一种免疫磁珠去除哺乳动物缺陷精子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种去除哺乳动物缺陷精子的方法，尤其是一种免疫磁珠去除哺乳动 物缺陷精子的方法。
【背景技术】
[0002] 在制作哺乳动物冷冻精液时对精子的品质有一定的要求，特别是制作性控冷冻精 液对原精有着更为严格的要求，精液品质过低就无法上机进行正常分离。有些种公畜遗传 品质好但精子品质如活力或崎形率高就无法生产性控冻精满足客户的需要，浪费大量人 力、物力资源却无法得到回报。
[0003] 目前去除死精的方法主如上浮法或percoll法，上浮法需要离屯、后将精子放在37 度水浴中一段时间后活精子游到液体上层，底层留下活力差的精子，此方法对精子损伤小 但吸上层精子时不宜把握吸取的液体量，同时精子需要在37度放置一段时间再恢复室溫对 精子存活有一定影响;percoll法是使用Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离 屯、后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的精子分离纯化。上层是活力好的精子，下层 是活力差或死精子。Percoll是化学试剂虽然无毒但对精子也有一定的作用，处理完后的精 子会出现一定获能现象，缩短存活时间。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种免疫磁珠去除哺乳动物缺陷精子的方 法，利用缺陷精子能与缺陷精子特异性抗体结合，再通过与特定免疫磁珠结合，最后利用磁 铁吸附免疫磁珠，将缺陷精子去除提高精液品质。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种免疫磁珠去除哺乳动物 缺陷精子的方法，包括W下步骤：
[0006] l)Anti-Ubiquitin 与缺陷精子结合：
[0007] 选取崎形、死精率高的鲜精，测定浓度取适量后加入0.1%PBS，混匀后室溫离屯、， 去上清，加入0.1 %PBS和Anti-Ubiquitin，混匀后，在室溫避光旋转培养30min~45min;培 养结束后，室溫离屯、，去上清，加入0.1 % PBS，悬浮精子小团；
[000引 2) Dynabeads@F*an Mouse IgG的准备：
[0009] 取奶胞6細3邮化111〇1130 1肖6加入〇.1%?85，充分震荡混匀，然后置于〇711313邑?- 5 Magnet上静置Imin~3min，吸去仍触beads?化η Mouse IgG的液体部分，再添加等量 0.1%PBS，将Dyn油eadsS叩an Mouse IgG与液体充分混匀待用；
[0010] 3)Dynabeads? 化η Mouse IgG与缺陷精子连接：将待用的 Dynabeads@hn Mouse IgG加入步骤1)悬浮好的精子中，再加入0.1%PBS，在室溫旋转培养30min~45min;培养结 束后，放在DynaMag?-5 Magnet上作用2~5min;慢慢吸出上层精液就是去除缺陷精子部分， 磁珠吸附的部分为缺陷精子部分。
[0011] 所述0.1%PBS为每100ml PBS中加入O.lg BSA,现配现用。
[0012] 所述步骤1)中室溫离屯、是指1500巧m，室溫离屯、5min~7min。
[0013] 本发明的有益效果是:通过缺陷精子特异性抗体与磁性微球偶联到达将缺陷精子 从正常精子中分离的作用。与其他方式相比，免疫磁珠技术在室溫下进行对精子损伤小，并 且使用的液体对精子无任何副作用，是稀释精子常用液体，因此处理后的精子活力和存活 所受影响小。
【附图说明】
[0014] 图1为Anti-加 iquitin与缺陷精子结合效果图（A为透射光下的精子;B为Anti- 化iquitin与缺陷精子结合效果图）；
[0015] 图2为缺陷精子与Dynabeads?化η Mouse IgG复合体效果图（A，C为为透射光下 Dynabeads<s^an Mouse IgG吸附的缺陷精子;B，D为Dynabeads?叩an Mouse IgG吸附缺陷精 子巧光效果图）。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0017]本发明中的Anti-ubiquitin中文名抗泛素抗体(MBL公司，货号MK123)
[0018] Goatanti-Mouse IgG secondaiT Antibody FITC con jugate 是巧光 FITC 标记的 山羊抗小鼠 IgG二抗（invitrogen公司，货号F2761)。
[0019] D'卵油城d.s? F*an Mouse IgG为包衷小鼠 IgG免疫磁珠（invitrogen公司，货号 11041)。
[0020] DynaMag?-5 Ma即et为磁力架(Xife Technologies公司，货号 12303D)。
[0021 ] FITC-PNA英文全称FITC-labeled peanut agglutinin,中文名花生血凝素巧光标 记(sigma公司，货号L7381)。
[0022] PBS英文全称地OS地ate buffer saline,中文名憐酸缓冲盐溶液(gibco公司，货 号14190)。
[0023] BSA英文全称Bovine Ser皿A化皿in,中文名牛血清白蛋白（BovoS化r公司）。
[0024] 0.1%PBS是 100ml PBS加入O.lg BSA,现配现用。
[0025] 实施例1缺陷精子表面特异膜蛋白抗体的筛选
[0026] 选取崎形、死精率高的鲜精，用密度仪检测原精实际浓度，按照约1千万鲜精加入 1ml~2ml 0.1%PBS，混匀后室溫离屯、，去上清，加入1ml 0.1%PBS，10yg~15yg Anti- 师iquitin(MBL，MK-12-3)混匀后，在室溫避光旋转培养30min~45min。培养结束后，室溫 150化rm离屯、5~8min，去上清，加入0.5ml~1ml 0.1 %PBS，悬浮精子小团再加入1.5~化1 Goatanti-Mouse IgG secondary Antibody FUC conjugate,室溫避光旋转培养30min~ 45min。培养结束后溫1500prm离屯、5~8min，去上清，巧光显微镜下观察。如图1，经免疫巧光 检测，缺陷精子膜表面可见绿色巧光，正常精子未见绿色巧光。因此Anti-Ubiquitin抗体抗 原位于缺陷精子膜表面，在正常精子中无法表达。
[0027] 实施例2-种免疫磁珠去除哺乳动物缺陷精子的方法，按照W下步骤完成：
[002引 1 .Anti-ubiquitin与缺陷精子结合
[0029] ①选取崎形、死精率高的鲜精作为实验样本并用密度仪检测原精实际浓度；
[0030] ②取1百万鲜精加入1ml 0.1%PBS中，轻轻混匀后，150化pm，室溫离屯、5min;
[0031] ③去上清，加入100μΙ 0.1%PBS，化g Anti-Ubiquitin，混匀后，在室溫避光旋转 培养30min;
[0032] ④培养结束后，150化pm，室溫离屯、5min，去上清；
[0033] ⑤加入1ml 0.1 %PBS，悬浮精子小团；
[0034] 2、Dynabeads@F>an Mouse IgG的准备
[0035] @取2,扣1〇7113663(13*中曰111〇1136 1旨6加入111110.1%?85中，充分震荡混匀，然后置 于DynaMag?-5 Ma即et上静置2min;
[0036] ②吸去液体部分，再添加25μ1 0.1%PBS，将磁珠与液体充分混匀待用；
[0037] 3、Dynabeads@I^n Mouse IgG与缺陷精子连接
[0038] ①将待用的25ylDy胞beads愈化η Mouse IgG加入。步骤2"悬浮好的1ml精子中（磁 珠反应体系最小为1ml)，在室溫旋转培养30min;
[0039] ②培养结束后，放在DynaMag?-5 Ma即et上作用2min;
[0040] ③慢慢吸出上层精液部分(即去除缺陷精子部分），磁珠吸附的为缺陷精子部分。
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