一种用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒，包括分别装有活化磁性微球；洗涤液；偶联缓冲液；封闭缓冲液；保存缓冲液的试管。其中，活化磁性微球的制备过程包括（1）各取500mL N,N?二甲基乙酰胺（DMAC）和异丙醇过4A分子筛；（2）取羧基磁珠用DMAC洗涤两至三次；（3）在洗涤后的羧基磁珠中加入DMAC和N?羟基琥珀酰亚胺，40℃反应0.5h；（4）收集反应产物，用异丙醇洗涤两次，最后加入异丙醇配制成10mg/mL的活化磁珠悬浮液，4℃保存。本发明解决了用户在磁珠活化、配体偶联、磁珠封闭等过程中操作繁琐、复杂的难题，简化了操作步骤，实现资源的合理利用。
【专利说明】
一种用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物试剂盒材料领域，具体涉及一种用于蛋白、抗体、酶及核酸偶联的试剂盒及其配备方法，可快速、简便、高效地将蛋白、抗体、酶、氨基修饰的核酸及其它带氨基的分子共价偶联到活化磁性微球上，偶联配体后的磁珠可用于检测、分离纯化等。
【背景技术】
[0002]免疫磁珠是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。
[0003]运用核-壳结构微球的制备方法，以单分散的聚合物微球为模板，将磁性物质沉积在模板微球内部或包裹在模板微球表面，合成含有超顺磁性物质，表面覆盖无机物或高分子聚合物的复合材料。这类复合材料具有超顺磁性，能够在磁场作用下实现固液分离，在分析检测中很方便配合仪器实现全自动化操作；同时这类复合材料还具有均一的粒径、巨大的表面积、优异的稳定性，利用这些物质表面的功能基团如氨基、羧基、醛基、巯基等进行抗体的共价偶联，可用于结合相应的抗原或抗体，这样在外加磁场的作用下可做定向移动，从而可以实现对基因、蛋白质、细胞、微生物等的分离、检测和纯化的目的。其在免疫检测、基因提取、蛋白纯化、细胞分离、微生物富集等方面具有广泛的应用。
[0004]随着免疫磁珠在医学、生物学、食品安全等领域应用越来越广泛，一个很现实的问题摆在应用者的面前:如何才能够将需要的生物分子，如蛋白、抗体、酶、核酸探针等简便、快速、高效地共价偶联到磁珠上?特别是对于医学、生物学、食品学等专业的应用人员，由于缺乏对基团活化及偶联等化学反应相关的知识，因此对磁珠表面的基团进行改性、活化及配体偶联就成了他们的操作弱项。比如在实际应用中利用羧基磁珠偶联抗体，经常遇到的问题就包括:采用哪种活化剂？活化剂的加入量、活化温度及活化时间是多少?抗体偶联的条件是什么?对于非专业人员或初学者来讲，这些考虑因素严重制约了操作的熟练性。
[0005]针对以上问题，能否通过各自所掌握的专业知识，开发出一种能够方便快速操作的试剂盒，该试剂盒提供已经活化好的磁珠及各个步骤需要用到的缓冲液等试剂，这样即使是从没做过配体偶联的操作人员也轻松地成功将配体偶联到磁珠上，以便后续应用，从而避免操作人员在磁珠活化、缓冲液和反应条件筛选等工序上面消耗过多的精力，节省了人力、物力及时间，提高操作效率，降低操作失误。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒及相关试剂配备方法，可快速、简便、高效地将蛋白、抗体、酶、氨基修饰的核酸及其它带氨基的分子共价偶联到活化磁性微球上，偶联配体后的磁珠可用于检测、分离纯化等。
[0007]本发明解决上述问题所采用的技术方案为:一种用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒，包括分别装有活化磁性微球;洗涤液;偶联缓冲液;封闭缓冲液;保存缓冲液的试管。
[0008]上述试剂盒的制备方法，包括如下主要步骤:
一、活化磁性微球的制备过程如下
(1)各取500mLN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)和异丙醇过4A分子筛；
(2)取羧基磁珠用DMAC洗涤两至三次；
(3 )在洗涤后的羧基磁珠中加入DMAC和N-羟基琥珀酰亚胺，40 °C反应0.5h;
(4)收集反应产物，用异丙醇洗涤两次，最后加入异丙醇配制成10mg/mL的活化磁珠悬浮液，4 °C保存。
[0009]二、洗涤液的配备过程为，取纯化水IL，加入浓盐酸调节pH为2.5?5.0,0.22μηι滤膜过滤，4°C保存。
[0010]三、偶联缓冲液的配备过程为:取3-(N-吗啉)丙磺酸(M0PS)20.926g和氯化钠8.788溶于11^纯化水中，加入5M氢氧化钠溶液调节pH为5.0?8.0，0.22μπι滤膜过滤，4°C保存。
[0011 ]四、封闭缓冲液的配备过程为:取乙醇胺溶液168.24g溶于600mL纯化水中，加入浓盐酸调节pH为8.0?9.0，接着加纯化水定容至IL，最后0.22μπι滤膜过滤，4°C保存。
[0012]五、保存缓冲液的配备过程为:
(1)分别称取NaCl8g，KCl 0.2g,Na2HPO4-12H20 3.63g,KH2PO4 0.24g于2L烧杯中；
(2)用量筒量取900mL纯化水于2L烧杯中，玻璃棒搅拌使固体充分溶解；
(3)用0.IM盐酸调pH值至6.5?7.5 ；
(4)用ImL移液器取ImLproclin300于2L烧杯中，玻璃棒充分搅拌均勾；
(5)将烧杯中的溶液倒入IL容量瓶中，加纯化水定容到IL;
(6)将e中所配溶液用0.22ynr2i膜过滤，4°C保存备用。
[0013]上述活化磁性微球的粒径为0.1?ΙΟΟμπι。
[0014]活化磁性微球表面材质为无机物如二氧化硅、人工合成聚合物如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯或天然聚合物如琼脂糖、葡聚糖、纤维素。
[0015]优选地，活化磁性微球表面活化基团N-羟基琥珀酰亚胺的含量为20?2000μπιΟ1/
g°
[0016]本发明中，洗涤液还可以是pH值2.5?5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸水溶液或pH值2.5?5.0的MOPS溶液。
[0017]本发明中，偶联缓冲液还可以是pH值5.0?8.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
[0018]本发明中，封闭缓冲液还可以是pH值8.0?9.0的Tris.HCl缓冲液或甘氨酸溶液。
[0019]由于表面活性基团N-羟基琥珀酰亚胺极易水解，传统的水相制备过程中，N-羟基琥珀酰亚胺的形成与水解是同时进行的，最终达到一种动态平衡，传统的水相合成法，N-羟基琥珀酰亚胺活化基团的含量往往较低，不利于后续配体的偶联，同时活化基团的水解反应也不利于活化磁性微球的长期保存，这也是配备过程和保存过程中存在的难题，制约了相关试剂盒的发展。本发明通过采用有机合成法替代传统的水相合成法，同时通过分子筛处理技术去除有机溶剂中的微量水分，达到了制备高活化基团含量和实现活化磁性微球长期保存的目的，为制备商品化的试剂盒奠定了基础。
[0020]本发明的有益效果主要体现在为用户提供了一种试剂盒，让利用磁珠进行蛋白、抗体、酶和核酸的快速偶联的操作成为现实，解决了用户在磁珠活化、配体偶联、磁珠封闭等过程中碰到的问题，简化了操作步骤，实现资源的合理利用。
[0021 ]本试剂盒在进行蛋白、抗体、酶和核酸偶联时具有如下优点:
(I)操作简单。只需将配体溶于试剂盒自带的偶联缓冲液，然后与活化磁珠室温混合
0.5?Ih便可将配体共价偶联到磁珠上，即使是从未做过的新手也能轻松完成，而且成功率尚;
(2 )快速。整个配体偶联过程约2h便可完成，而常规的磁珠活化、配体偶联、磁珠封闭过程需要5h，时间比原来节约了 60%。
[0022](3)适用范围较广。适合于蛋白、抗体、酶、氨基修饰的核酸及其它带氨基的分子；
(4)配体偶联效率和偶联量高。在核心的活化磁性微球制备过程中，通过引入有机相合成法，制备高N-羟基琥珀酰亚胺含量的活化磁性微球，提高了生物配体的偶联效率及偶联量。
【具体实施方式】
[0023]以下结合具体实施例对本发明进行说明，所举的实施例仅是对本发明产品或方法作概括性例示，有助于更好地理解本发明，但并不会限制本发明范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0024]本实施例的用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒，包括分别装有活化磁性微球;洗涤液;偶联缓冲液;封闭缓冲液;保存缓冲液的试管。
[0025]上述试剂盒的制备方法，包括如下主要步骤:
一、活化磁性微球的制备过程如下
(1)各取500mLN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)和异丙醇过4A分子筛；
(2)取羧基磁珠用DMAC洗涤两至三次；
(3 )在洗涤后的羧基磁珠中加入DMAC和N-羟基琥珀酰亚胺，40 °C反应0.5h;
(4)收集反应产物，用异丙醇洗涤两次，最后加入异丙醇配制成10mg/mL的活化磁珠悬浮液，4 °C保存。
[0026]二、洗涤液的配备过程为，取纯化水IL，加入浓盐酸调节pH为2.5?5.0,0.22μηι滤膜过滤，4°C保存。
[0027]三、偶联缓冲液的配备过程为:取3-(N_吗啉)丙磺酸(M0PS)20.926g和氯化钠
8.788溶于11^纯化水中，加入5M氢氧化钠溶液调节pH为5.0?8.0，0.22μπι滤膜过滤，4°C保存。
[0028]四、封闭缓冲液的配备过程为:取乙醇胺溶液168.24g溶于600mL纯化水中，加入浓盐酸调节pH为8.0?9.0，接着加纯化水定容至IL，最后0.22μπι滤膜过滤，4°C保存。
[0029]五、保存缓冲液的配备过程为:
(I)分别称取NaCl 8g，KCl 0.2g,Na2HPO4-12H20 3.63g,KH2PO4 0.24g于2L烧杯中； (2)用量筒量取900mL纯化水于2L烧杯中，玻璃棒搅拌使固体充分溶解；
(3)用0.IM盐酸调pH值至6.5?7.5 ；
(4)用ImL移液器取ImLproclin300于2L烧杯中，玻璃棒充分搅拌均勾；
(5)将烧杯中的溶液倒入IL容量瓶中，加纯化水定容到IL;
(6)将e中所配溶液用0.22ynr2i膜过滤，4°C保存备用。
[0030]
实施例1 Protein A偶联
1.Protein A溶液配制:分析天平称取1mg Protein A溶于1mL试剂盒自带的偶联缓冲液中，配成lmg/mL的Protein A溶液；
2.活化磁珠洗涤:取200mg活化磁性微球，用1mL试剂盒自带的洗涤液快速洗涤I次，磁吸使磁珠贴壁后去除洗涤液；
3.配体偶联:将步骤I中配制的ProteinA溶液加入到步骤2中洗涤后的磁珠中，通过振荡将磁珠与配体溶液混合均匀后，置于混合仪上，缓慢旋转，室温反应Ih，便可将proteinA共价偶联到磁珠上；
4.活化磁珠封闭:将步骤3中偶联了ProteinA的磁珠悬浮液置于磁性分离架上，磁吸使磁珠贴壁后，去除Pr ο t e i n A溶液。加入2 OmL试剂盒自带的封闭缓冲液，通过振荡将磁珠与封闭缓冲液混合均匀，而后置于混合仪上，缓慢旋转，室温反应lh，对磁珠上剩余的活化位点进行封闭；
5.洗涤及保存:将步骤4中封闭后的磁珠悬浮液置于磁性分离架上，磁吸使磁珠贴壁后，去除封闭缓冲液。然后加入20mL试剂盒自带的保存缓冲液快速洗涤I次，重复上述洗涤步骤一次；
6.最后再次加入适量保存缓冲液将磁珠配置成一定工作浓度的磁珠悬浮液，置于4°C
保存备用。
[0031]
实施例2
癌胚抗原(CEA)抗体偶联
1.CEA溶液配制:将CEA抗体用试剂盒自带的偶联缓冲液中配成0.2mg/mL;
2.活化磁珠洗涤:取1mg活化磁性微球，用ImL试剂盒自带的洗涤液快速洗涤I次，磁吸使磁珠贴壁后去除洗涤液；
3.配体偶联:将步骤I中配制的CEA溶液0.5mL加入到步骤2中洗涤后的磁珠中，通过振荡将磁珠与配体溶液混合均匀后，置于混合仪上，缓慢旋转，室温反应Ih，便可将抗体共价偶联到磁珠上；
4.活化磁珠封闭:将步骤3中偶联了CEA的磁珠悬浮液置于磁性分离架上，磁吸使磁珠贴壁后，去除CEA溶液。然后加入ImL试剂盒自带的封闭缓冲液，通过振荡将磁珠与封闭缓冲液混合均匀后，置于混合仪上，缓慢旋转，室温反应lh，对磁珠上剩余的活化位点进行封闭；
5.洗涤及保存:将步骤4中封闭后的磁珠悬浮液置于磁性分离架上，磁吸使磁珠贴壁后，去除封闭缓冲液。而后加入ImL试剂盒自带的保存缓冲液快速洗涤I次，重复上述洗涤步骤一次； 6.最后加入适量保存缓冲液将磁珠配置成一定工作浓度的磁珠悬浮液，置于4°C保存备用。
[0032]
实施例3
氨基修饰核酸探针偶联
I.核酸探针溶液配制:取30nmol氨基修饰的核酸探针溶于150yL试剂盒自带的偶联缓冲液中；
2.活化磁珠洗涤:取1mg活化磁性微球，用ImL试剂盒自带的洗涤液快速洗涤I次，磁吸使磁珠贴壁后去除洗涤液；
3.配体偶联:将步骤I中配制的核酸探针溶液150yL加入到步骤2中洗涤后的磁珠中，通过振荡将磁珠与配体溶液混合均匀后，置于混合仪上，缓慢旋转，室温反应Ih，便可将配体共价偶联到磁珠上；
4.活化磁珠封闭:将步骤3中偶联了核酸探针的磁珠悬浮液置于磁性分离架上，磁吸使磁珠贴壁后，去除核酸探针溶液。然后加入ImL试剂盒自带的封闭缓冲液，通过振荡将磁珠与封闭缓冲液混合均匀后，置于混合仪上，缓慢旋转，室温反应lh，对磁珠上剩余的活化位点进行封闭；
5.洗涤及保存:将步骤4中封闭后的磁珠悬浮液置于磁性分离架上，磁吸使磁珠贴壁后，去除封闭缓冲液。然后加入ImL试剂盒自带的保存缓冲液快速洗涤I次，重复上述洗涤步骤一次；
6.最后再次加入适量保存缓冲液将磁珠配置成一定工作浓度的磁珠悬浮液，置于4°C保存备用。
[0033]除上述实施例外，本发明还包括有其他实施方式，凡采用等同变换或者等效替换方式形成的技术方案，均应落入本发明权利要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒，其特征在于:包括分别装有活化磁性微球;洗涤液;偶联缓冲液;封闭缓冲液;保存缓冲液的试管。2.—种根据权利要求1所述的用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特征在于:包括如下步骤， 一、活化磁性微球的制备过程如下 (1)各取500mLN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)和异丙醇过4A分子筛； (2)取羧基磁珠用DMAC洗涤两至三次； (3 )在洗涤后的羧基磁珠中加入DMAC和N-羟基琥珀酰亚胺，40 °C反应0.5h; (4)收集反应产物，用异丙醇洗涤两次，最后加入异丙醇配制成10mg/mL的活化磁珠悬浮液，4 °C保存； 二、洗涤液的配备过程为，取纯化水1L，加入浓盐酸调节pH为2.5?5.0，0.22μm滤膜过滤，4°C保存； 三、偶联缓冲液的配备过程为:取3-(N-吗啉)丙磺酸(M0PS)20.926g和氯化钠8.78g溶于IL纯化水中，加入5M氢氧化钠溶液调节pH为5.0?8.0，0.22μπι滤膜过滤，4°C保存； 四、封闭缓冲液的配备过程为:取乙醇胺溶液168.24g溶于600mL纯化水中，加入浓盐酸调节pH为8.0?9.0，接着加纯化水定容至IL，最后0.22μπι滤膜过滤，4°C保存； 五、保存缓冲液的配备过程为: (I)分别称取NaCl 8g，KCl 0.2g,Na2HPO4-12H20 3.63g,KH2PO4 0.24g于2L烧杯中； (2 )用量筒量取900mL纯化水于2L烧杯中，玻璃棒搅拌使固体充分溶解； (3)用0.1M盐酸调pH值至6.5?7.5; (4)用ImL移液器取ImLproclin300于2L烧杯中，玻璃棒充分搅拌均勾； (5)将烧杯中的溶液倒入IL容量瓶中，加纯化水定容到IL; (6)将e中所配溶液用0.22ynr2i膜过滤，4°C保存备用。3.根据权利要求2所述用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特征在于:所述活化磁性微球的粒径为0.1?ΙΟΟμπι。4.根据权利要求2或3所述用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特征在于:所述活化磁性微球表面材质为无机物、人工合成聚合物或天然聚合物。5.根据权利要求4所述用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特征在于:所述无机物为二氧化硅，所述人工合成聚合物为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，所述天然聚合物为琼脂糖、葡聚糖、纤维素。6.根据权利要求2或3所述用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特征在于:所述活化磁性微球表面活化基团N-羟基琥珀酰亚胺的含量为20?2000ymOl/g。7.根据权利要求2所述用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特征在于:所述洗涤液还可以是pH值2.5?5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸水溶液或pH值2.5?5.0的MOPS溶液。8.根据权利要求2所述用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特征在于:所述偶联缓冲液还可以是PH值5.0?8.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。9.根据权利要求2所述用于蛋白、抗体、酶及核酸快速偶联的试剂盒的制备方法，其特 征在于:所述封闭缓冲液还可以是pH值8.0?9.0的Tris.HCl缓冲液或甘氨酸溶液。
【文档编号】G01N33/543GK106093377SQ201610661895
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月12日 公开号201610661895.2, CN 106093377 A, CN 106093377A, CN 201610661895, CN-A-106093377, CN106093377 A, CN106093377A, CN201610661895, CN201610661895.2
【发明人】谭建雄, 奚伟红
【申请人】江苏福隆生物技术有限公司