降钙素原检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及降钙素原的检测技术，具体为降钙素原检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]血清降钙素(CT)是最先从甲状腺肿瘤细胞培养液中提取的一种多肽激素，因此成为该肿瘤血清学标志物。降钙素原(PCT)，CT的前体，是1992年由德国科学家发现的一种116个分子的氨基酸组成的糖蛋白，在人体内的半衰期约为20-24小时，稳定性好;在正常人血清中含量极低，在除甲状腺创伤或肿瘤外，系统炎症反应综合症(SIRS)、败血症、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎、创伤等患者血清中显著升高，是一种非常敏感特异的血清学标志。而在病素毒感染、肿瘤物术创伤时则保持低水平，PCT在严重细菌感染(2-3小时后)早期即可升高，因此具有早期诊断价值；在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、癌症发热、移植物宿主排斥反应或自身免疫性等疾病时PCT浓度不增加或轻微增加，而只在严重的全身系统性感染时才明显增加，这就决定了 PCT的高度特异性，因此也可用于各种临床情况的鉴别诊断；PCT浓度和炎症严重程度成正相关，并随着炎症的控制和病情的缓解而降低至正常水平，因而PCT又可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。PCT在临床上具有广泛而又重要的应用价值；并且对ICU病人的死亡率及住院时间提供标准。
[0003]正常人血液中降钙素原的浓度很低，通常无法检测到。只有当细菌感染时降钙素原才会升高，而其他的炎性反应如病毒感染、自身免疫性疾病和创伤等降钙素原不会升高。从产生和消除的动力学过程来看，PCT也是最适合用作临床诊断指标的。IL-6、IL-10、TNF-α的在血液循环中达峰值时间太早，约2小时左右，且很快下降，临床上不易检测至IJ15CRP在24-48小时达峰值，炎症控制后CRP浓度仍然居高不下，过一段时间才会缓慢恢复。而感染后6-12小时PCT浓度达峰值，PCT的半衰期为24小时左右。所以，比较而言，降钙素原能在早期提高感染性疾病的诊断率并反映疾病转归，对于抗生素的用药、停药指征有很好的指导意义。
[0004]目前对PCT的检测方法主要是发学发光法及ELISA方法，这些方法适合在大医院进行大样本的检测。另外市场上有一种定性检测PCT的胶体金试剂，不能定量检测。尚未有采用免疫层析胶体金技术制备的可定量检测PCT的检测试剂盒。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题在于提供一种降钙素原检测试剂盒，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:
降钙素原检测试剂盒，包括磁微粒分离试剂、PCT检测抗体、酶结合物、发光底物、PCT标准品、用于稀释所述酶结合物的酶稀释液；所述磁微粒分离试剂中磁微粒偶联的蛋白分子为鼠抗人免疫球蛋白G ;所述PCT检测抗体为抗鼠IgG抗体；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG;所述发光底物为HRP发光底物；所述HRP发光底物包括A液和B液，所述HRP发光底物的A液和B液实用时1:1混合。
[0007]所述HRP发光底物的A液包括光剂鲁米诺或鲁米诺衍生物、增强剂和缓冲剂，HRP发光底物的B液包括过硼酸钠和双氧水。
[0008]所述磁微粒分离试剂中磁微粒的大小为100 μ πΓ8 μ m,磁微粒表面的活性基团为COOH 或 NH2。
[0009]综上所述，本发明有益效果:
本发明采用鼠抗人免疫球蛋白G偶联磁微粒，PCT单克隆抗体结合鼠抗人免疫球蛋白G这种间接包被模式。这种模式降低了 PCT单抗的用量，从而降低了成本。通过增加偶联磁微粒的鼠抗人免疫球蛋白G的浓度，能够明显的提高检测灵敏度。
【具体实施方式】
[0010]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
[0011]降钙素原检测试剂盒，包括磁微粒分离试剂、PCT检测抗体、酶结合物、发光底物、PCT标准品、用于稀释所述酶结合物的酶稀释液；所述磁微粒分离试剂中磁微粒偶联的蛋白分子为鼠抗人免疫球蛋白G ;所述PCT检测抗体为抗鼠IgG抗体；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG ;所述发光底物为HRP发光底物；所述HRP发光底物包括A液和B液，所述HRP发光底物的A液和B液实用时1:1混合。
[0012]所述HRP发光底物的A液包括光剂鲁米诺或鲁米诺衍生物、增强剂和缓冲剂，HRP发光底物的B液包括过硼酸钠和双氧水。
[0013]所述磁微粒分离试剂中磁微粒的大小为100 μ πΓ8 μ m,磁微粒表面的活性基团为COOH 或 NH2。
[0014]所述磁微粒分离试剂，其制备方法如下:
取缓冲液3mL，吹打均匀，置于磁分离器上分离4min，弃去上清液，重复洗涤2次。清洗完毕后，加入碳二亚胺溶液，活化磁微粒，吹打均匀后，置于振荡器上，反应30mirTlh。然后加入鼠抗人免疫球蛋白G进行偶联:向活化后的磁性微粒中加入lmg/mL鼠抗人免疫球蛋白G溶液600 yL,置于振荡器上反应3?6 h ;偶联完成后,加入I mol/L甘氨酸3mL封闭磁微粒表面的活性基团，混勻后,置于振荡器上反应45 min ;加入0.1mol/mL磷酸盐吐温缓冲液3mL，混合均匀，置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤2次；最后加入含0.1mol/mL的PBS、0.5% (体积分数)羊血清白蛋白的保存液复溶磁微粒，使磁微粒的浓度为lmg/mL,置于4°C备用。
[0015]所述酶结合物，其制备方法如下:
取HRP 5mg溶于蒸懼水0.5mL中，加入60mmol/L Na1040.5mL,放置4°C,混合均匀，氧化30min，然后加入0.16mol/L乙二醇0.5mL，再置4°C终止30min。加入鼠抗人IgG 5mg，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液透析，4°C过夜，加KBH4 (5mg/mL) 0.3mL，置4度终止3h。加等容积饱和硫酸铵,4度沉淀30min后用4000r/min离心15min。沉淀物用PH7.4、0.02mol/L的PBS 0.5mL溶解，用PBS透析除铵。完成后零下20°C保存。
[0016]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0017]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【主权项】
1.降钙素原检测试剂盒，包括磁微粒分离试剂、PCT检测抗体、酶结合物、发光底物、PCT标准品、用于稀释所述酶结合物的酶稀释液；其特征是，所述磁微粒分离试剂中磁微粒偶联的蛋白分子为鼠抗人免疫球蛋白G ;所述PCT检测抗体为抗鼠IgG抗体；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG ;所述发光底物为HRP发光底物；所述HRP发光底物包括A液和B液，所述HRP发光底物的A液和B液实用时1:1混合。
2.根据权利要求1所述的降钙素原检测试剂盒，其特征是，所述HRP发光底物的A液包括光剂鲁米诺或鲁米诺衍生物、增强剂和缓冲剂，HRP发光底物的B液包括过硼酸钠和双氧水。
3.根据权利要求1所述的降钙素原检测试剂盒，其特征是，所述磁微粒分离试剂中磁微粒的大小为100 μ πΓ8 μ m，磁微粒表面的活性基团为COOH或NH2。
【专利摘要】降钙素原检测试剂盒，包括磁微粒分离试剂、PCT检测抗体、酶结合物、发光底物、PCT标准品、用于稀释所述酶结合物的酶稀释液；所述磁微粒分离试剂中磁微粒偶联的蛋白分子为鼠抗人免疫球蛋白G；所述PCT检测抗体为抗鼠IgG抗体；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG。本发明采用鼠抗人免疫球蛋白G偶联磁微粒，PCT单克隆抗体结合鼠抗人免疫球蛋白G这种间接包被模式。这种模式降低了PCT单抗的用量，从而降低了成本。通过增加偶联磁微粒的鼠抗人免疫球蛋白G的浓度，能够明显的提高检测灵敏度。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104714019
【申请号】CN201310667453
【发明人】不公告发明人
【申请人】上海国兴医疗器械有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月11日