一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及食品安全检测领域，尤其设及一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 非诺特罗，属于选择性0 2型受体激动剂，它可用于治疗支气管哮喘，尤其对儿童 支气管哮喘有较好的疗效。0 2型受体激动剂种类较多，其它有盐酸克仑特罗、莱克多己胺、 沙了胺醇、西布特罗、马布特罗、漠布特罗、妥布特罗、氯丙那林、班布特罗等。在畜牧养殖 中，有少部分人将盐酸克仑特罗等0 2型受体激动剂作为一种生长促进剂非法添加到饲料 中，用W改善禍体的品质，但同时也造成食品中0 2型受体激动剂的残留。当人们食用残留 量大的食品后可能会出现一系列的中毒症状。我国已明令禁止在畜牧业中使用盐酸克仑特 罗，沙了胺醇等0 2型受体激动剂。
[0003] 免疫层析技术是出现于80年代初期，通常W条状纤维层析材料为固相，通过毛细 作用使样品在层析条上爬动，层析材料上的受体（如抗体或抗原）与样品中的待测物发生 特异性免疫反应而显色。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金、乳胶、胶体砸、明胶等，其 中运用最成功的标记物为胶体金。用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年 Fel化err等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，化^or等将胶体 金引入电镜免疫标记技术中。90年代W来，由于早孕试纸条的快速推广和使用，使得胶体金 检测卡成为开发最多，使用最广，最为成熟的体外诊断试剂。
[0004] 目前，用于检测非诺特罗公开报道的方法和标准较多；如农业部标准《动物源性食 品中0 -受体激动剂残留检测液相色谱一串联质谱法》（1025号公告-18-2008)，非诺特罗 检测限可达0. 25 y g/kg ;迂宁省地方标准《牛羊组织中0 -受体激动剂残留检测超高效液 相色谱-串联质谱法》值B 21/3004-2013)，非诺特罗检测限可达0. 25 y g/kg ;吉林省地 方标准《动物源性食品中24种受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》值BS22 012-2013)，非诺特罗检测限可达0. 1 y g/kg ;然而用于检测非诺特罗的产品鲜有报道，中 国专利文献公开号CN102359961A的专利，公开了一种用于0 -肾上腺素受体激动剂类化 合物检测的试剂盒，该方法是通过比较样品溶液与空白溶液的变色时间来定性检测非诺特 罗，其存在灵敏度低，准确性差，不能定性检测非诺特罗等问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对上述问题，提供一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方 法，其具有成本低、灵敏度高、检测方便、快捷的特点。
[0006] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现：
[0007] 一种非诺特罗的胶体金检测卡，包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条，所述试纸条 上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标结 合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，所述抗非诺特罗单克隆抗体-胶 体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是w非诺特罗偶联抗原I为免疫抗原制备的，所述 硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线，且硝酸纤维素膜上邻近吸水垫的 一端设置有质控线，所述检测线上包被有非诺特罗偶联抗原II，所述质控线上包被有抗鼠 二抗。
[000引作为本发明的优选方案，所述卡壳由底卡及面卡构成，且卡壳由塑料材料制成。
[0009] 作为本发明的优选方案，所述面卡上开有加样孔，所述加样孔位于样本垫的上方。
[0010] 作为本发明的优选方案，所述面卡上开有观察窗，所述观察窗位于硝酸纤维素膜 的上方。
[0011] 一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，包括W下步骤：
[0012] 一、金标结合物垫的制备：
[001引 a、合成非诺特罗偶联抗原I :取载体蛋白，用双蒸水溶解后，再用化OH调抑至 10,加入1，4- 了二醇二缩水甘油離，在氮气保护下，避光揽拌24小时，通过柱层析纯化制 得接臂载体蛋白，所述1,4-了二醇二缩水甘油離与蛋白载体的摩尔比为100:1，将非诺特 罗调成碱性后，在揽拌条件下缓慢加入到接臂载体蛋白中，氮气保护下室温避光揽拌24小 时，反应产物在4°C用0. Olmol/L的磯酸盐缓冲液透析3天，透析后得到非诺特罗偶联抗原 I ;
[0014] b、免疫动物；将上述步骤a中制成的非诺特罗偶联抗原I与等量弗氏完全佐剂乳 化完全后，免疫小鼠；
[0015] C、细胞融合和杂交瘤细胞筛选：取经非诺特罗偶联抗原I免疫的小鼠脾细胞与 SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用HAT培养基进行培养，对培养上清进行检测，筛选获得 稳定分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9 ;
[0016] t制备腹水；将分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9培养后，注射入 BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；
[0017] e、抗非诺特罗单克隆抗体的纯化制备；采用硫酸锭沉淀法对腹水进行透析、过滤 处理，采用非诺特罗亲和层析柱对经透析、过滤处理的上清进行纯化，提纯制备出抗非诺特 罗单克隆抗体；
[001引 f、胶体金溶液制备：在超纯水中加入1 %氯金酸，加热煮沸，迅速加入1 %巧樣酸 =钢，继续煮沸15分钟，所述超纯水、氯金酸、巧樣酸=钢的体积比为99 ;1 ;1，冷却后用超 纯水恢复至原来的体积，4°C保存备用；
[0019] g、抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液的制备；将胶体金溶液调抑至 6. 0,用20 y g/血浓度的抗非诺特罗单克隆抗体反应1小时，然后用10%牛血清白蛋白进行 封闭，4°C 7500g离屯、30分钟，去上清，胶体金沉淀用1/10胶体金体积的金标复溶液进行溶 解，制成抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液，所述胶体金溶液、抗非诺特罗单克隆 抗体、牛血清白蛋白的体积比为100 ; 10 ;5 ;
[0020] K制备金标结合物垫；将上述制备的抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物溶液 W 4 y L/cm喷量喷涂于结合物垫上，37度干燥3小时后，放于湿度低于20 %的干燥柜保存 备用；
[0021] 二、硝酸纤维素膜的制备：
[0022] a、合成非诺特罗偶联抗原II ;将对氨基苯甲酸、亚硝酸钢溶于抑2. 0的溶液中，在 冰浴和避光条件下振荡反应4小时，制得重氮盐，所述对氨基苯甲酸、亚硝酸钢的质量比为 1 ;2,将该重氮盐与非诺特罗反应，生成非诺特罗衍生物，产物经柱层析纯化，将纯化后的非 诺特罗衍生物与载体蛋白按摩尔比50:1，采用邸C/N服法合成非诺特罗偶联抗原II，然后 在4°C用0. Olmol/L磯酸盐缓冲液透析3天，得到纯化的非诺特罗偶联抗原II ;
[0023] b、制备硝酸纤维素膜；W 0. Olmol/L，抑7. 4的磯酸盐缓冲液为稀释液，将非诺特 罗偶联抗原II稀释至0. 5mg/mU并W 1 y L/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的一端作为检测 线，将抗鼠二抗稀释至1.〇111肖/111以并^ luL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的另一端作为质 控线，37°C干燥2小时后，密封，室温保存备用；
[0024] S、非诺特罗的胶体金检测卡的组装：
[0025] 在底板上依次粘贴样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从而组装成试纸 条，所述硝酸纤维素膜包被非诺特罗偶联抗原II的一端搭接金标结合物垫，且硝酸纤维素 膜包被抗鼠二抗的一端搭接吸水垫，将试纸条剪切成一定宽度后装于卡壳中。
[0026] 作为本发明的优选方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或阳离子化牛血清白蛋白 或卵清蛋白或钥孔血藍蛋白。
[0027] 作为