一种高通量检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高通量检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的方法及其试剂盒，属于 食品检测领域。
【背景技术】
[0002] 目前，我国液态奶的消费逐年上升，是人类理想的营养食品，但由于微生物污染繁 殖及其产生的代谢物质，发生品质劣变，严重时影响身体健康。原料奶位于乳业产业链的最 上游，其品质将直接影响到乳制品的质量和安全。原料奶从挤乳开始到加工前，处于冷链保 藏，污染的微生物主要以嗜冷菌为主，在此期间，嗜冷菌属中的某些细菌如荧光假单胞菌可 产生耐热性脂肪酶，即使经过瞬时超高温(简称UHT，135°C~150°C，3~5s)灭菌处理，脂肪 酶仍然会残留20%~30%酶活。相反的，牛乳中脂蛋白酯酶经过巴氏杀菌即可完全灭活。残 留的微生物耐热性脂肪酶造成原料乳和货架期内的巴氏乳、UHT乳等液态奶制理化和感官 品质下降，如脂肪上浮、乳脂分离、脂肪酸败、牛乳膻味和哈喇味等。由于这一情况，使我国 液态乳制品常常出现质量问题，严重影响其营养价值和消费者的健康，给乳制品企业也带 来了很大的经济损失。
[0003] 脂肪酶酶活的检测方法可以大致归结为三大类，即滴定法、平板法和比色法。滴定 法基于脂肪酶水解乳脂肪释放脂肪酸导致反应液pH降低，使用氢氧化钠溶液滴定或者pH检 测仪。平板法基于脂肪酶以三丁酸甘油脂为底物，将其水解，从而使含有三丁酸甘油脂的琼 脂产生肉眼可见的亮斑，测得亮斑的直径再通过换算即可知道乳中的脂肪酶活性。比色法 基于脂肪酶水解对硝基苯酯等物质，释放在一定波长下具有吸收峰的物质，通过测量的吸 光值来表征脂肪酶酶活性大小。另外，还有电导率法、红外线光谱法、酶偶联法等。目前，国 标中脂肪酶酶活检测采用氢氧化钠滴定法(QB/T 1803-1993)，采用橄榄油和聚乙烯醇乳化 液作为反应底物，属于滴定法的一种，此方法繁琐耗时、误差大。因此，亟需提供一种高通 量、快速地测出液态奶中脂肪酶酶活的方法。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中液态乳制品中脂肪酶酶活检测的不足，本发明的目的是提供一种 高通量、高灵敏度检测脂肪酶的方法。
[0005] 本发明首先提供一种检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的试剂盒，包括独立包装的 试剂1和试剂2;
[0006] 所述试剂1为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，所述试剂1的pH值为8.0~10.0;
[0007] 所述试剂2为对硝基苯酯的乙腈溶液。
[0008] 上述的试剂盒中，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，甘氨酸的摩尔浓度可为100~ 2〇〇mM，具体可为150mM，氢氧化钠的摩尔浓度可为38~76mM，具体可为56mM;
[0009] 所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值可为9.40。
[0010] 上述的试剂盒中，所述试剂2中，所述对硝基苯酯的摩尔浓度可为40~60mM，具体 可为50mM。
[0011] 上述的试剂盒中，所述对硝基苯酯可为对硝基苯棕榈酸酯。
[0012] 上述的试剂盒中，所述试剂盒还包括终止液，所述终止液可为乳品澄清剂，如购自 Sigma-Aldrich Co.LLC.的货号为00467、目录号为 101325727的商品。
[0013] 本发明还进一步提供了利用所述试剂盒检测液态乳制品中脂肪酶酶活性的方法， 包括如下步骤：
[0014] (1)配制至少5种标准液态乳制品，其中将脂肪酶的酶活为零的标准液态乳制品作 为空白对照品；
[0015] (2)将所述标准液态乳制品分别与所述试剂盒中的所述试剂1于酶标板中进行混 合并孵育；
[0016] (3)向所述标准液态乳制品与所述试剂1的混合液中加入所述试剂2,进行反应;所 述反应结束后加入所述终止液进行终止反应;检测所述终止反应后的体系在发射波长为 400~420nm下的吸光值，其中所述空白对照品的吸光值计为A?，脂肪酶的酶活不为零的所 述标准液态乳制品的吸光值计为稚，以所述标准液态乳制品的脂肪酶的酶活为横坐标，以 Α?隹与A?的差值作为纵坐标，制作标准曲线；
[0017] ⑷将待测液态乳制品与所述试剂1进行混合并孵育，然后重复步骤⑶，得到体系 在发射波长为400~420nm下的吸光值Affia;根据所述标准曲线和Affia，即得到待测液态乳制 品中脂肪酶的酶活性；
[0018] 所述酶活性的单位定义为:脂肪酶水解对硝基苯酯，每分钟释放Ιμπιο?对硝基苯酚 的酶量，表示为U/mL。
[0019] 上述的方法中，所述标准液态乳制品中脂肪酶的酶活性可为0U~10U，具体可为 0.011]~0.41]，如依次为0.011]、0.051]、0.101]、0.21]、0.31]或0.41] ;
[0020] 步骤(2)和(4)中，所述标准液态乳制品或所述待测液态乳制品与所述试剂1的体 积比为1:2~10,具体可为1:5;
[0021]步骤(2)和(4)中，所述孵育的温度为40~50 °C，所述孵育的时间为3~10分钟，具 体可在45 °C下孵育5分钟；
[0022] 步骤(3)中，所述试剂2与所述标准液态乳制品的体积比为1:0.5~1.5,具体可为 1:1，所述反应的温度为40~50°C，所述反应的时间为15~30分钟，具体可在45°C下反应20 分钟；
[0023] 所述终止液与所述标准液态乳制品的体积比4~6:1，具体可为5:1，所述终止反应 的温度为40~50°C，所述终止反应的时间为3~10分钟，具体可在45°C下反应5分钟；
[0024]步骤(3)和(4)中，检测体系在发射波长为405~412nm下的吸光值。
[0025] 上述的方法中，所述液态乳制品可为生鲜乳、巴氏奶、UHT乳或复原乳；
[0026]本发明中，对各种液态乳制品的定义如下：
[0027]生鲜乳:未经加工的奶畜原奶；
[0028]巴氏奶：以生鲜乳为原料，经过巴氏杀菌等工序，生产的一种低温储藏的液态奶制 品；
[0029] UHT乳：以生鲜乳为原料，经瞬时超高温(135°C~150°C，3s~5s)灭菌等工艺，生产 的一种常温液态奶；
[0030] 复原乳:炼乳或全脂奶粉，加水溶解制成的一种与生鲜乳组分相同的液态奶。
[0031] 本发明提供的液态乳制品中脂肪酶酶活性的检测方法为原料乳的分级提供了理 论依据，同时可以制定适于生产加工各种液态奶的生鲜乳质量控制指标，如预测UHT乳货架 期，科学指导UHT产品的分区销售，降低因残留脂肪酶酶活导致产品变质、维护企业利益和 消费者健康等。
[0032]本发明具有以下优点：
[0033] 1)本发明实现了将脂肪酶酶活检测与酶标仪的结合，实现高通量检测；
[0034] 2)本发明检测方法灵敏度高，脂肪酶的检测阈值低:原料乳、UHT全脂乳、巴氏全脂 奶最低检测阈值为0.05mM，UHT脱脂乳、巴氏脱脂乳最低检测阈值为O.OlmM;
[0035] 3)操作简便，省时（只需30分钟），检测结果线性度、灵敏度高；
[0036] 4)试剂使用量少，节省成本。
【附图说明】
[0037]图1为实施例1中绘制的UHT脱脂乳酶活检测曲线；
[0038] 图2为实施例2中绘制的UHT全脂乳酶活检测曲线；
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041] 下述例子中所使用的试剂、材料、仪器如下：
[0042]乙腈、氢氧化钠、对硝基苯酚:国药集团化学试剂有限公司；
[0043]甘氨酸、对硝基苯棕榈酸酯、荧光假单胞菌脂肪酶:Sigma-Aldrich Co.LLC.;
[0044] 乳制品澄清剂（Clarifying reagent for dairy products): Sigma-Aldrich Co·LLC.，货号：00467，目录号：101325727
[0045] UHT脱脂乳、UHT全脂乳:市售；
[0046] 酶标仪（BIO-RAD Model 680) :Bio_Rad Laboratories，Inc.
[0047] 实施例1、UHT脱脂乳脂肪酶酶活检测
[0048] (1)检测脂肪酶酶活性的试剂盒
[0049] 检测生物素酶酶活性的试剂盒，包括如下组分：
[0050] 试剂 1:
[0051] 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH值为9.40,其中甘氨酸的摩尔浓度为150mM，氢氧化钠 的摩尔浓度为56mM;
[0052] 试剂2:
[0053]对硝基苯棕榈酸酯的乙腈溶液，其中对硝基苯棕榈酸酯的摩尔浓度为50mM;
[0054]试剂3:
[0055]终止液，乳制品澄清剂。
[0056] (2)脂肪酶酶活性标准曲线的绘制
[0057] 1)不同脂肪酶酶活的UHT脱脂乳的配制
[0058] 分别配制脂肪酶酶活为 01]、0.011]、0.051]、0.101]、0.21]、0.31