荧光定量检测mbl的免疫层析试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[000引甘露（聚）糖结合凝聚素，英文名；mannan-binding lectin,缩写为MBL。甘露 (聚）糖结合凝聚素是肝脏产生的一种血清C型凝集素，可W与甘露糖结合的急性期蛋白， 可W调理带甘露糖的病原体，激活补体系统，参与固有免疫应答、激活补体、调节炎症、促进 调理吞瞻和清除调亡细胞。是免疫系统的重要成分之一，在免疫防御中发挥多重作用。当 适应性免疫系统尚不成熟（幼儿期）或已被抑制（例如器官移植后，或癌症化疗期间）通 常M化的缺乏可能导致感染易感性的增加。M化不足与自身免疫性疾病有重要的相关，如系 统性红斑狼疮，类风湿关节炎，预后较差的囊肿性纤维化和肿瘤放化疗后的免疫受损性疾 病等。M化组成了机体先天免疫的第一道防线，在病原微生物感染早期，特异性抗体形成之 前，M化就已经通过其"糖基识别域"结合病原微生物。因此，检测人血清或血浆中的甘露 糖结合凝聚素（MBL)含量，监测并评估M化血清浓度的基础值，W及治疗和干预后的M化水 平，对于整合临床的诊断与治疗，早期发现高患病风险的个体，正确指导并及时调整临床治 疗方案，实现疾病的个体化治疗等方面具有重要意义。
[0003] 关于对MBL的检测手段，目前国内外存在的检测方法包括MBL蛋白浓度检测、MBL 生物学功能测定和M化基因型检测等，但只有对M化蛋白进行浓度检测是唯一直接的检测 手段。
[0004] M化生物学功能的检测：可间接反映M化含量。目前，检测M化生物学功能的方 法主要是检测M化对吞瞻细胞吞瞻过程的调理作用W及对补体系统的活化作用，即补体的 M化激活途径。调理吞瞻实验操作非常繁琐，而且只能进行半定量检测，目前很大程度上已 被补体活化实验所代替。MBL的补体活化作用最常用溶血实验检测，也可用ELISA法检测 M化补体活化途径中的中间产物在固相载体上的沉积情况，W间接反映M化的功能活性。但 是，由于补体的活化还具有经典途径和替代途径，因此补体活化实验在检测前必须先对补 体活化的经典途径和旁路途径进行充分抑制，所W操作也比较繁琐，对结果准确度的影响 因素也较多。
[0005] M化基因型的检测；可间接估计M化的水平。目前，大部分检测M化基因型的方法 均建立于PCR(聚合酶链反应）的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现。早期 实验室内部采用的限制性片段长度多态性法、扩增阻碍突变系统和异源双链分析法非常复 杂、费力，费用相对昂贵，准确性差。20世纪90年代后期发展的基因巧片技术自动化程度 高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大提高，但是成本相对较高，只限于实验 室研究，难W临床大范围推广。基因型研究的局限在于其不能证明M化浓度与疾病之间的 关系。
[0006] 血清M化浓度的检测：唯--种可直接检测M化浓度的方法。MBL蛋白抗原检测方 法目前常用的有甘露聚糖捕捉测定法、抗体捕捉化ISA法和酶联凝集素免疫吸附测定法， 但都没有成为试剂盒。国际上用于临床诊断的M化检测试剂仅有丹麦BioPorto公司一家 研制的试剂盒，原理是用针对MBL CRD (甘露聚糖结合凝集素糖识别域）的单克隆抗体作 为捕捉抗体，生物素标记相同的抗体作为检测抗体，HRP-SA (辣根过氧化物酶标记的链霉亲 和素）作为放大显色系统，该方法检测所需时间较长4小时、操作较繁琐，灵敏度可检测到 0. 5ng/ml。但需要采用自动化进口仪器和试剂盒进行检测，价格相当的昂贵且无法实现样 品大批量快速检测，使推广应用受到限制。而国内尚无自主研制的M化检测试剂盒。
[0007] 因此，目前临床上迫切需要一种能对患者血清中M化水平进行快速、准确检测的 方法和工具。巧光微球标记层析检测技术是近年继胶体金标记技术W后，在巧光染料标记 技术上发展起来的近患者床旁进行的一种快速检测分析技术，简称P0CT。P0CT是一类极具 潜力的检测技术，它快速简便，效率高，成本低，有检验周期短、标本用量少等优点。同时，其 试剂稳定且便于保存和携带，已经被广泛用于临床，甚至自我检测。数据处理和自动化仪器 类似，有预先设计编制的软件分析处理，提高了 P0CT检测的准确性和可靠性。将不同粒径 的巧光微球与含有氨基、駿基、哲基、琉基的生物大分子物质结合，当巧光微球标记的蛋白 质（抗原/抗体）被包被在硝酸纤维素膜上的抗原/抗体捕获时，巧光微球在相应的区域内 聚集，在一定波长范围的激发光照射下，发出特定颜色的可见光。通过检测板条上激光激发 的巧光，定量检测Wpg/ml为单位的检测板条上单个或多个标志物。检测系统通常由巧光 读数仪和检测板组成。检测板多用层析法，分析物在移动的过程中形成免疫复合物，通过检 测区域、质控区域的巧光信号值的不同与分析物的不同浓度成一定的比例，获得定标曲线， 可检测未知样本中分析物的浓度。能达到与常规实验室酶联免疫法测定相当的敏感度和特 异性。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式 简便，检测结果准确可靠的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒。
[0009] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，包括巧光试纸条和样本稀释液， 巧光试纸条包括底板，底板的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫、巧光结合垫、包被 膜和吸水纸，样品垫的里端和巧光结合垫的一端搭接相连，巧光结合垫的另一端与所述包 被膜的一端搭接相连，包被膜的另一端与所述吸水纸搭接相连，所述包被膜包括检测区和 质控区；所述检测区包被有抗M化单克隆抗体，所述质控区包被羊抗兔IgG ;所述巧光结合 垫中含有巧光标记的MBL单克隆抗体和巧光标记的兔IgG。
[0010] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述检测区包被的抗M化单 克隆抗体由用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生，用作包被抗 甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No. 10091，所述巧光结 合垫中含有巧光标记的M化单克隆抗体由用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的 杂交瘤细胞株产生，用作标记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏号 为CGMCC No. 10092,用作包被抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株与用作标 记抗甘露糖结合凝聚素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株具有不同的结合表位。
[0011] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述质控区包被羊抗兔IgG 的包被液浓度为0. 2-4mg/ml，用量为30 y l/30cm ;所述检测区的MBL单克隆抗体的包被液 浓度为0. 2-4mg/ml，用量为30 y 1/30畑1。
[0012] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述质控区包被羊抗兔IgG 的包被液浓度为0. 5-1. 5mg/ml，所述检测区的MBL单克隆抗体的包被液浓度为l-2mg/ml。 [001引本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述巧光结合垫包括玻璃纤 维，巧光结合垫由巧光标记的M化单克隆抗体和巧光标记的兔IgG混合后喷涂于玻璃纤维 上经冻干制成，玻璃纤维上标记物中的巧光标记的M化单克隆抗体的浓度为2-5 y g/ml，巧 光标记的兔IgG的浓度为2-5 y g/ml。
[0014] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述样本稀释液包括磯酸氨 二钢浓度20mmol，氯化钢浓度150mmol，牛血清白蛋白浓度1 % -2%，吐温-20浓度0. 1 %， 其余为水。
[0015] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述巧光结合垫上巧光标记 的激发电磁波的波长为310-550皿，发射波长为340-620皿的电磁波。
[0016] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述巧光结合垫采用W下方 法制成：
[0017] 制备巧光微粒标记的M化抗体；
[00化]将18-22mg的巧光素或480-520mg巧光微球与SOmgMBL单克隆抗体混合后，边揽 拌边缓慢加入1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和N-哲基班巧酷亚胺，使其整 个反应体系中1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺含量为0. 1-0. 3mg，N-哲基班巧 酷亚胺的含量为0. 1-0. 2mg，在4°C避光反应过夜；用Se地adex G25凝胶柱将抗体巧光标记 物进行纯化，去除杂质，用巧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
[0019] 制备巧光微粒标记兔IgG ;
[0020] 将18-22mg的巧光素或480-520mg巧光微球与50mg兔IgG混合后，边揽拌边缓慢 加入1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和N-哲基班巧酷亚胺，使其整个反应体 系中1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺含量为0. 1-0. 3mg，N-哲基班巧酷亚胺的 含量为0. 1-0. 2mg，在4°C避光反应过夜；用Se地adex G25凝胶柱将抗体巧光标记物进行纯 化，去除杂质，用巧光保护剂复溶；经冻干保存备用；
[0021] 将上述制备好的巧光微粒标记的M化抗体和巧光微粒标记兔IgG混合，W使两种 抗体浓度分别都为化g/ml，按500ul/30cm均匀铺涂在条形的玻璃纤维上，再将条形的玻璃 纤维截断制成所述巧光结合垫。
[0022] 本发明的巧光定量检测MBL的免疫层析试剂盒，其中所述巧光结合垫亦可采用W 下方法制成：
[0023] 制备巧光微粒标记的M化抗体；
[0024] 将18-22mg的巧光素或480-520mg巧光微球标记物与65mgMBL单克隆抗体，置 于4°C，调节体系P册.8-9. 0, 一边揽拌一边缓慢加入0. 2-1 %戊二醒；反应2-5小时，用 Se地adex G25凝胶柱将抗体巧光标记物进行纯化，去除杂质，用巧光保护剂复溶；经冻干保 存备用；