chicken-U :5,-ACATTTGTAACACCCCGC-3，；
[0011] TLR3 Chicken-L :5,-CATAGGCGTCATAATCAA-3'
[0012] 预计扩增片段大小为255bp。
[0013] 引物对二：
[0014] TLR7 Chicken-U :5,-CTGGCCACAGATGTGACC-3，；
[0015] TLR7 Chicken-L :5'-TTCAACTTGGCAGTGCAG-3'
[0016] 预计扩增片段大小为215bp。
[0017] 引物对三：
[0018] MDA5 Chicken-U :5'-AGAAGTGTCTGGAGCTGG-3' ；
[0019] MDA5 Chicken-L :5'-CGACTCTCAATAACAGTCT-3'
[0020] 预计扩增片段大小为70bp。
[0021] 2.提供了鸡TLR3, TLR7和MDA5质粒标准品。将新城疫病毒感染11日龄的SPF鸡 胚。在病毒感染24小时后收取鸡胚尿囊液，应用Trizo 1法提取其总RNA，然后使用随机引物 将RNA反转录为cDNA。分别使用上述三对引物进行PCR，扩增鸡TLR3, TLR7和MDA5的基因片 段。目的长度的扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与PUC57载体连接，转化大肠杆菌。选 择疑似阳性克隆进行测序。测序结果分别与鸡TLR3的基因序列（GenBank Accession No.: KM486593)，鸡 TLR7 的基因序列（GenBank Accession No. :KM486601)和鸡MDA5 的基因序列 (GenBank Accession No. :AB371640)进行比对。测序正确的质粒分别命名为pUC57-TLR3 Ch，pUC57-TLR7 Ch 和 pUC57-MDA5 Ch。
[0022] 3.本发明提供的检测鸡TLR3, TLR7和MDA5的试剂盒，包括质粒标准品（阳性模 板对照），浓度为10 y M的上游引物溶液，浓度为10 y M的下游引物溶液，2 X荧光定量PCR 预混液（Master Mix)，和荧光定量PCR缓冲液（Buffer)。
[0023] 4.本发明可以用于检测多种类型的样品中鸡TLR3，TLR7和MDA5的基因转录水平。 样品类型包括但不限于：鸡抗凝全血、鸡脾脏淋巴细胞、鸡外周血淋巴细胞、鸡血清以及鸡 胚尿囊液等。
[0024]5.本发明提供的检测鸡TLR3, TLR7和MDA5的荧光定量PCR方法，包括以下步骤，
[0025] a.待检样品cDNA的制备：
[0026] 首先提取待检样品（如：鸡抗凝全血、鸡脾脏淋巴细胞、鸡外周血淋巴细胞、鸡血 清以及鸡胚尿囊液）的RNA。然后，使用随机引物进行反转录反应，制备样品的cDNA。
[0027] b?配制PCR反应体系：
[0028] PCR扩增反应的体系均为20 y 1，包括：2X荧光定量PCR预混液10 y 1，10 yM上游 引物1 y 1，10 y M下游引物1 y 1，荧光定量PCR缓冲液2 y 1，DNA模板2 y 1和ddH20 4 y 1。
[0029] c?设定PCR扩增反应的程序为：
[0030] 95°C预变性2. 5分钟；95°C 7秒，55°C 10秒，72°C 15秒扩增45个循环，每个循环 结束时检测荧光；熔解曲线分析为95°C 15秒，60°C 50秒，95°C continuous ;最后37°C 30 秒结束。
[0031] d?结果分析：
[0032] 调整荧光定量PCR的扩增基线和阈值设定，以阈值线不低于正常阴性对照扩增 曲线的最高点为准。在阳性对照（质粒标准品）为有效扩增，无模板对照（Non-template control, NTC)无扩增的前提下，读取待测样品的Ct值，进行结果判定：Ct值大于40的样本 为阴性结果；Ct值小于或等于40的样本为阳性结果。
[0033] 根据单一样本的Ct值，可以对其进行绝对定量。根据两个或以上样本的Ct值，可 以对这些样品进行相对定量分析。
[0034] 本发明的有益效果为：
[0035] 1、用途多：本发明所建立的检测方法可用于多种样品类型（鸡抗凝全血、鸡脾脏 淋巴细胞、鸡外周血淋巴细胞、鸡血清和鸡胚尿囊液等）中鸡TLR3, TLR7和MDA5水平的绝 对定量或相对定量检测。该方法可应用于病毒的致病机制的研究，鸡用新型疫苗、免疫增强 剂以及抗病毒药物的研究与开发。本发明提供的方法可以系统的检测与鸡RNA病毒感染相 关的3种固有免疫模式识别受体。相比检测单一受体，可以更好的认识鸡体固有免疫应答 的机制。
[0036] 2、敏感度高：利用本发明所建立的方法检测低至单个拷贝的鸡TLR3, TLR7和MDA5 基因时，其扩增的Ct值小于40。
[0037] 3、特异性强：本发明所建立的方法仅特异性的扩增相应基因，表现为单一的熔解 曲线峰值。且对多个对照基因均无扩增。
[0038] 4、检测线性范围广：利用本研究建立的方法进行鸡TLR3, TLR7和MDA5基因的检 测，从低至几个拷贝至10s个拷贝均有明显的指数扩增。
[0039] 5、重复性好：区内和区间重复试验均取得满意的结果。
【附图说明】
[0040] 图1为鸡TLR3质粒标准品（IX 102~10 9个拷贝，由右及左）的扩增曲线。
[0041] 图2是鸡TLR3质粒标准品（1 X 102~10 9个拷贝）的熔解曲线。
[0042] 图3为鸡TLR3质粒标准品的荧光定量PCR的标准曲线。其中纵坐标为反应的Ct 值，而横坐标为阳性模板浓度的对数值。图中各检测点（圆点）对应的模板浓度分别为 6. 9X 101~10 8个拷贝（由左及右）。
[0043] 图4为鸡TLR7质粒标准品（IX 102~10