抗cdh3人源化抗体、其药剂偶联物以及它们的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗CDH3人源化抗体、其免疫复合物、特别是其药剂偶联物。本发明还 涉及抗CDH3人源化抗体及其免疫复合物的使用方法。
【背景技术】
[0002] 癌是占据死亡原因上位的重要的疾病，但其治疗需求尚未得到满足。近年来，为 了解决化学疗法对正常细胞也造成损伤的问题，正在积极地研究利用分子靶向药物来治疗 癌，该分子靶向药物以对癌细胞特异性表达的特定的分子作为靶来设计药剂进行治疗。
[0003] 作为该靶之一，鉴定了作为细胞膜表面抗原的⑶H3 (P-钙粘着蛋白）。⑶H3是作 为?丐依赖性地参与同嗜性的细胞粘附的分子被发现的膜蛋白质（Yoshida and Takeichi， Cell 28 :217-224,1982 (非专利文献1))。具有由相互同源性高的约110个氨基酸残基构 成的钙粘着蛋白重复序列的蛋白质被称为钙粘着蛋白超家族，CDH3属于其主要的成员。
[0004] 有报道在某种癌细胞中⑶H3的表达上升例，对于与正常组织相比在癌组织中 CDH3表达高的癌细胞，研究着使用抗体来治疗癌（W02002/097395号公报（专利文献1)、 W02007/102525号公报（专利文献2)、日本特表2011-526583 (专利文献4)、W02011/080796 A1 (专利文献5))。
[0005] 实际上，大量的这样将特定的抗原作为靶的分子靶向药物已经作为抗体医药而上 市，其大多以抗体依赖性细胞毒性（ADCC，Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) 为主要的作用机理。但是，其药效未必能够令人满意，以更有效的抗癌作用为目标的技术开 发也在同时进行着。
[0006] 作为增强抗体的抗癌作用的有效手段之一，可以列举抗体与具有强毒性的物质 (毒素）的连结。如果单独地向患者给予毒素，对正常组织也会造成障碍，无法成为有效的 治疗手段。但是，通过将与癌细胞特异性抗原结合的抗体与毒素连接，则能够具有仅杀伤 癌细胞而不对正常的组织造成不良影响的能力。这样的药剂被称为抗体药物偶联物（ADC， Antibody Drug Conjugate)。即，毒素在与抗体结合的状态下不表现任何毒性。但是，某种 抗体一旦与表达作为靶的抗原的细胞结合，就会被摄入该细胞内而被溶酶体分解。因此，在 结合有毒素的这种抗体被摄入细胞内后，在细胞内被分解，因而释放毒素，毒性仅在特定的 细胞内部表现，利用其效果杀伤细胞。
[0007] ADC中所使用的药剂成分中包含白喉毒素等细菌性蛋白毒素；篦麻毒素等植物蛋 白毒素；奥瑞他汀、美登素类、刺孢霉素等低分子毒素及其衍生物。
[0008] 在ADC中，与抗体结合的药剂在血液中循环，在累积到作为靶向的肿瘤中后显示 药效。在肿瘤部位以外的药剂释放（脱离抗体）由于具有产生副作用的危险性，因而未必 能够令人满意。即，优选与抗体结合的药剂在被摄入细胞内后从抗体脱离的设计。
[0009] 近年来，Genentech公司从这样的观点考虑，开发了将毒素经由非裂解型连接 物（SMCC)与曲妥单抗结合而成的药剂（T-DM1)，并进行临床试验，显示非常高的临床效果 (N.Engl.J.Med.2012 Nov 8;367(19):1783-91(非专利文献 2))。另外，也开发了经由裂 解性连接物与药剂成分连结而成的抗体药剂偶联物。例如，ImmunoGen公司进行了以表达 NCAM抗原的癌为对象，经由裂解性连接物（SPP)使HuN901抗体与药剂结合而成的抗体药剂 偶联物的开发。
[0010] 另外，还开发了使放射性物质与抗体结合来用于治疗的放射性免疫疗法药，作为 使放射性物质90Y(钇）或lllln(铟）与嵌合化抗CD20抗体结合的药剂，上市了泽娃灵 (Zevalin)(通用名：替伊莫单抗）。
[0011] 另外，在将该抗体作为药剂偶联物等使用时，特别是向患者给药期间涉及长期的 情况下，希望可能会产生针对异种免疫球蛋白的抗体（例如人抗小鼠抗体，HAMA)等的给药 抗体本身的免疫原性为最小限度或完全没有，利用这样的抗体制作药剂偶联物是有利的。
[0012] 作为得到这样的抗体的方法，例如将由小鼠等异种生物获得的抗体的互补决定区 (CDR，Complementarity determining region)与来自人的抗体的框架区（FR，Framework Region)彼此连接而制成的人源化抗体技术是本领域技术人员常用的技术（日本特开 2005-000169 (专利文献12)和专利第4836147号（专利文献13))。但是，在与CDR组合的 FR不合适的情况下，也屡屡出现亲和性消失、稳定性下降等不希望看到的结果。为了应对这 种状况，尝试了将来自在该设计中作为移植基础的抗体的氨基酸残基与框架区的相应位置 的氨基酸残基取代的称为reshape的方法，如果能够进行适当的取代，也能够改善由于人 源化而引起的亲和性降低（Nature，332, p323 (1988)(非专利文献3)和美国专利6180370 号（专利文献3))。
[0013] 这样，该人源化抗体的来自小鼠等异种生物的CDR序列与来自人的FR序列优选分 别与作为其基础的氨基酸序列100%相同，但通常在人源化、嵌合化的过程中尝试以维持与 抗原结合为目的的氨基酸残基的取代。在维持与CDH3的结合性、不使其免疫原性极度升高 的范围内，还优选以维持亲和性为目的实施基因工程上的改变，相对于通过人源化而组合 的由CDR和FR构成的基础序列的序列同源性的程度至少为90 %、91 %、92 %、93 %、94 %、 95 %、96 %、97 %、98 %、99 %以上、或者100 %相同。这样的序列的一部分发生了改变的抗体 与CDH3的特定的表位特异性地结合，在这种意义上，可以认为是原样地维持了原来的源自 杂交瘤的CDR的性质的抗体。
[0014] 通过使用这样获得的人源化抗体，能够作为将其免疫原性限定在最小限度内、并 且具有像ADC那样的强效的细胞毒性的免疫复合物而用于疾病的治疗，这对于接受了该药 剂给药的患者而言是非常有利的。另外，在该领域中，对于用于治疗肺癌、大肠癌、乳腺癌等 各种癌的更进一步的药剂存在需求。为了该目的，特别有用的药剂包括毒性显著低但具有 有益的治疗有效性的抗CDH3人源化抗体药剂偶联物。
[0015] 现有技术文献
[0016] 专利文献
[0017] 专利文献1 :W02002/097395号公报
[0018] 专利文献2 :W02007/102525号公报
[0019] 专利文献3 :美国专利6180370号
[0020] 专利文献4 :日本特表2011-526583
[0021] 专利文献 5 :TO2011/080796 A1
[0022] 专利文献 6 :W02013/150623
[0023] 专利文献7 :EP239400号公报
[0024]专利文献8 :国际公开W096/02576号公报
[0025]专利文献9 :日本特表2008-516896号公报
[0026]专利文献10 :美国专利第5, 208, 020号
[0027]专利文献11 :美国专利第6, 333, 410B1号
[0028]专利文献12 :日本特开2005-000169
[0029]专利文献13 :日本专利第4836147号
[0030] 非专利文献
[0031]非专利文献1 :Yoshida and Takeichi，Cell 28 :217-224,1982
[0032]非专利文献2 :N. Engl. J. Med. 2012 Nov 8 ;367 (19) : 1783-91
[0033]非专利文献3 :Nature ;332, p323 (l988)
[0034]非专利文献4 :Somat.Cell.Mol.Genet. ;12，p5555(1986)
[0035]非专利文献5 :Nature ;276, p269 (I978)
[0036]非专利文献6 :Cancer Res. ;68 (22)，p9280 (2008)
[0037]非专利文献7 :Nature Biotechnology ;26 (8)，p925 (2008)
[0038]非专利文献8 :Bio Conjugate Chemistry ; 19, pl673 (2008)
[0039]非专利文献9 :Cancer Res. ;68(15)，p6300(2008)
[0040]非专利文献10 〖Analytical Biochemisty ; 173, p93 (1988)
[0041]非专利文献11 :"Phage Display-A Laboratory Manual_"PR0T0C0L 9. 5
[0042]非专利文献12 :J. Med. Chem. ;49, p4392 (2006)
[0043]非专利文献13 :Cancer Res. ;52, pl27(1992)
[0044]非专利文献14 :Journal of Immunology ; 169, pi 119 (2002)
[0045]非专利文南犬15 :Sequences of proteins of immunological interest，5th Ed.， Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)
[0046]非专利文献16 :J.MoI Biol. ;196, p901(1987)
[0047]非专利文献17 :J. Immunol. ; 151，p2296 (1993)
[0048]非专利文献18 :J.Mol.Biol. ;196 :p901(1987))
[0049]非专利文献19 〖Biotechnology ;9, p266 (1991)
[0050]非专利文献20 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA ;89, p4285 (1992)
[0051]非专利文献21 :Methods.Mol.Biol. ;525，p445(2009)
【发明内容】
[0052] 发明要解决的技术问题
[0053] 本发明要解决的技术问题在于制作免疫原性更少的抗CDH3人源化抗体，使用该 抗体提供一种更有效地杀伤表达CDH3的癌细胞的抗CDH3人源化抗体药剂偶联物。
[0054] 用于解决技术问题的手段
[0055] 为了解决上述技术问题，本发明的发明人进行了深入研究，结果发现通过将由特 异性识别CDH3的抗体所规定的CDR序列与各种来自人的FR序列组合，并且为了改善亲和 性而导入适当的氨基酸突变，由此能够制作免疫原性少的抗CDH3人源化抗体，使用该抗体 成功地制作出更有效地杀伤表达CDH3的癌细胞的抗CDH3人源化抗体药剂偶联物，从而完 成了本发明。
[0056] 根据本发明，提供一种抗⑶H3人源化抗体，其包含具有保藏号NITE BP-1536的细 胞所产生的抗体（以下将该小鼠抗体称为抗体编号：PPAT-076-44M)的来自重链可变区的 互补决定区序列（以下称为CDR-H1、H2、H3)和来自轻链可变区的互补决定区序列（以下称 为⑶R-L1、L2、L3)，并且框架区序列中，重链可变区为重链人亚群（subgroup) III共有框架 序列，轻链可变区含有轻链人k亚群I共有框架序列。
[0057] 根据本发明，还提供一种抗⑶H3人源化抗体，⑶R-H1、H2、H3分别为序列号56、序 列号57和序列号58,⑶R-L1、L2、L3分别包含序列号59、序列号60和序列号61，并且框架 区序列中，重链可变区为重链人亚群III共有框架序列，轻链可变区含有轻链人k亚群I 共有框架序列。
[0058] 根据本发明，还提供一种抗⑶H3人源化抗体，其包含具有保藏号NITE BP-1536的 细胞所产生的抗体的来自重链可变区的互补决定区序列（CDR-H1、H2、H3)和来自轻链可变 区的互补决定区序列（CDR-L1、L2、L3)，并且框架区序列含有以最佳比对为基础所选择的来 自人的生殖系列的序列。
[0059] 根据本发明，还提供一种抗⑶H3人源化抗体，⑶R_H1、H2、H3分别为序列号56、序 列号57和序列号58,⑶R-L1、L2、L3分别包含序列号59、序列号60和序列号61，并且框架 区序列含有以最佳比对为基础所选择的来自人的生殖系列的序列。
[0060] 根据本发明，还提供一种抗⑶H3人源化抗体，其与上述抗⑶H3人源化抗体的序列 同源性至少在90%以上，并且能够识别⑶H3。
[0061] 根据本发明，还提供一种抗⑶H3人源化抗体，上述抗体的框架区部分中的1个至 多个氨基酸取代为其他的氨基酸，并且能够识别CDH3。
[0062] 根据本发明，还提供一种抗CDH3人源化抗体，上述抗体的互补决定区序列中处于 与框架区的边界的1个至多个氨基酸取代为其他的氨基酸，并且能够识别CDH3。
[0063] 优选被取代的氨基酸是轻链可变区中的按Kabat编号的55位的氨基酸。
[0064] 优选被取代的氨基酸是选自重链可变区中的按Kabat编号的49位、71位或78位 中的1个以上的氨基酸。
[0065] 优选轻链可变区中的按Kabat编号的55位的氨基酸取代为丙氨酸。
[0066] 优选重链可变区中的按Kabat编号的71位的氨基酸取代为赖氨酸。
[0067] 优选重链可变区中的按Kabat编号的78位的氨基酸取代为缬氨酸。
[0068] 优选重链可变区中的按Kabat编号的49位的氨基酸取代为丙氨酸。
[0069] 优选上述抗体具有选自重链可变区中的按Kabat编号的49位的氨基酸残基取代 为丙氨酸、71位的氨基酸残基取代为赖氨酸、78位的氨基酸残基取代为缬氨酸、和轻链可 变区中的按Kabat编号的55位的氨基酸残基取代为丙氨酸中的一种以上的取代。
[0070] 根据本发明，能够提供下列任一种抗体。
[0071] (1)重链可变区具有序列号48所记载的氨基酸序列、轻链可变区具有序列号49所 记载的氨基酸序列的抗CDH3人源化抗体（抗体编号：PPAT-076-44Ha);
[0072](2)重链可变区具有序列号50所记载的氨基酸序列、轻链可变区具有序列号51所 记载的氨基酸序列的抗CDH3人源化抗体（抗体编号：PPAT-076-44Hb);
[0073] (3)重链可变区具有序列号52所记载的氨基酸序列、轻链可变区具有序列号53所 记载的氨基酸序列的抗CDH3人源化抗体（抗体编号：PPAT-076-44HC);
[0074] (4)重链可变区具有序列号54所记载的氨基酸序列、轻链可变区具有序列号55所 记载的氨基酸序列的抗CDH3人源化抗体（抗体编号：PPAT-076-44Hd)。
[0075] 优选本发明的抗体具有与⑶H3结合的能力。
[0076] 优选本发明的抗体为Fab、F(ab' )2或scFv。
[0077] 根据本发明，还提供一种具有与CDH3结合的能力的上述抗体的部分序列。
[0078]优选 CDH3为人 CDH3。
[0079] 优选⑶H3为序列号2的细胞外区域（相当于序列号2的1~654氨基酸）。
[0080] 根据本发明，还提供上述的抗CDH3人源化抗体、其片段或其部分序列与化疗剂或 放射性物质连结而成的免疫复合物。
[0081] 优选化疗剂为细胞毒性物质。
[0082] 优选细胞毒性物质为美登素或其衍生物、或者奥瑞他汀或其衍生物。
[0083] 优选细胞毒性物质为选自DM1、DM3或DM4中的美登素或其衍生物、或者选自MMAE 或MMAF中的奥瑞他汀或其衍生物。
[0084] 优选每1分子的抗CDH3人源化抗体、其片段或其部分序列结合有平均1~7个 DM1。该平均药剂结合个数不对抗体亲和性造成影响。
[0085] 优选抗CDH3人源化抗体、其片段或其部分序列与化疗剂经由连接物连结。
[0086] 优选抗CDH3人源化抗体、其片段或部分序列与化疗剂经由抗体的Fc区域的分子 内二硫键连结、或者以基因工程的方法改变抗体的Fc区域而连结。
[0087] 优选连接物为2价反应性交联试剂。
[0088] 优选连接物选自N-琥珀酰亚胺基4 一（马来酰亚胺甲基）环己烷甲酸酯（SMCC)、 磺基琥珀酰亚胺基一 4 一（N-马来酰亚胺甲基）一环己烷一 1 一甲酸酯（Sulfo-SMCC)、 N-琥珀酰亚胺基一 4 一（N-马来酰亚胺甲基）一环己烷一 1 一羧基一（6-酰胺己酸 酯）（LC-SMCC)、k 一马来酰亚胺月桂酸N-琥珀酰亚胺酯（KMUA)、y -马来酰亚胺基丁 酸N -琥珀酰亚胺酯（GMBS)、e -马来酰亚胺己酸N -羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS)、间马来 酰亚胺苯甲酰基一 N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS)、N -（a -马来酰亚胺乙酰氧基）一琥珀 酰亚胺酯（AMAS)、琥珀酰亚胺基一 6 --马来酰亚胺丙酰胺）己酸酯（SMPH)、N -琥 珀酰亚胺基4 一（对马来酰亚胺苯基）一 丁酸酯（SMPB)、N -（对马来酰亚胺苯基）异氰 酸酯（PMPI)、N -琥珀酰亚胺基4(2 -吡啶基硫代）戊酸酯（SPP)、N -琥珀酰亚胺基（4 一 碘一乙酰基）氨基安息香酸酯（SIAB)、6 -马来酰亚胺基