一种降钙素原胶体金免疫比色法定量检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种降钙素原(PCT)定量检测试剂盒及其制备方法，涉及体外诊断试剂领域。本发明试剂盒基于胶体金免疫比色法，包括R1、R2、PCT校准品，试剂R1为含有表面活性剂的缓冲液，试剂R2为含有标记了降钙素原抗体的金纳米颗粒的溶液。本发明还提供了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，反应迅速，稳定性好的特点，适用于多种生化分析仪，反应后不易污染反应杯，便于生化仪的清洗。
【专利说明】
一种降钙素原胶体金免疫比色法定量检测试剂盒及其制备 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种降钙素原胶体金免疫比色法定量检 测人体血液中降钙素原PCT的试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 降钙素原（procalcitonin，PCT)是降钙素（CT)的前体肽，是一种由116个氨基酸 组成的糖蛋白，没有激素活性。在健康人血中PCT不能被检测到（< 0. lng/ml)，而当细菌 感染后2-6小时血浆PCT浓度即可明显升高，并与炎症的严重程度成正相关性，而在严重感 染（如细菌，寄生虫感染）并有全身表现时，PCT水平即明显升高，此时PCT>0. 5ng/ml。 然后随着炎症的控制与病情的缓解而逐渐降低至正常水平。PCT可选择性地对系统性细菌 感染、真菌感染及寄生虫感染有反应，而对无菌性炎症和病毒感染无反应或仅有轻度反应。 它在局部感染，病毒感染，慢性非特异性炎症，肿瘤热，过敏、排斥反应，自身免疫性疾病等 情况下浓度不增加或仅轻微增加，而在全身细菌感染时PCT浓度早期即可显著升高，侵袭 性真菌感染时PCT-定程度增高，但其增幅明显低于细菌感染，因此PCT的检测与传统的炎 症反应指标比较具有更高的特异性和敏感性。
[0003] PCT已经成为一种用于全身细菌感染诊断及鉴别诊断的新型血清标志物。PCT检 测为所有不明病因的炎症性疾病的鉴别诊断提供帮助与支持，如细菌性与毒素性的急性成 人呼吸窘迫综合症（ARDS)的鉴别；胆源性与毒素性胰腺炎的鉴别；细菌性与病毒性脑膜炎 的鉴别；微生物诱导的发热与非细菌性发热的鉴别，特别是发热待查（F0U)的诊断；病毒感 染或自身免疫失调与免疫抑制条件下的急性细菌感染的鉴别，发热病因的鉴别，肿瘤患者 中被肿瘤溶解物或化疗诱导与细菌、真菌感染病因的区别；早期诊断新生儿和婴儿全身性 细菌感染与败血症引起的急性发热；术后常规，包括术后感染预警及术后切除感染灶（如 腹膜炎、软组织感染）后的治疗指导，监测腹膜炎、吻合口漏和无典型腹部症状的疾病过 程；器官移植后的监测，移植前排除急性细菌或其他感染，鉴别急性器官排斥、急性病毒、细 菌与真菌感染；ICU的长期住院患者及长期机械通气患者的监测；监测高危患者，早期获得 有关并发症和内环境衰退的信息等。
[0004] PCT的检测方法有很多，既有定性方法也有半定量、定量检测方法。这些主要方法 有：凝胶层析法、高效液相色谱分析法、免疫化学发光法、酶联免疫吸附测定（ELISA)、放射 免疫测定（RIA)、胶体金层析法。其中凝胶层析法以及高效液相色谱分析法检测结果精确， 但比较耗时，费用昂贵，不能在临床推广；免疫化学发光法灵敏度高，适合临床PCT测定，但 需要搭配专门的仪器使用，价格昂贵；酶联免疫吸附测定，在临床比较常用，但操作复杂、反 应时间较长，且线性范围较窄；放射免疫法检测正常人的血清PCT较为敏感，且既能检测游 离的PCT，又能检测结合型的PCT，也可检测降钙素基因相关肽前体，比酶免法、免疫化学发 光法提高了灵敏度，但所需时间较长，且标记的放射性元素存在污染，因而限制了此方法的 临床应用。胶体金层析法简便快捷，整个检测过程不超过30min，不依赖仪器、操作简便、快 速，适用于床旁检验，但一般只能作定性或半定量检测，不能给出定量结果。
[0005] 本发明的目的是为了解决上述方法中的诸多不足，为临床提供一种高效，快捷，重 复性好，准确度高，高检测线性，高分析灵敏度的方法，同时本发明还解决了胶体金试剂中 标记物自身沉降和对反应杯污染的两大技术难题，为临床诊断提供可靠的保证，同时降低 检测成本。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种基于胶体金免疫比色法的降钙素原检测试剂盒及制备方法。该试 剂盒线性范围宽、灵敏度高，反应时间短，制造成本低，不对生化分析仪反应杯造成污染。
[0007] 根据本发明的一方面，提供一种基于胶体金免疫比色法的降钙素原检测试剂盒， 该试剂盒包括试剂R2,所述试剂R2为含有标记了降钙素原抗体的金纳米颗粒的溶液， 所述金纳米颗粒的粒径为60nm-80nm，优选65nm-75nm ;所述金纳米颗粒和抗体质量比在 50 : 10-80,优选 50 : 20-60。
[0008] 所述试剂R2为PH值7. 5-10. 5,优选8. 0-9. 0的溶液。
[0009] 所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、表面活性剂和甘油，其中，促凝剂为重量体积 比10%以内的PEG 8000,稳定剂为重量体积比10%以内的BSA，表面活性剂为重量体积比 为10%以下的吐温-20,蔗糖的重量体积比为40%以下，甘油的重量体积比为20%以下。 [0010] 作为优选，上述R2为含有粒径为70±5nm且标记了抗人降钙素原抗体的金纳米颗 粒、重量体积比20%蔗糖、重量体积比2% PEG8000、重量体积比1% BSA、重量体积比1%吐 温-20和重量体积比5%甘油的，pH7. 2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗粒和抗体的重量比 为 50 : 20-60。
[0011] 更进一步地，所述基于胶体金免疫比色法的降钙素检测试剂盒还包括起缓冲和加 速反应作用的试剂R1，所述试剂R1为含有重量体积比〇. 5 % Tween-20和重量体积比0. 1 % 的NaN3的，pH7. 2的磷酸盐缓冲液。
[0012] 上述试剂R2通过如下方法制备：
[0013] 制备金纳米颗粒；
[0014] 将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液；
[0015] 偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂；
[0016] 3000rpm 离心 1 小时；
[0017] 离心沉淀用含重量体积比20%蔗糖、重量体积比2% PEG 8000、重量体积比1% BSA、重量体积比1 %吐温-20和重量体积比5%甘油，pH值7. 2的磷酸盐缓冲液重悬，调整 浓度至 540nm 0D 为 0. 2-0. 3。
[0018] 1)试剂R2的制备：
[0019] 步骤一：将氯金酸与还原剂按照一定比例分别加入到煮沸的去离子水或超纯水 中，制得胶体金颗粒，粒径为60-80nm ;
[0020] 步骤二：将PCT抗体在2_8°C条件下透析，然后用缓冲液1将PCT抗体稀释至 l-2mg/ml ；
[0021 ] 步骤三：将PCT抗体按照一定比例加入胶体金溶液中，混合均匀，制成金标PCT抗 体；
[0022] 步骤四：3000rpm离心1小时；
[0023] 步骤五：将PH 7. 2的磷酸缓冲液、20%的蔗糖、2%的？￡68000、1%的834、1%的 吐温_20、5%的甘油和离心后的胶体金沉淀按照一定比例重悬，调整浓度至540nm0D为 0.2-0. 3,即为试剂R2 ;
[0024] 步骤六：将PCT蛋白按照所需浓度梯度，用校准品稀释液配制成浓度在Ong/ mL-100ng/mL范围内的校准品，用于在仪器上配合试剂R1和试剂R2形成校准曲线，以达到 定量检测的目的。
[0025] 加入稳定剂可以稳定抗体的结构和活性，避免其受到温度、渗透压等外界条件的 影响而变性或失活，同时，稳定剂还可以使抗体标记的金颗粒均匀分布于溶液中，不易发生 沉降，有助于反应更好的进行。所述稳定剂可以是蛋白质和糖，所述蛋白质优选牛血清白蛋 白（BSA)或明胶；所述糖可以是单糖、二糖或者多糖，其中，单糖优选甘露糖、半乳糖和/或 葡萄糖；二糖优选乳糖和/或蔗糖；多糖优选海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的 一种或多种。
[0026] 本发明的试剂盒中，试剂R2还可以加入促凝剂，所述促凝剂包括聚乙二醇4000、 聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000中的一种或几种，以增加抗原抗体反应速 率。
[0027] 本发明试剂盒中R2可以加入表面活性剂，所述表面活性剂包括吐温-20、Triton X-100、NP-40中的一种或几种，用来促进抗原抗体更好的结合。
[0028] 本发明所提供试剂盒中R2可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘 氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、中的一种或多种缓冲液体系；优选磷酸盐缓冲液体 系。
[0029] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0030] 1、本发明试剂盒采用了胶体金免疫比色法，使用这种方法检测降钙素原，在现有 市场中无应用。处于液态反应环境的降钙素原抗体标记胶体金颗粒增大了与样本中PCT抗 原的反应面积，使得血液样本中的降钙素原（PCT)能够与胶体金上标记的PCT抗体充分并 快速的发生反应，并在促凝剂的作用下，使胶体金产生聚集，在540nm下检测产生吸光度的 变化，而吸光度的变化幅度与血液样本中PCT的含量在一定范围内成正比，从而可以定量 检测血液样本中的降钙素原（PCT)含量，其灵敏度高，最低检测限可以达到0.2ng/ml，检测 范围在0-100ng/ml，能够满足临床检测需要。
[0031] 2、本发明试剂盒的R2配方中含有的稳定剂及大分子促凝剂使得胶体金颗粒能够 更均匀地悬浮分布在溶液中，不易发生金颗粒的沉淀，很好地解决了胶体金反应聚集后会 污染生化仪反应杯的问题。
[0032] 3、本发明试剂盒可以在现有多种生化分析仪上进行血浆或血清等多种类样本检 测，适合于灵活快速的为多科室提供定量的PCT检测结果。一般PCT检测约需30分钟，本 发明试剂盒从样本采集到出具检测结果只需约10-15分钟，便于动态监测患者病情，更适 合在临床中推广应用。本发明与现有进口 PCT检测试剂盒对血样检测结果进行对比，经统 计分析相关性良好，无显著差异，可以在临床上推广使用，降低检测成本。
【附图说明】：
[0033] 图1为本发明降钙素原试剂盒实施例的校准曲线；
[0034] 图2为本发明降钙素原试剂盒实施例的线性；
[0035] 图3为本发明降钙素原试剂盒实施例与市售PCT电化学发光试剂盒检测结果的相 关性比较。
【具体实施方式】：
[0036] 以下，将详细说明本发明的具体实施例，以便本领域技术人员能够更详细地理解 本发明。
[0037] 本发明所提供基于胶体金免疫比色法的降钙素检测试剂盒中，0. 5% Tween20(w/ v)作为促凝剂和0. 1% NaN3(w/v)作为防腐剂，50mM的磷酸盐缓冲液（pH7. 2)作为缓冲溶 液，能够为抗原抗体反应提供合适的缓冲及反应环境。
[0038] 以下各实施例仅制备试剂R2。
[0039] 实施例1
[0040] 本实施例试剂R2的制备分为三步，首先制备纳米金颗粒（即胶体金）溶液，然后 将抗体偶联到金纳米颗粒上，最后和缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂等混溶成完整的体 系。
[0041] 具体过程如下：
[0042] (1)市售的氯金酸和柠檬酸三钠分别配制成1 %的水溶液，将1L的去离子水或超 纯水煮沸，接着加入10mL的氯金酸溶液保持沸腾约lmin后，加入10mL的柠檬酸三钠溶液， 随着时间的变化溶液再次沸腾，溶液颜色随之由明黄色转变为紫黑色，接着短时间转为酒 红色，之后保持沸腾lOmin后，冷却，补水至原体积，备用。
[0043] 将制备好的的胶体金溶液用浓度为10%的1(20)3溶液调整pH值至8. 4-8. 6,各取 lml调整PH后的胶体金溶液，分别加入1、2、4、8、10、20、40、60、80、100u 1不同体积的PCT 抗体，此时纳米金颗粒和抗体的质量比分别为50 : 1、50 : 2、50 : 4、50 : 8、50 : 16、 50 : 20、50 : 40、50 : 60、50 : 80、50 : 100,充分搅拌lhr，再依次从加入PCT抗体最少 的管开始向管中加入50ul 10%的NaCl溶液，观察PCT抗体标记胶体金溶液的变黑色情况。 原理是胶体金本身遇到NaCl后，颜色会由红变黑。当管中胶体金上的抗体标记量不足时， 加入NaCl后，由于抗体没有把胶体金表面全部覆盖，所以这时胶体金遇到NaCl后仍然会变 黑，当抗体标记量足够大将胶体金表面完全覆盖时，则加入NaCl后胶体金不变色。以加入 NaCl后纳米金颗粒和抗体质量比达到溶液不变黑的PCT抗体使用量为最小标记量。本发明 PCT最适的抗体标记量为8-80,优选20-60。
[0044] (2)根据以上结果，将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10 %的碳酸钾 调整溶液的pH值至8. 4-8. 6 ;
[0045] 将4ml的抗体加入到上述溶液中，继续搅拌1小时，在此过程中抗体同纳米颗粒在 库仑力和范德华力的作用下，与纳米金颗粒碰撞并吸附到胶体金表面，实现偶联；
[0046] (3)试剂R2的配制按如下步骤进行：
[0047] 将上述溶液移至离心管中，用3000rpm离心lh，弃上清，保留沉淀；
[0048] 用浓度为20%蔗糖、2% PEG8000作为促凝剂、1 % BSA作为稳定剂、1 %吐温-20和 5%甘油的50禮的磷酸盐缓冲液化117.2)重悬沉淀物，调整浓度至5401111100为0.2-0.3 ;
[0049] 得到R2溶液，分装备用。
[0050] (4)降钙素原（PCT)校准品配制及定值
[0051] 用重组人PCT蛋白（市售）溶于校准品稀释液（牛血清白蛋白0.5%，叠氮钠 0.2%，磷酸缓冲液pH 8.0)制备出不同浓度梯度的校准品。用本发明试剂盒同时检测制备 的校准品和Audit MicroControls公司生产的降|丐素原标准品，每个浓度梯度检测3次，取 检测结果的平均值，以制备的本发明试剂盒的校准品作为样本，以Audit MicroControls公 司生产的降钙素原标准品作为校准品，制作校准品曲线，计算本发明试剂盒校准品的浓度， 定值结果为〇ng/mL(校准品稀释液，未添加PCT蛋白），0. 61ng/mL，2. 25ng/mL，10. 62ng/mL， 50. 43ng/mL,100. 22ng/mL。
[0052] (5)降钙素原（PCT)试剂盒的检测方法
[0053] 以东芝120FR全自动生化仪为例，设定检测波长为540nm，分别取不同浓度的校准 品溶液5ul，加入降钙素原R1试剂240ul，混匀，37°C温育5分钟后，加入降钙素原R2试剂 80ul，混匀，37°C孵育5分钟后，读取各管的吸光度值Al，1分钟后，读取各管的吸光度值A2， 计算吸光度值差A2-A1，每管重复测定2次，以各管2次测得的吸光度差值的平均值为纵坐 标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制"浓度-吸光度"校准曲线（见图1)。
[0054] 取待测血清或血浆样本，用以上方法同样测定吸光度差值，代入校准品曲线，即可 计算出待测样本中降钙素原（PCT)的含量。
[0055] 本试剂盒不仅适用于东芝120FR全自动生化仪，还适用于其他品牌和型号的半自 动、全自动生化分析仪，具体参数可根据仪器进行调整。
[0056] (6)试剂盒的分析性能指标
[0057] a)线性范围
[0058] 取一例降钙素原（PCT)呈阳性反应的临床病人血清样本约2mL，向其中加入一定 量的重组PCT蛋白纯品，制得一份浓度在线性高值的样本，用所述方法在生化分析仪上重 复测定三次，计算三次测值的平均值为99. 7ng/ml。
[0059] 用0? 05M PH7. 2的磷酸缓冲液将上述高值样本按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 倍比稀释，加上未经稀释的高值样本点，组成共7个浓度点的一组溶液，用上面所述的检测 方法在生化分析仪上检测，每个浓度样本重复测定三次，分别计算三次测定结果的平均值。 以稀释浓度（x)为横坐标，以测定结果平均值（y)为纵坐标计算线性回归方程，并计算线性 回归方程的相关系数（r)，线性回归方程为y = 1.0098X+0. 1541，相关系数r = 0. 9999,结 果表明本发明试剂盒在0. 2ng/ml-100ng/ml线性范围内相关性较好，如表1、图2。
[0060]
[0061] 表 1
[0062] b)批内精密性
[0063] 用本发明试剂盒对两份血清样本各重复测定10次，分别计算两份样本的均值和 标准差，以均值/标准差计算两份样本的变异系数，表2的结果显示批内精密度为2. 81%和 2. 18%。
[0064]
[0065]
[0066]表 2
[0067] c)批间精密性
[0068] 以本发明实施例所述方法制备三批试剂盒，用三批试剂盒对同一份血清样本各测 定3次，分别计算每批试剂3次测定结果的均值(Yi ：)，然后计算三批试剂盒检测结果的总均 值(又总)和总标准差（SD总），以SD总/又总计算得到批间变异系数（CV总）。表3结果显 示，本发明试剂盒的批间变异系数为3. 39%，
[0070] 表 3
[0071] d)最低检测限
[0072] 以本发明试剂盒中使用的校准品稀释液作为空白样本，按照所述的检测方法在生 化分析仪上重复检测20次，计算空白样本的均值及标准差，以空白样本检测均值加上两倍 标准差得到最低检测限，结果显示本发明的试剂盒的最低检测限为〇. 2ng/ml。
[0073] e)稳定性
[0074] 本发明试剂盒进行了加速稳定性和长期稳定性考察。
[0075] 加速稳定性：将本发明试剂盒置于37°C 15天后取出，在生化分析仪上按照检测方 法检测市售进口 PCT化学发光试剂盒定值为0. 64ng/ml和41. 27ng/ml的两份血样，每份 血样重复测定3次，计算检测结果与市售进口试剂定值结果的相对偏差分别为：2. 08%和 1. 11 %，37°C放置15天后的加速稳定性较好，结果见表4。
[0076] 长期稳定性：将本发明试剂盒置于2°C _8°C放置14个月，取出后按所述生化分析 仪检测方法检测市售PCT化学发光试剂盒定值为0. 58ng/ml和53. 07ng/ml的两份血样，每 份血样重复测定3次，计算检测结果与市售定值结果的相对偏差分别为：1. 15%和0.76%， 2°C _8°C放置14个月的长期稳定性较好，结果见表4。
[0078] 表 4
[0079] f)本发明试剂盒与现有产品比较
[0080] 用化学发光法原理检测降钙素原是目前市售检测PCT的试剂主要采用的方法，其 检测结果得到认可及应用。而由于目前市场上还没有与本试剂盒一样使用胶体金免疫比色 法检测PCT蛋白的市售试剂，所以我们选择了采用化学发光原理检测PCT的市售进口试剂 作为对比试剂。
[0081] 收集进口降钙素原化学发光试剂盒检测过的新鲜血液样本100例，其中阳性样本 63例，阴性样本37例。用本发明的试剂盒对样本进行双孔重复测定，计算平均值，然后对所 有样本结果进行线性回归分析，计算本发明试剂盒与对比试剂盒检测结果的相关系数。
[0082] 结果显示，两种试剂盒检测结果的相关系数r = 0.9986,线性回归方程为y = 1. 0179X-0. 1216。本发明降钙素原胶体金免疫测定试剂盒与现有进口降钙素原化学发光试 剂盒具有很好的一致性。本发明试剂盒在临床上可以代替进口试剂盒使用，降低了检测成 本。
【主权项】
1. 一种降钙素原定量检测试剂盒，试剂盒基于胶体金免疫比色法，包括试剂RU R2,所 述试剂R2为含有标记了降钙素原抗体的金纳米颗粒的溶液。2. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为60nm-80nm。3. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50 : 10-80。4. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述降钙素原为多克隆抗体或单克隆抗体中 的一种或几种；所述多克隆抗体为含有功能部位的完整抗体或抗体片段，包括兔抗人多克 隆抗体或羊抗人多克隆抗体；所述降钙素原单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体 片段或重组抗体。5. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为PH值7. 5-10. 5的溶液。6. 权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2含有促凝剂、稳定剂、表面活性剂 和甘油，其中，所述促凝剂为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000 中的一种或几种，所述稳定剂为蛋白质、糖类中的一种或多种；所述蛋白质为牛血清白蛋白 或明胶；所述糖为单糖、二糖或者多糖；所述表面活性剂为吐温-20、Triton X-100、NP-40 中的一种或几种；试剂R2是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠 檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合。7. 权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述促凝剂为重量体积比10%以内的PEG 8000， 所述稳定剂为重量体积比10 %以内的牛血清白蛋白，所述表面活性剂为重量体积比为 10%以下的吐温-20,所述蔗糖的重量体积比为40%以下，所述甘油的重量体积比为20% 以下。8. 权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为含有粒径为70. 0±5nm且标记 了降钙素原抗体的金纳米颗粒、重量体积比20%蔗糖、重量体积比2% PEG 8000、重量体积 比1% BSA、重量体积比1%的吐温-20和重量体积比5%甘油，pH7. 2的磷酸盐缓冲液，其 中，金纳米颗粒和抗体的重量比为50 : 10-80。9. 权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试剂Rl，所述试剂Rl为含 有重量体积比2%以内的吐温-20和重量体积比0. 1 %的NaN3的磷酸盐缓冲液。10. 制备权利要求1-9任意一项所述试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 制备金纳米颗粒； 2) 将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液； 3) 偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂； 4) 3000rpm离心1小时； 5) 离心沉淀用含重量体积比20%蔗糖、重量体积比2% PEG 8000、重量体积比1% BSA、重量体积比1 %吐温-20和重量体积比3%甘油，pH值7. 2的磷酸盐缓冲液重悬，调整 浓度至 540nm OD 为 0. 2-0. 3。
【文档编号】G01N33/68GK105891497SQ201410788391
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月19日
【发明人】强中华, 张黎, 郭成志, 王志新
【申请人】北京科美生物技术有限公司