纳米粒子-抗体偶联物的纯化的制作方法
【专利说明】纳米粒子-抗体偶联物的纯化 相关专利申请是交叉引用
[0001] 本申请要求基于2014年6月25日提交的第62/016, 752号美国临时申请的优先 权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
【背景技术】
[0002] P-点纳米粒子（如第US2012/0282632号专利公开中所述）有很强的荧光，偶联于 抗体或其他蛋白质时是有用的报道子。抗体与纳米粒子之间的偶联反应通常采用过量抗体 以获得最适偶联比。偶联后，偶联物需与过量游离抗体分离，因为未偶联的抗体会与偶联物 竞争目标物结合。由于游离抗体与纳米粒子大小和密度相近，这成了难题。 发明概述
[0003] 在此提供的是将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化的方法。一些实施 方式中，所述方法包括：提供抗体-纳米粒子偶联物、游离抗体、聚二醇表面活性剂和缓冲 液的混合物，该混合物的离子强度至少50mM ;该混合物与基于多糖的大小排阻介质接触由 此将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离；从介质中收集富集了所述抗体-纳米粒子偶 联物的级份，由此与游离抗体分离并纯化。
[0004] -些实施方式中，基于多糖的大小排阻介质包含琼脂糖。
[0005] -些实施方式中，缓冲液包含磷酸盐。一些实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲液 (PBS)。一些实施方式中，PBS的浓度是0. 5-2. 0X。
[0006] -些实施方式中，抗体是IgG抗体。一些实施方式中，抗体是四聚体IgG抗体。
[0007] -些实施方式中，纳米粒子是聚合物点（p-点）。一些实施方式中，p-点直径为 5-100nm，并且是胶体半导体聚合物。一些实施方式中，p-点有焚光。
[0008] 一些实施方式中，表面活性剂是Pluronic F-68。一些实施方式中，表面活性剂在 混合物中的浓度是〇. 02% -1. 0%。
[0009] -些实施方式中，混合物的离子强度是75-300mM。
[0010] -些实施方式中，混合物还包含游离纳米粒子，所述介质将游离纳米粒子与偶联 物分离。
[0011] 另一实施方式中，所述方法包括：提供抗体-纳米粒子偶联物、游离抗体、聚烷二 醇表面活性剂和缓冲液的混合物，所述混合物的离子强度至少50mM ;所述混合物与纳米膜 过滤器接触从而将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离；由所述过滤器中收集富集了所 述抗体-纳米粒子偶联物的级份，由此将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化。
[0012] -些实施方式中，缓冲液包含磷酸盐。一些实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲液 (PBS)。一些实施方式中，PBS的浓度是0. 5-2. 0X。
[0013] -些实施方式中，抗体是IgG抗体。一些实施方式中，抗体是四聚体IgG抗体。
[0014] 一些实施方式中，所述纳米粒子是聚合物点（p-点）。一些实施方式中，所述p-点 直径为5-100nm，并且是胶体半导体聚合物。一些实施方式中，p-点有荧光。
[0015] -些实施方式中，表面活性剂是Pluronic F-68。一些实施方式中，表面活性剂在 混合物中的浓度是0. 02% -1. Ο%。
[0016] -些实施方式中，混合物的离子强度是75-300mM。
[0017] -些实施方式中，混合物还包含游离纳米粒子，所述介质将游离纳米粒子与偶联 物分离。 定义
[0018] "抗体"指免疫球蛋白或其片段形式。抗体一词包括但不限于来自人或其他哺乳 动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM各类多克隆抗体或单克隆抗体，包括天然形式的和 基因改造的抗体，例如人源化抗体，人抗体，单链抗体，嵌合抗体，合成抗体，重组抗体，杂合 抗体，突变抗体，接枝抗体，以及体外产生的抗体。"抗体"还可包括复合物形式，这包括但不 限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。"抗体"还可包括抗体片段，例如Fab、F(ab'）2、Fv、 scFv、Fd、dAb、Fc，以及其他组成，不论它们是否保留有抗原结合功能。
【附图说明】
[0019] 图1是463nm吸光度对级份数曲线的比较。所展示的实验是在30cm的Superose 6柱上纯化低离子强度20mM的HEPES-K0H缓冲液中的纳米粒子-抗体偶联样品。
[0020] 图2是463nm吸光度对级份数曲线的比较。所展示的实验是在30cm的Superose 6柱上纯化含0. 1 % PluronicF-68的IX PBS中的纳米粒子-抗体偶联样品。 发明详述
[0021] 抗体-纳米粒子偶联物难以与没有偶联的游离抗体分离并纯化是因为偶联物与 游离抗体的大小和密度近乎相同，还因为纳米粒子容易聚结和沉淀。发明人出乎意料地发 现，一些条件的组合能够实现抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体的分离。即，本发明发明人 发现，含表面活性剂的高离子强度缓冲液可用于保持偶联物的溶解，并在基于多糖的大小 排阻介质上产生偶联物与游离抗体的充分分离，从而能纯化偶联物。
[0022] 据信，该纯化方法适用于多种抗体-纳米粒子偶联物。例如，一些实施方式中，抗 体是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。一些实施方式中，抗体是抗原结合性抗体片段，例如 Fab、？(&13'）2或？~或是包含这些片段的融合蛋白。一些实施方式中，抗体是单链抗体如 scFv，一种或多种抗体的重链可变区（VH)与轻链可变区（VL)的融合体。抗体可以是重组抗 体或天然抗体。抗体可可以是人、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、骆驼或其他产抗体物种的抗体。
[0023] 纳米粒子是纳米级的离子，例如约lnm至约1000。一些实施方式中，粒子大小为 l-300nm、5-80nm或8-60nm。许多纳米粒子大致为球形，因此尺寸以球形的半径或直径表 示。也可用流体动力学半径或直径来定义纳米粒子的尺寸。
[0024] -些实施方式中，纳米粒子是荧光半导体聚合物点。此类p-点的例子可 见于，例如 Wu，C 等，Chem.Mater. ,21:3816-3822(2009) ;Rahim，N.A.A.等，Adv. Mater. 21:3492-3496 (2009)，Rong 等，ACS Nano 7 (1):376-84 (2013);专利公开 US2013/0266957、W02012/054525 和 2012/0282632。层析 p-点可通过将聚合物塌缩 (collapsing)成稳定的亚微米粒子来制备。本发明的纳米粒子可用本领域已知的各种聚合 物塌缩方法来获得，包括但不限于依赖于沉淀的方法，依赖于形成乳液的方法（如细乳液 或微乳液）以及依赖于凝结的方法。
[0025] 可根据需要将纳米粒子官能化以便纳米粒子连接抗体。纳米粒子的官能化可参 见例如美国专利公开US2012/0282632。例如，可将纳米粒子官能化为具有一个或多个羧酸 基团，于是可用这些基团通过一个或多个街头连接抗体。偶联物的组分（如抗体和纳米粒 子）可共价或非共价相连。非共价连接的一个例子是生物素-链霉亲和素亲和力，此时，偶 联物成员之一生物素化，另一成员则连接链霉亲和素。连接的其他选择例如但不限于：纳米 粒子与抗体的胺直接偶联；用马来酰亚胺修饰纳米粒子然后连接具有外露巯基（例如抗体 经巯基乙胺或2-亚氨基硫烷（Traut试剂）处理而产生的外露巯基）的抗体；用肼修饰纳 米粒子并连接具有氧化多糖（醛）的抗体；或采用点击化学（例如，用变形炔烃（strained alkyne)修饰纳米粒子并连接叠氮化物修饰的抗体）。
[0026] 各种偶联方法都可用于将抗体与纳米粒子偶联。一般说来，为产生理想得率的偶 联物，偶联反应中抗体是过量的。由此会在偶联反应后产生大量游离（没有偶联的）抗体。 一些实施方式中，反应混合物中还有一定量的没有偶联的游离纳米粒子。在此所述的方法 能够用于将偶联物与偶联反应的没有偶联的游离组分分离并纯化。一些实施方式中，采用 了与残余反应性基团反应从而阻断反应的物质。例如，马来酰亚胺官能化的纳米粒子与巯 基化或经还原的抗体之间的偶联可用烷基化剂（包括但不限于N-乙基马来酰亚胺）来终 止或淬灭。附加了 NHS的纳米粒子与蛋白质之间的反应可用胺（包括但不限于乙醇胺）来 终止或淬灭。
[0027] 偶联后，所得偶联混合物（纳米粒子/抗体偶联物和未反应的游离抗体，可能还 有游离纳米粒子）被调至至少50mM(例如50-500mM、50-300mM、100-300mM等）的离子强 度。例如，混合物的离子强度可用高离子强度缓冲液（如含有高浓度粒子的缓冲液）来调 节，由此保持上述离子强度。一些实施方式中，所述缓冲液包含至少50或100mM Na+或K +。 一些实施方式中，所述缓冲液包含磷酸盐（P〇43)。缓冲液例子之一是磷酸盐缓冲液（PBS) (IX PBS= 10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7. 8)。一些实施方式中，混合物中包含0. 5-3X， 如 0· 5-2. 0X、如 IX 的 PBS。
[0028] 离子强度按下式计算：
其中，Cl是离子i的摩尔浓度（1，!11〇1/1)，21是离子的电荷数，对溶液中所有粒子求和。
[0029] 混合物中还包括足量的表面活性剂，用于防止偶联物从混合物中聚结和沉淀，尤 其加入高离子强度缓冲液后，否则会发生偶联物聚结和沉淀。一些实施方式中，表面活性剂 是非离子聚二醇表面活性剂。一些实施方式中，表面活性剂是含聚氧丙烯