单个靶实体的免疫化学检测的制作方法
【专利说明】单个靶实体的免疫化学检测
[0001] 本申请是2010年10月15日提交的发明名称为"单个靶实体的免疫化学检测"、申 请号为"201080058058. 1"的发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明属于免疫化学可视化和定量样品中单个靶实体如单个分子、单个分子结 构、单个粒子等的领域，其中所述单个靶实体被固定化。具体地，本发明涉及用于可视化和 定量生物靶或化学靶的单个单元的方法，尤其涉及免疫化学可视化组织学样品中生物靶的 单个分子。本发明的方法包括由具有氧化还原酶活性的酶介导在样品的单个靶位点处形成 可检测分子离散沉积物的步骤，其中单个靶位点包括单个靶单位。
[0003] 发明背景
[0004] 免疫化学是医学诊断中的常用工具并且它也常用于评估治疗性生物标记。尤其， 后者经常要求定量评价治疗性生物标记存在的程度。抗体应用于细胞和组织存在特殊困 难，这些困难超过了这些试剂应用于固体支持物上固定或溶液中的纯化蛋白时所遭遇的那 些困难。。存在可能影响免疫检测的很多因素，它们当中包括组织固定及产生、抗原修复的 持续时间与类型以及和抗体特异性。另一个困难是检测低水平存在的靶的能力。与可溶性 测定法一样，这是一个增加信号而不增加非特异性本底水平的问题。最常探索的方法是信 号放大，这通过连续轮次的酶促反应来实现。
[0005] DAB是辣根过氧化物酶（HRP)的生色底物，其广泛用于以过氧化物酶活性标记的 组织学样品中靶蛋白的可视化。该方法利用与靶向样品中蛋白质的抗体连接的HRP使DAB 从溶液中沉积到靶定蛋白的位点，并且从而标记所述蛋白质。该方法不是特别灵敏，因而适 合检测相对丰富的靶蛋白。与DAB沉积物相关的信号不能进一步放大。其它要说明的缺点 是该方法需要量相当大的靶特异性抗体来饱和全部靶位点，并且该方法相对慢的。另外，该 方法产生均匀的染色模式，对于显微分析人员来说细胞结构的细胞内解析，例如细胞膜、细 胞质和细胞核是均匀的颜色，因而不能准确进行染色定量。
[0006]催化信号放大法（CSA)(在US5,863,748、5,688,966、5,767,267、5,721，158、 5, 583, 001、5, 196, 306、6, 372, 937、6, 593, 100、US6, 593, 100 中描述）应用生物素-酪胺 酰胺和突光素-酪胺酰胺（fluorescyl-tyramide)来增加来自HRP标记祀蛋白的信号，并 且因而允许检测到本来通过传统方法（即上述方法）不可检测的低丰度靶。然而，由于强 烈的本底染色以及难以解释染色结果，特别是对于荧光原位杂交（FISH)和免疫组化（IHC) 样品，临床组织病理学中从来没有广泛地接受CSA作为评价组织学样品的例行方法。
[0007] 最近，已经描述了另外一种基于HRP放大的方法，所述方法允许检测IHC样品中的 低丰度靶分子（在W02009036760、W02010094283和W02010094284中描述）。该方法没有使 用DAB作为HRP的生色底物，而是作为介导HRP沉积其它可检测性HRP底物的交联剂。该方 法引起沉积的HRP底物的信号强烈放大，这使得该方法的灵敏度与CSA法可比，不过与CSA 法相比，这新方法有利地不引起本底标记。在该方法的其它优点中，值得提到的是检测过程 的速度比传统DAB或生物素-酪胺酰胺检测过程快得多。然而，仍未解决先前方法的问题， 即基于评估检测到的染色的量来评估IHC样品中靶的量。这种新方法提供了这样的染色模 式，其非常清晰，但是胞内结构分辨率与传统DAB法或CSA法相同的均匀染色。该染色模式 不允许将样品中染色的量直接约计为样品中靶的量，因为这两种量之间的相关性不是线性 的。因此，组织学样品中由全部这些方法可视化的靶量仅可以相对而非精确地评估。
[0008] 因此，当已经改进方法学的质量保证计划并且提出了IHC染色的标准时，与解释 染色结果相关的计划却未改变。采用不同临界水平（cut-offlevel)评估组织是"阳性"或 "阴性"的不同评分体系常常用来评估抗原。这种目前使用的评估不可避免地伴随对医学诊 断可能非常重要的误差。
[0009] 基于评价样品中存在的单个靶分子的精确量评估靶表达，即所谓的单分子检测法 (SMD)法，可能是通向IHC中新评分体系的方向，这种新评分体系对于医学诊断和治疗会将 更可靠和可重复。不幸的是，允许组织学样品中的靶蛋白单分子可视化的可用技术的数目 现在是非常有限的，并且它们仍是相当费力和冗长的方法。
[0010] 基本上，全部可用的蛋白质单分子检测技术均采用基于DNA的放大体系。蛋白质 单分子检测法首次以免疫-PCR展示（SanoT，SmithCL，CantorCR.免疫-PCR:借助特 异性抗体-DNA偶联物的非常敏感的抗原检测法（Immun〇-PCR:verysensitiveantigen detectionbymeansofspecificantibody-DNAconjugates),Science1992 ;258 : 120 - 122;AdlerM，WackerR，NiemeyerCM.用于日常超灵敏定量蛋白质的实时免疫-PCR 测定法（Areal-timeimmuno-PCRassayforroutineultrasensitivequantification ofproteins),BiochemBiophysResCommun2003 ；308 ：240 - 250；NiemeyerCM,Adler M，WackerR.免疫-PCR:借助核酸扩增的高灵敏度蛋白质检测法（Immuno-PCR:high sensitivitydetectionofproteinsbynucleic酸amplification),TrendsBiotechnol 2005 ;23 :208 - 216)。使用抗体-DNA杂合结构物，抗体的亲合力由PCR可实现的敏感检测 来补偿。此外，免疫-DNA检测策略被扩展至使用滚环扩增法（RCA)，一种产生与免疫-DNA偶 联物系留（tethered)的长ssDNA低聚物的等温技术（GusevY，SparkowskiJ，Raghunathan A,FergusonHJr,MontanoJ,BogdanN,SchweitzerB,WiltshireS,KingsmoreSF, MaltzmanW，WheelerV.滚环扩增法：一种提高免疫组织化学和流式细胞术灵敏度的新 方法（Rollingcircleamplification:anewapproachtoincreasesensitivityfor immunohistochemistryandflowcytometry),AmJPathol2001 ; 159 :63 - 69) 〇
[0011] 所提到的这些SMD方法的一些明显缺点如下：
[0012] ⑴抗体-DNA杂合体的合成可能是问题，因为控制DNA偶联物的位置和每个蛋白 质的DNA偶联物的数目并不总是直接明了的，经常导致不均匀的DNA标签/抗体比例；扩增 反应难以控制；扩增步骤对温度敏感；标记是不稳定的，标记物会随着时间推移从靶弥散 等。尽管在采用内蛋白子化学（inteinchemistry)(或化学连接）将寡核苷酸标签位点特 异地与蛋白质缀合方面的最新进展已经十分成功，但偶联物产生仍是费力的；
[0013] (ii)所述方法的步骤需要控制温度；
[0014] (iii)检测过程包括太多步骤；和
[0015] (iv)整个检测过程占用相对长的时间。
[0016] 本发明的SMD方法克服上述障碍，并且使得样品中的单个靶实体可视化和量化， 其中所述单个实体是在样品中固定的并且可靠的。
[0017] 发明简述
[0018] 本发明提供快速、简单且稳健的方法，它们用于不同样品中各种单个靶实体的可 视化、检测和定量，其中所述靶是固定的。所述方法特别有利于评价复杂生物样品，如组织 学样品。
[0019] 本发明的方法包括一种新颖强大的信号放大系统，该系统可以使得大量的样品中 处于非常宽的动态浓度范围的独自单个靶实体，诸如单个分子、单个分子结构、单个分子复 合体（complex)、单个粒子等可视化。术语"单个靶实体"在此与术语"单个/独自靶单位" 可互换使用。
[0020] 本发明的方法包括如下步骤：
[0021] a)在样品中形成一个或更多个用酶活性标记的靶位点，其中，所述靶位的每一者 包含单个靶单位，其中，所述靶位点通过样品的单个靶单位的总量的部分亚群体来形成；和
[0022] b)在每个单个靶位点处形成可检测分子（也称为"报道分子"或"报告子"）的离 散沉积物。
[0023] 在一些实施方式中，由于样品可能已经包含本发明的靶位点，所以上述步骤（a) 可能是多余的。
[0024] 在其它实施方式中，本发明的方法可以包括一个或更多个其它步骤，例如
[0025] c)将单个靶位点处报道分子的离散沉积物检测为可视清晰点。
[0026] 在一个实施方式中，本发明涉及一种样品中的独自单个靶单位可视化方法（方法 (1))，其中所述靶被固定，包括：
[0027] a)用一种或多种结合剂来孵育含有大量靶的独自单位的样品，其中，
[0028] (1)所述结合剂的至少一种含有酶；
[0029] (2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个祀单位直接结合，
[0030] 并形成一个或更多个离散单个靶位点，即独自单个靶单位的部分亚群体，其中每 一单个离散单个靶位点包括所述部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的 复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；
[0031] a)在水溶液（i)中孵育（a)的样品，所述水溶液（i)含有
[0032] 量少于2mM的过氧化物化合物，
[0033] 与（a)的离散单个靶位点结合的酶的第一底物，以及，
[0034] 所述酶的第二底物，
[0035] 其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，所述有机化合物
[0036] (1)能够与所述酶反应时产生自由基；且
[0037] (2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述第二底物的分子，从 而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，
[0038] 并且，其中所述第二底物是一种偶联物分子，该偶联物分子含有适合作为所述酶 的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放 射性或生色性物质和特定特异性结合对的一个成员，
[0039] 从而在（a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并且可视化（a)的 所述单个靶位点。
[0040] 包括上述步骤（a)和（b)的本发明方法可以进一步包括检测在单个靶位点处的离 散沉积物的一个或更多个步骤。
[0041] 在一个实施方式中，上述方法（1)可以用于检测和可视化样品中的固定靶的单个 独自单位的，其中所述靶以宽泛的动态浓度范围存在，所述方法包括如下步骤：
[0042] a)将样品与一种或多种结合剂孵育，其中
[0043] (1)所述结合剂的至少一种含有酶；
[0044] (2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个祀单位直接结合，
[0045] 并且用独自单个靶单位的第一部分亚群体形成一个或更多个离散的第一靶位点， 其中每一单个的离散的第一靶位点包括独自单个单位的所述第一部分亚群体的一个独自 单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有具有氧化还原酶活性 的酶；
[0046]b)根据权利要求1的步骤（b)所述将（a)的样品与结合于（a)的第一靶位点的酶 的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体、和过氧化物化合物孵育，从而在（a)的第 一靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；
[0047]c)将（b)的样品与下述量的过氧化氢溶液孵育，所述的量足以猝灭与（a)的第一 单个靶位点结合的酶的残余活性；
[0048]d)将样品（c)与一种或多种结合剂孵育，其中 [0049] (1)所述结合剂的至少一种含有酶；
[0050] (2)所述结合剂的至少一种能够与独自的祀单位直接结合，
[0051] 从而用独自单个靶单位的第二部分亚群体形成一个或更多个离散的第二靶位点， 其中每一单个离散的第二靶位点含有独自单个单位的所述第二部分亚群体的一个独自单 位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；
[0052] e)根据上述方法⑴的步骤（b)(即权利要求1的步骤（b))所述将⑷的样品与 结合于第二单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第二群体和过氧化物化 合物孵育，从而在（d)的第二靶位点处形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；
[0053] f)在样品中将第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第 一可视清晰点，从而检测靶的第一群体的一个或更多个独自单个单位；
[0054] g)在样品中进行检测，以在第二靶