一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法
【专利摘要】本发明公开了一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，所述的分离方法步骤为：1）生物素标记抗精子膜蛋白抗体；2）精子与抗体的结合；3）磁珠与抗体-精子复合体的结合；4）精子与上皮细胞的分离；5）精子与磁珠的分离。本方法利用生物素标记抗精子膜蛋白抗体，通过亲和素（包被在磁珠上）偶联生物素，成功构建了磁珠-亲和素-生物素-抗体-膜抗原（精子）复合体，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高混合斑检验的能效；具有流程少、操作简单、便于普及等优点，可为自动化检验提供理论及实践基础。
【专利说明】一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫磁珠分离细胞的方法，具体涉及一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法。
【背景技术】
[0002]含有精液的混合斑是强奸案件中最常见的生物物证，其成分包括男性细胞(如精子、阴茎脱落细胞、精浆中的白细胞等)和女性细胞(如阴道上皮细胞、血液中的各种细胞等);如何分离并获得混合斑中男性成分即嫌疑人的精子并进行DNA分型是案件侦破和诉讼的关键；目前，解决混合斑DNA分型有三种途径:一是分离混合斑中来自不同个体的细胞；二是设计Y染色体特异的DNA基因座引物，用PCR特异扩增男性成分片段；三是将混合斑痕中所有的遗传标记都检测出来，然后与案件相关的所有个体进行比对分析；以上方法中第一种途径可以获得高识别率的嫌疑人DNA，其余方法获得的结果常难以认定嫌疑人，多为检验的补救措施；
[0003]第一种途径中，国内外学者建立了以下方法；一是(Gill等)利用精子外包膜和核膜富含鱼精蛋白及硫醇蛋白交联网状结构，较体细胞具有更强的耐受力的结构特点，对混合斑中的细胞进行二步消化，即第一步消化体细胞，第二步消化精子；实践证明，二步消化法存在第一步体细胞消化不完全或精子被过度消化的问题，进而导致DNA检验后仍出现混合分型、女性分型或无结果；同时，二步消化法需要两次消化，耗时长，需反复离心，自动化程度低；尽管很多学者对二步消化法进行了改良，但仍无法解决上述难题；二是(Chen等)利用精子与体细胞大小不同的特点，可利用带微小网孔的尼龙滤膜，把体积较小而呈卵圆形的精子与大而扁平的上皮细胞分离，但该方法也需要经较强烈的第一步消化，常造成精子被过度消化得不到男性分型的结局；三是(Elliot等)根据精子与体细胞形态结构差异，将光学显微技术与激光细胞切割技术相结合，利用激光捕获显微切割技术在显微镜下选取并切割精子细胞，得到单一男性DNA分型，但该方法需联合应用激光捕获显微切割仪器及低体系扩增仪器，实验条件要求苛刻，难于对批量检材检验，且不利于基层实验室的普及。
【发明内容】
[0004]针对以上问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种流程少、操作简单、便于普及、分离效果好的免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，包括以下步骤:
[0006]I)生物素标记抗精子膜蛋白抗体:
[0007]向浓度为5mg/mL的M0SPD3抗体或浓度为5mg/mL的Anti_SPAG8抗体中加入浓度为 lmg/mL 的 Sulfo-NHS-LC-Biotin，抗体与 Sulfo-NHS-LC-Biotin 的体积比为 10:3 ?5，在离心管中混匀后3?5°C反应48?72小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.0lmol/L，pH7.2的PBS3?5°C透析12?24小时；得到M0SPD3-生物素偶联物或Anti_SPAG8生物素偶联物；
[0008]2)精子与抗体的结合:
[0009]向精子与上皮细胞混合悬液中加入上述生物素标记的M0SPD3抗体或Anti_SPAG8抗体，置于Thermomixer comfort上孵育；离心，弃去上清液后加入预冷的洗漆液，震荡后离心，弃去上清，得到抗体-精子复合体；
[0010]3)磁珠与抗体-精子复合体的结合:
[0011]向步骤2)得到的抗体-精子复合体中加入吸附液，震荡混匀后加入磁珠，室温孵育30?45分钟；
[0012]4)精子与上皮细胞的分离:
[0013]将步骤3)中的离心管置于磁分离架上吸附5?10分钟，吸弃液体；加入洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次；
[0014]5)精子与磁珠的分离:
[0015]向步骤4)中的离心管内加入300?500 μ L洗脱液，震荡，56?65°C放置5?10分钟后再次置于磁分离架上吸附3?5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。
[0016]本发明应用免疫荧光技术检测筛选精子表面特异膜抗体，利用生物素标记上述抗体，通过亲和素(包被在磁珠上)偶联生物素，成功构建了磁珠-亲和素-生物素-抗体-膜抗原(精子)复合体，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高混合斑检验的能效；针对免疫分选技术应用于法医物证学领域存在的技术难点与关键点，简化了反复洗涤离心的繁琐过程，节省了二步消化的时间，特异抗体的应用，可特异性选择靶细胞，避免了差异裂解法混合分型问题。
[0017]步骤2中所述向精子与上皮细胞混合悬液中加入生物素标记的抗体，按照IO3?IO5个精子加0.1?0.5 μ g抗体的比例加入抗体；所述孵育的条件为37°C 800?1200rpm孵育I?2小时或4°C孵育12?24小时。
[0018]步骤3中所述加入的磁珠量按照抗体-精子复合体与磁珠的个数比为1:8?20加入。
[0019]所述洗涤液为0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA, 2mM EDTA, ρΗ7.2。
[0020]所述吸附液为0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA, ρΗ7.2。
[0021]所述的磁珠直径为2.8μπι。选择的磁珠大小与精子头部大小相当，捕获能力强。
[0022]有益效果:本发明应用免疫荧光技术检测筛选精子表面特异膜抗体，利用生物素标记上述抗体，通过亲和素(包被在磁珠上)偶联生物素，成功构建了磁珠-亲和素-生物素-抗体-膜抗原(精子)复合体，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高混合斑检验的能效；针对免疫分选技术应用于法医物证学领域存在的技术难点与关键点，简化了反复洗涤离心的繁琐过程，节省了二步消化的时间，特异抗体的应用，可特异性选择靶细胞，避免了差异裂解法混合分型问题；本方法利用磁珠与抗体间磁珠-亲和素-生物素-抗体偶联的方式，选择磁珠(包被亲和素)大小为2.8 μ m，与精子头部大小相当，捕获能力强；同时，抗体经生物素标记，利用了亲和素、生物素的级联放大偶联效应，与二抗修饰的磁珠相t匕，可以保证精子细胞-抗体-生物素与亲和素-磁珠最大量的结合，可达到最大化捕获分离精子细胞的能力；本方法具有流程少、操作简单、便于普及等优点，可为自动化检验提供理论及实践基础；
[0023]说明书附图:
[0024]图1为本发明的免疫磁珠分选原理模式示意图；
[0025]图2为本发明的精子膜蛋白抗体与精子免疫荧光检测结果图；
[0026]图2-A为透射光下的精子；
[0027]图2-B为DAPI对精子细胞核染色效果图；
[0028]图2-C为M0SPD3与精子结合效果图；
[0029]图2-D为图2-B和图2-C的复合效果图；
[0030]图3为本发明的精子-磁珠复合体图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
[0032]本发明中的M0SPD3 为 Motile Sperm Domain-containing Protein3 的缩写，中文名称为:精子运动结构域3抗体(Abnova公司，台湾)
[0033]Anti_SPAG8为Sperm Associated Antigen8的缩写，中文名称为:精子相关抗原8抗体(Abeam公司，美国)
[0034]Thermomixer comfort:恒温混勻仪(Eppendorf 公司，德国)
[0035]Sulfo-NHS-LC-Biotin:6_[生物素酰氨基]己酸磺基琥拍酰亚胺酯(PierceCorporation 公司,美国)
[0036]实施例一、精子表面稳定特异的膜蛋白抗体的筛选
[0037]取精子细胞及口腔上皮细胞悬液各0.2mL(约IO4个)涂于粘附载玻片上，置于37°C电热恒温箱烤干或20?25°C晾干，固定液(4%?6%多聚甲醛，0.01?0.02mM EDTA)固定10?15分钟，0.5%?l%Triton-100透明15?20分钟，放入修复液(0.01?0.02mol/L柠檬酸盐，pH6.0,0.01?0.02mol/L EDTA)中置于微波炉中煮沸10?15分钟，山羊血清(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)封闭15分钟后加入抗精子膜蛋白抗体(M0SPD3或Ant1-SPAG8) 4°C孵育12小时，加入AlExa Fluor488标记抗小鼠IgG (荧光显微镜下呈绿色荧光)，37°C电热恒温箱孵育I小时，DAPI染色15分钟，荧光显微镜下观察。如图2，经免疫荧光检测，精子膜表面可见绿色荧光，精子细胞核呈蓝色荧光。上皮细胞未见绿色荧光。因此，M0SPD3或Ant1-SPAG8抗体抗原位于精子膜表面，在上皮细胞无表达。
[0038]实施例二、一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，按照以下步骤完成:
[0039]I)生物素标记抗精子膜蛋白抗体:
[0040]向ImL浓度为5mg/mL的M0SPD3抗体或ImL浓度为5mg/mL的Anti_SPAG8抗体中加Λ 300 μ L浓度为lmg/mL的Sulfo-NHS-LC-Biotin，离心管中混匀后4°C反应72小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.01mol/L, pH7.2的PBS4°C透析16小时；得到M0SPD3-生物素偶联物或Ant1-SPAG8生物素偶联物；紫外/分光光度计检测280nm的吸光度，测得抗体浓度分别为 0.75mg/mL、0.59mg/mL,摩尔浓度为 5.01 X 10 6mol/L、3.921 X 10 6mol/L,用生物素定量试剂盒(Pierce Corporation, USA)检测生物素摩尔浓度为1.02 X 10_5mol/L,生物素/抗体偶联比为2.04、2.76。[0041]2)精子与抗体的结合:
[0042]向混合斑(含有IO3个精子与IO5个上皮细胞)中加入0.1yL上述生物素标记的 M0SPD3 抗体或 Anti_SPAG8 抗体，置于 Thermomixer comfort (Eppendorf 公司，德国)上37°C 800rpm孵育I小时；离心，弃去上清液后加入300 μ L4°C预冷的洗涤液，震荡后5000rpm离心3分钟，弃去上清，得到抗体-精子复合体；
[0043]3)磁珠与抗体-精子复合体的结合:
[0044]向步骤2)得到的抗体-精子复合体中加入300 μ L0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA,pH7.2的吸附液，震荡混匀后加入8 X IO3个磁珠，室温孵育30分钟；
[0045]4)精子与上皮细胞的分离:
[0046]将步骤3)中的离心管置于磁分离架上吸附5分钟，吸弃液体；加入300 μ L0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA, 2mM EDTA, pH7.2的洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，
重复两次；
[0047]5)精子与磁珠的分离
[0048]向步骤4)中的离心管内加入300μ L洗脱液,震荡,65°C放置5分钟后再次置于磁分离架上吸附5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。
[0049]实施例三、一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，按照以下步骤完成:
[0050]I)生物素标记抗精子膜蛋白抗体:
[0051]向ImL浓度为5mg/mL的M0SPD3抗体中加入400 μ L浓度为lmg/mL的Sulfo-NHS-LC-Biotin，离心管中混匀后4°C反应48小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.01mol/L, ρΗ7.2的PBS4°C透析12小时;得至Ij M0SPD3-生物素偶联物；
[0052]2)精子与抗体的结合:
[0053]向混合斑(含有IO4个精子与IO5个上皮细胞)中加入0.2 μ L生物素标记的M0SPD3抗体，置于Thermomixer comfort上4°C 800rpm孵育18小时；5000rpm离心3分钟，弃去上清后加入400uL4°C预冷的0.01mol/L PBS, 0.5%BSA, 2mM EDTA, pH7.2的洗涤液，震荡后5000rpm离心3分钟，弃去上清，得到抗体-精子复合体；
[0054]3)磁珠与抗体-精子复合体的结合:
[0055]向步骤2)得到的抗体-精子复合体中加入400uL0.0lmol/L PBS,0.5%BSA,pH7.2的吸附液，震荡混匀后加入15 X IO4个磁珠，室温孵育30分钟；
[0056]4)精子与上皮细胞的分离:
[0057]将步骤3)中的离心管置于磁分离架上吸附5分钟，吸弃液体；加入400uL0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA, 2mM EDTA, pH7.2的洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次；
[0058]5)精子与磁珠的分离:
[0059]向步骤4)中的离心管内加入400 μ L洗脱液，震荡，56°C放置10分钟后再次置于磁分离架上吸附3分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。
[0060]实施例四、一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，包括以下步骤:
[0061]I)生物素标记抗精子膜蛋白抗体:
[0062]向ImL浓度为5mg/mL的Anti_SPAG8抗体中加入500 μ L浓度为lmg/mL的Sulfo-NHS-LC-Biotin，离心管中混匀后4°C反应60小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.0lmol/L, ρΗ7.2的PBS4°C透析24小时;得至Ij Anti_SPAG8生物素偶联物；
[0063]2)精子与抗体的结合:
[0064]向混合斑(含有IO5个精子与IO5个上皮细胞)中加入0.3yL生物素标记的 Anti_SPAG8 抗体，置于 Thermomixer comfort 上 37 °C 1200rpm 孵育 2h 或 4 °C 孵育24h ；8000rpm 离心 5min,弃去上清后加入 500 μ L 预冷的 0.0lmol/LPBS, 0.5%BSA, 2mMEDTA, pH7.2的洗涤液，震荡后8000rpm离心5分钟，弃去上清，得到抗体-精子复合体；
[0065]3)磁珠与抗体-精子复合体的结合:
[0066]向步骤2)得到的抗体-精子复合体中加入500 μ L0.0lmol/L PBS，0.5%BSA，pH7.2的吸附液，震荡混匀后加入20 X IO6个磁珠，室温孵育45分钟；
[0067]4)精子与上皮细胞的分离:
[0068]将步骤3)中的离心管置于磁分离架上吸附lOmin，吸弃液体；加入500 μ L0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA, 2mM EDTA, pH7.2的洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，
重复两次；
[0069]5)精子与磁珠的分离:
[0070]向步骤4)中的离心管内加入500μ L洗脱液,震荡,65°C放置5分钟后再次置于磁分离架上吸附5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。
[0071]实施例五、分离效果的评价
[0072]I)将磁珠-抗体-精子结合后洗涤三次的悬液涂片，经伊红-苏木素染色，显微镜下观察，如图3所示，可见精子细胞结构完整，磁珠大小与精子头部体积相当，每个精子细胞结合两个以上的磁珠，磁珠与精子细胞结合位置以精子细胞头部、尾部为主，未见上皮细胞混入；
[0073]2)取10 μ L回收的洗脱液涂片后，经伊红-苏木素染色，显微镜下观察，可见精子细胞，未见上皮细胞；
[0074]3)提取回收液中的细胞DNA，应用Identifiler-Plus复合扩增体系扩增，扩增产物经AB1-3130XL型遗传分析仪电泳及激光扫描分析，应用GeneMapperV3.2软件分析；经检验，当每毫升内含IO3个精子细胞和IO5上皮细胞时，80%得到单一男性分型(正确分型13个以上位点，RFU > 200);当每毫升内含IO4个精子细胞和IO4上皮细胞时均得到单一男性分型(正确分型13个以上位点，RFU > 200)。
【权利要求】
1.一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，包括以下步骤: O生物素标记抗精子膜蛋白抗体: 向浓度为5mg/mL的M0SPD3抗体或浓度为5mg/mL的Anti_SPAG8抗体中加入浓度为lmg/mL 的 Sulfo-NHS-LC-Biotin,抗体与 Sulfo-NHS-LC-Biotin 的体积比为 10:3 ?5,在离心管中混匀后3?5°C反应48?72小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.0lmol/L,pH7.2的PBS3?5°C透析12?24小时；得到M0SPD3-生物素偶联物或Anti_SPAG8生物素偶联物； 2)精子与抗体的结合: 向精子与上皮细胞混合悬液中加入上述生物素标记的M0SPD3抗体或Ant1-SPAG8抗体，置于Thermomixer comfort上孵育；离心，弃去上清液后加入预冷的洗漆液，震荡后离心，弃去上清，得到抗体-精子复合体； 3)磁珠与抗体-精子复合体的结合: 向步骤2)得到的抗体-精子复合体中加入吸附液，震荡混匀后加入过量磁珠，室温孵育30?45分钟； 4)精子与上皮细胞的分离: 将步骤3)中的离心管置于磁分离架上吸附5?10分钟，吸弃液体；加入洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次； 5)精子与磁珠的分离: 向步骤4)中的离心管内加入300?500 μ L洗脱液，震荡，56?65°C放置5?10分钟后再次置于磁分离架上吸附3?5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。
2.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于:步骤2中所述向精子与上皮细胞混合悬液中加入生物素标记的抗体，按照IO3?IO5个精子加0.1?0.5 μ g抗体的比例加入抗体；所述孵育的条件为37°C 800?1200rpm孵育I?2小时或4°C孵育12?24小时。
3.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于:步骤3中所述加入的磁珠量按照抗体-精子复合体与磁珠的个数比为1:8?20加入。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于:所述洗涤液为0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA, 2mM EDTA, pH7.2。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于:所述吸附液为0.0lmol/L PBS, 0.5%BSA, pH7.2。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于:所述的磁珠直径为2.8 μ m。
【文档编号】G01N33/53GK103592432SQ201310481186
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】李红卫, 王清山, 李学博, 封宇, 宁淑华, 王业全 申请人:重庆市公安局