一种还原响应型药物偶联物纳米粒的制备及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药物偶联物作为载体的纳米粒的制备方法，及其在抗肿瘤方面的应用，属于药物制剂领域。
【背景技术】
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[0002]恶性肿瘤是人类生命健康的重大威胁，是致死率最高的疾病。在肿瘤的临床治疗中，化学疗法仍是主要手段之一。但是，许多化疗药物存在着选择性低、易被网状内皮系统清除、体内代谢快、毒副作用大等问题，从而限制了临床应用。
[0003]蒽环类抗生素是近30年来研宄较多发展较快的一类抗肿瘤药物，阿霉素是其中最常用、最重要的抗生素之一。阿霉素是从streptomyces peucerius var.caesius的发酵液中提取的一种糖苷类抗生素，其活性强，抗菌谱广，在肿瘤治疗中占有重要地位。阿霉素的抗肿瘤作用机制主要包括通过嵌入DNA双链中，形成稳定的复合物，影响DNA的功能，阻止DNA复制和RNA转录；影响topo II的功能，通过与topo I1-DNA复合物结合，抑制DNA的重新连接，从而诱导细胞凋亡。
[0004]虽然阿霉素有较强的抗肿瘤活性，但是其非特异性作用引起的不良反应如严重的心脏毒性限制了它在临床的广泛应用，脂质体由于具有被动靶向作用可以在一定程度上解决选择性低的问题，从而降低不良反应，提高疗效。但是这种策略仍存在一定的缺陷:脂质体对阿霉素的载药量较低(小于10%)，需要增加用量才能达到药效，但是增加用量的同时又会增加毒副作用，因此对于既有靶向性，载药量又高的递送系统的需求尤为迫切。
[0005]药物-穿膜肽偶联物作为前药已成为近年来的研宄热点。穿膜肽是长度小于20个氨基酸的多肽序列，具有穿透细胞膜的能力，穿膜肽跨膜机制可能有静电作用、氢键作用或疏水作用。药物-穿膜肽偶联物将药物的抗肿瘤作用与穿膜肽的穿膜作用相结合，提高肿瘤细胞对药物的摄取，增加药效，但是由于穿膜肽不具有特异性，对肿瘤细胞和正常细胞均有穿膜作用，因此偶联物在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有杀伤作用。但若将其制备成纳米粒，则会因增强的渗透和滞留(EPR)效应对肿瘤组织起到被动靶向作用，特异性的富集到肿瘤部位，发挥其穿膜作用和细胞毒作用。此外，这种给药系统还有一个最大的优势是，由于药物作为载体的一部分，可以增加载药量，降低毒副作用，增强药效。最近还有研宄将药物偶联物作为载体制备纳米粒，这在保持被动靶向作用的同时，更大大增加了载药量，提高肿瘤部位的药物浓度，从而增加摄取，提高药效，此外，药物偶联物还避免了由于合成载体材料在体内降解产生毒性的可能。
[0006]由于载体是药物偶联物或药物多肽偶联物，因此当纳米粒到达肿瘤细胞后，需要将载体中的药物释放才能发挥作用，这就对药物与药物或多肽之间的连接键提出了要求:在血液循环中能够保持稳定，但在肿瘤细胞内部能够断裂，释放药物。研宄发现，动物细胞内外存在氧化还原电位:细胞内的谷胱甘肽(GSH)浓度(2?1mmol.Γ1)是细胞外浓度(2?ΙΟμπιοΙ.L-1)的200倍以上。胞内体中也存在还原环境，主要是由IFN-γ诱导溶酶体巯基还原酶(GILT)和还原剂(如半胱氨酸)共同调节；溶酶体中含有低价Fe2+和高浓度的硫醇(如半胱氨酸)，使溶酶体中也具有还原环境。另外，肿瘤组织细胞比正常组织细胞缺氧，更具有还原性环境。利用这一点，我们选择具有还原敏感性的二硫键将药物与药物或多肽连接制得药物-二硫键-药物或多肽偶联物，并制备成纳米粒。由于细胞外及血液循环中的环境不足以使二硫键断裂，因此载体在细胞外及血液循环中能保持稳定，而细胞内的还原环境可迅速将其降解为巯基，致使纳米粒到达靶细胞后，二硫键发生断裂，释放出游离药物，发挥药效。
[0007]基于以上背景，用对还原环境敏感的二硫键将抗肿瘤药物与抗肿瘤药物或细胞穿膜肽偶联作为载体材料，制备成纳米粒，既保留了纳米递送系统的被动靶向优势，又增加了载药量，同时还发挥了二硫键在肿瘤部位特异性降解的特点，可以降低毒副作用，提高疗效。
【发明内容】
[0008]本发明的目的之一是提供一种抗肿瘤药物与药物或多肽偶联形成的还原响应型偶联物纳米粒，实现提高载药量、肿瘤靶向、降低毒性的作用。
[0009]本发明所述的药物偶联物，由药物与药物或药物与多肽之间通过含有二硫键的连接键偶联得到，该药物偶联物的通式如下:
[0010]药物-连接键-药物或多肽，
[0011]其中，所述药物为含羟基或氨基结构基团的抗肿瘤药物。
[0012]其中，所述连接键为含二硫键的小分子连接臂。
[0013]其中，所述多肽，为细胞穿膜肽，且序列中含半胱氨酸，平均分子量为800?5000道尔顿。
[0014]本发明的药物偶联物，其中所述的抗肿瘤药物结构中含有羟基或氨基。
[0015]本发明的药物偶联物，其中所述的抗肿瘤药物选自:紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素。
[0016]本发明的药物偶联物，其中所述小分子连接臂中含有二硫键。
[0017]本发明的药物偶联物，其中所述的多肽为细胞穿膜肽，且序列中含有半胱氨酸。
[0018]本发明的药物偶联物，优选的为纳米粒形式，制备过程中将其制备成粒径在80?200nm的纳米粒。
[0019]优选的，本发明的所述的药物偶联物选自:阿霉素-连接键-阿霉素、阿霉素-连接键-疏水肽、紫杉醇-连接键-紫杉醇、紫杉醇-连接键-疏水肽、多烯紫杉醇-连接键-多烯紫杉醇、多烯紫杉醇-连接键-疏水肽。
[0020]最优选的，本发明所述的偶联物选自:DOX-SS-DOX、PFV-SS-DOX。
[0021]本发明的目的之二是提供上述药物偶联物的制备方法。
[0022]本发明所述药物偶联物的制备方法，包括
[0023](I)药物-连接键-药物结构为代表的偶联物，以下简称药物-药物偶联物；
[0024](2)药物-连接键-多肽结构为代表的偶联物，以下简称药物-多肽偶联物。
[0025]药物-药物偶联物的制备方法，包括以下步骤:
[0026]药物与交联剂3，3’ - 二硫代二丙酸-二(N-羟基丁二酰亚胺酯)反应，经乙醚沉淀处理得到药物-药物偶联物。
[0027]优化的，药物-药物偶联物的制备方法，包括以下步骤:
[0028]在有机胺催化剂的存在下，在二甲基甲酰胺中，氮气保护下，将药物与含二硫键的交联剂3，3’-二硫代二丙酸-二(N-羟基丁二酰亚胺酯)按1-4:1的摩尔比进行酯化或酰化反应，经乙醚沉淀处理后得到药物-药物偶联物。
[0029]其中，药物与含二硫键的交联剂3，3’ - 二硫代二丙酸-二(N-羟基丁二酰亚胺酯)按2.1:1的摩尔比进行醋化或酰化反应。
[0030]其中，所述药物选自:紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素等抗肿瘤药物。
[0031]进一步优选的，阿霉素-连接键-阿霉素的合成，包括以下步骤:
[0032]将DOX.HCl (60.9mg,0.105mmol)溶于 3mL DMF 中，将溶于 0.5mL DMF 中的DSP (20.2mg，0.05mmol)逐滴加入到DOX中，随后加入催化剂TEA (14.6 μ L)，室温避光反应30min后，冰浴过夜，第二天将其转移至冰乙醚中待沉淀析出，抽滤得产物为橙红色固体粉末。
[0033]药物-多肽偶联物的制备方法，包括以下步骤:
[0034](I) 二硫二吡啶和巯基丙酸在乙醇/醋酸溶液中反应，过柱分离处理后得到Py-SS-COOH0
[0035](2)采用活化剂HBTU将Py-SS-COOH活化，活化后的羧基与药物反应，经过柱分离得到Py-SS-药物。