一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测 方法。
【背景技术】
[0002] 嗜冷菌（psychrophile)是一类菌的总称，这类菌一般是在-15-20°c之间最适宜 生长，由于这个温度段与其它菌最适宜生长的温度段相比要冷许多，故此得名嗜冷菌。随着 乳品加工规模的扩大，企业对生奶的需求也逐渐增多，低温保藏和运送原料奶已成为保持 其新鲜度必不可少的条件并被广泛应用，这也就导致生奶中在7°C以下能生长的嗜冷菌成 为影响产品质量的重要危害因素。研究报道，嗜冷菌主要可以分为两种：那些只能生活在低 温且最高生长温度不超过20°C，最适生长温度等于或小于15°C，在0°C及0°C以下都可以繁 殖生长的嗜冷菌为专性嗜冷菌；将最高生长温度可以超过20°C，在0-5°C的环境中可以生 长，一般生长温度范围在0-35°C的嗜冷菌定义为兼性嗜冷菌。
[0003]目前从原料奶中分离到的嗜冷菌如假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、黄 杆菌属和克雷伯氏杆菌属、微球菌（G+)等，多数均能产生热稳定性胞外降解酶类，主要 是蛋白酶、脂肪酶和碱性磷酸脂酶。在牛乳中发现的最常见的嗜冷菌为假单胞菌属 (Pseudomonas),而其中的突光假单胞菌（P. Fluorescens)，为最主要的产酶来源。
[0004] 荧光假单胞菌又名荧光菌，之所以称之为荧光菌是因为当其存活于缺铁的环境 中，菌体会生成钳铁化合物（siderophore)-荧光色素，故得此名。荧光假单胞菌为革兰 氏阴性杆状菌，它在自然界分布很广，是一种环境污染菌，营养要求低，不需要生长因子， 在4°C时繁殖速度很快，因此它是奶类、蛋类在低温条件下保存导致腐败变质的主要细菌之 〇
[0005] 国外对嗜冷菌检测的标准方法有很多，这些方法在不断地改进，检测时间也在不 断地缩短。国际乳品联合会检测标准（IDF标准）中，对嗜冷菌的检测主要采用营养平板倾 注法：一种IDFStandard101A，该方法中嗜冷菌培养温度为4°C_6°C，培养时间为10d;另 一种IDFStandard132A嗜冷菌的培养温度为（21±5) °C，培养时间为（24±l)h。可以看 出这些方法耗时长，难以达到工厂快速检测的需要。随着科技的进步，研究者不断对嗜冷菌 的检测方法进行研究和改进，主要包括以下几种方法：直接荧光过滤法（DEFT)，电阻抗方 法，聚合酶链式扩增等检测手段。 这些方法均存在着一定的缺点，如检测前需要预先进行增菌培养以提高目标检测量， 从而提高检测的精确度，可是往往需要23-48h增菌过程，而且需要特定的仪器，对操作的 要求性较高等。因此急需研究出一种快速，高效，适于在一般企业推广开来的荧光假单胞菌 检测手段。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明将免疫磁性分离技术与ELISA有效的结合起 来，通过免疫磁珠的吸附技术，对样品中待检菌进行快速分离，从而建立一种荧光假单胞菌 免疫磁珠-酶联免疫检测方法。
[0007] 所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于按以下工艺 步骤： 1) 辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体：血清和醋酸缓冲液按体积比1:2混合，用lmol/L HCL调节pH至4. 8,逐滴加入辛酸至其终浓度为25yL/mL，4°C静置2h后离心，弃沉淀，加 入1/10体积的PBS缓冲液，用1mol/LNaOH调节pH至7. 2,加入饱和NH4 (S04) 2至其终浓度 为45%，4°C反应30min后离心，弃上清，PBS重悬沉淀，悬浮液用100倍体积PBS透析过夜， 透析物离心后，取上清于零下20°C保存备用； 2) 磁珠的活化：羧基磁珠经200w条件下超声处理lOmin后取200yL于离心管中，在样 品混合仪上震荡，将离心管置于磁分离架上，待磁珠完全被吸附后弃掉上清，加入lmLMES 缓冲液重悬磁珠，再加入100ULEDC溶液，室温条件下，在样品混合仪上活化30min，得活 化后的磁珠； 3) 磁珠的包被：用lmLMES缓冲液洗涤活化后的磁珠2遍，加入500yL纯化后的多克 隆血清抗体，室温反应过夜，即得到免疫磁珠，用lmLMES缓冲液洗涤封闭后的磁珠2遍，用 lmL含牛血清蛋白的PBS重悬磁珠，保存于4°C冰箱待用； 4) 效价的测定：采用间接ELISA进行效价测定； 5) 最佳工作浓度的确定：选用效价最高的血清，用方阵滴定法，分别稀释抗体和抗原包 被物，按步骤4)所述方法进行测定，最终选择0D450~1的抗体和抗原包被物的稀释度作 为最佳工作浓度； 6) 标准曲线的建立：选择最佳工作浓度的抗原包被，采用步骤4)所述的方法制作标准 曲线，不同之处是加抗血清步骤中，每孔加入最佳工作浓度的抗血清或免疫磁珠-抗体蛋 白90yL，同时分别加入不同稀释倍数的抗原10yL，混匀，使混合液中抗原的最终浓度依 次 0,102cfu/mL，103cfu/mL，104cfu/mL，105cfu/mL，106cfu/mL，107cfu/mL，108cfu/mL，竞争抑 制率（％) =各浓度孔的吸光值/阳性对照孔的吸光值X100% ; 7) 特异性检测：用上述建立的ELISA方法分别检测单增李斯特菌，大肠杆菌，粪肠球 菌，结果观察荧光假单胞菌的抗性血清是否会与其它细菌有交叉反应； 8) 重复性试验 板内重复性试验：应用已经建立的间接ELISA方法，使用同样的荧光假单胞菌阳性 血清或免疫磁珠-抗体蛋白偶联物分别进行检测，样品中银光假单胞菌菌落浓度依次为 105cfu/mL，106cfu/mL，107cfu/mL,每份样品重复10孔，同时设立与抗原并列的阴性对照孔 和空白对照孔，计算每份血清的0D值的平均值与标准差，进而计算每份血清的板内变异系 数； 板间重复性试验：按照已经建立的间接ELISA方法对同样的荧光假单胞菌阳性血清或 免疫磁珠-抗体蛋白分别在3块酶标板上进行检测，每板每份血清重复10孔，同时设立与 抗原并列的阴性对照空和空白对照空，测定0D值，计算每份血清的板间变异系数； 9) 样品检测：分别配置浓度依次为101，102, 103, 104, 105, 106, 107cfu/mL的荧光假单 胞菌液体，作为样品，每〇.lmL样品同偶联好的0. 9mL免疫磁珠混合，震荡孵育时间是45 min，磁分离时间是3min，捕获样品中的荧光假单胞菌，分别用已建立的IC-ELISA方法以 及免疫磁珠-酶联免疫试剂盒检测并计算回收率。
[0008] 所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤1)中醋 酸缓冲液的pH值为5. 0,浓度为0. 06mol/L，离心时间为30min，转速为lOOOOrpm。
[0009] 所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤2)中超 声处理时间为l〇min，混合仪上震荡时间为30min，EMS缓冲液的PH值为6. 0，EDC溶液的浓 度为 10mg/mL。
[0010] 所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于步骤3)中 MES缓冲液的PH值为6. 0,PBS中牛血清蛋白的含量为0. 1%。
[0011] 所述的一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法，其特征在于ELISA按以 下步骤进行测定： 1) 包被：将抗原用CBS至最佳工作浓度，即105cfu/mL，每孔100yL加入96孔酶标板， 盖上保鲜膜，37°C孵育2h; 2) 洗板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤3遍，每次洗3min; 3) 封闭：每孔加入200iiL封闭液，置于37°C恒温培养箱封闭2h;接着用PBST洗涤3 遍后拍干； 4) 加入一抗：按1:100-1:51200梯度稀释抗血清或免疫磁珠-抗体蛋白，加入酶标孔 中，每样至少重复一次，每孔加1〇〇UL，37°C孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍 干； 5) 加入二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50iiL，37°C孵育60min， 倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干； 6) 加入TMB显色剂显色：每孔100iiL，37°C避光放置10_15min; 7) 终止反应，每孔加入100yL终止液结束反应，在结束反应后20min内测定结果； 8) 酶标仪检测：TMB反应后酶标仪450nm波长读取0D450。设空白及阴性对照，分别为 PBS溶液和免疫前采集的阴性血清。
[0012] 酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是将抗原（或 抗体）吸附于固相载体上并保持其免疫活性，再加入酶