专利名称：抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法
技术领域：
本发明涉及抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法,更具体地说是 一种磁性纳米颗粒与抗体偶联和纯化的方法，获得的偶联抗体适用于禽流感病毒等病原 微生物的富集，从而能从水中或者其它环境样品中快速检测出禽流感病毒，属于检验检 疫领域。
背景技术：
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒引起的一种急性传染病。截止到 2008年4月(2003年始)，世界卫生组织共报告高致病性人禽流感确诊病例378例，分 别来自14个国家，死亡率高达63%。由于禽流感的高死亡率以及人类对禽流感病毒普 遍缺乏免疫力，研究禽流感病毒的任务十分艰巨。目前对于禽流感病毒的检测已经有许 多方法，例如病毒分离、RT-PCR、 ELISA、荧光RT-PCR等，但这些方法无疑都存在检 出率的问题，如果样品中病毒含量没有达到该检测方法的检测下限，就检测不出来，因 此本领域迫切需要一种富集禽流感病毒的方法，同时具有灵敏快速和设备简单、成本低 廉的特点，以便更好更快的诊断、治疗和预防禽流感。
纳米技术是目前国际上基础研究和高新技术发展中最具有前瞻性、带动性的重点领 域之一。纳米材料因具有独特的物理化学性质，其巨大的比表面积，特异的反应活性和 纳米效应，使其大大异于传统材料，在发展快速、高灵敏度、高准确性检测技术和传感 手段方面具有极大的潜力。我国在纳米生物材料的设计、研发、表征和潜在应用领域成
果层出不穷。研究并利用新型纳米生物材料的特性，结合现有的检测技术，实现口岸快 速、高特异、高敏感检验目的，开发具有我国自主知识产权的病原富集、纳米与生物活 性物质标记及检测技术，对占领纳米材料应用性研究领域的制高点具有重要的战略意 义。
磁性纳米颗粒是由Senyei A E在1978年首先研制出来的一种新型的纳米功能材 料。它的内部是一个磁核，因而在外部磁场的作用下，微球可以定向移动；外部是一层 高分子层，表面分布着许多活性基团，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生 偶联，进而在磁场的作用下实现分离。磁性纳米颗粒从诞生开始，它就受到了科研工作者的关注，并且在生化分析领域得到成功的应用。利用磁性纳米颗粒分离蛋白质、酶、 抗体、细胞，所需设备简单、操作简便同时分离速度快，效率高，并且能保持样品的生 物活性，因此近年来在生物医药等领域，磁性纳米颗粒已被广泛应用于免疫分析、核酸 分析、细胞分离、酶的固定等多个领域。
将磁性纳米颗粒包被上特异性抗体、受体、单链DNA，用于分离复杂样品中的耙体， 取得巨大成功。与传统的分离方法相比，把磁性纳米颗粒用于复杂组分的生化样品的分 离，能够实现分离和富集同时进行，大大提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检 测的灵敏度大大提高。目前，已经有相关的文章报道了将磁性纳米颗粒应用于检测环境 样品中的痕量微生物或者某些活性化学物质，取得了很好的效果。但在目前，纳米材料 与蛋白质偶联是一个世界性难题。主要难点包括纳米材料水溶性的问题；纳米材料表面 基团的活化；抗体分子和纳米材料的共价结合；偶联条件必须能保证纳米材料和抗体活 性不能受损；之外还要求偶联后能有效去除未偶联的抗体分子。
技术内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中 禽流感病毒的方法,通过反应条件优化，实现特异性抗体与磁性纳米颗粒的偶联，并对产 物纯化方法进行研究，从而建立磁性纳米颗粒与抗体偶联与纯化的方法。
本发明的要解决的另一个技术问题是将纯化的磁性纳米颗粒偶联抗体用于禽流感 病毒等病原微生物的富集，并采用快速检测方法对富集效果进行验证，建立一种新的特 异性的禽流感病毒快速分离、富集的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案
抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，包括如下步骤
(1) 将磁性纳米颗粒、禽流感病毒多克隆抗体和偶联剂混合，室温反应2小时，得 到含有偶联有禽流感病毒多克隆抗体的磁性纳米颗粒的溶液；
(2) 纯化偶联产物，去除未反应的抗体；
(3) 偶联产物和待测溶液反应后，用磁铁富集；
(4) 富集产物的检测。
所述步骤(1)将磁性纳米颗粒、禽流感病毒多克隆抗体和偶联剂混合，得到含有 偶联有禽流感病毒多克隆抗体的磁性纳米颗粒的溶液，是指将磁性纳米颗粒、偶联剂和
禽流感病毒多克隆抗体按l-2pmol: l-6mg: 0.625-5mg的比例混合。所述"磁性纳米颗粒"是指超顺磁性的磁性纳米颗粒。
本发明所指的"偶联剂"是指可以使抗体和磁性纳米颗粒进行共价结合的试剂。由于 抗体的结构特征和磁性纳米颗粒被修饰羧基的原因，选择的偶联剂应符合下列条件的一 种能活化羧基，使活化的羧基与抗体上的氨基反应，形成肽键。本发明使用的偶联剂
为乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (Siilfo-NHS)或二者混合。优选为单独使用乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐 酸盐(EDC)。
所述的"禽流感病毒多克隆抗体"是指通过禽流感病毒抗原于哺乳动物皮下注射，进 行多次免疫后，收集被免疫动物的血清，并经纯化得到禽流感病毒多克隆抗体。
所述歩骤(2)纯化偶联产物的方法一为分子筛法纯化，分子筛为sephadexG100。 所述步骤(2)纯化偶联产物的方法二为离心法纯化，离心条件为4°C， 3000-12000r/min，离心10-20 min，离心后弃掉上清，所得沉淀即为偶联抗体的磁性纳 米颗粒。
所述歩骤(4)检测富集产物的方法为用禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒进行检
本发明通过对磁性纳米颗粒和抗体分子特性的研究，通过选择合适的偶联剂品种和 浓度，可以将水溶性的磁性纳米颗粒与特异性的抗体进行共价偶联，得到生物功能化的 磁性纳米颗粒，这种生物功能化磁性纳米颗粒与溶液中的病毒通过免疫特异性结合，再 通过磁铁富集所需要的病毒。本发明对各种偶联条件进行优化，建立了制备和纯化具有 免疫活性的抗体偶联磁性纳米颗粒的方法，为进一步开发相关检测试剂奠定了基础。
据此，本发明提供了一种新的富集禽流感病毒的方法，它分离速度快、效率高，并 且所需的设备简单、成本低廉。
本发明的优点是
(1) 本发明提供的方法不损失病毒活性；
(2) 本发明提供的方法速度快、效率高；
(3) 本发明提供的方法灵敏度高、特异性强。
(4) 本发明提供的方法快速、简便，而且设备简单、成本低廉。
图1用荧光RT-PCR法检测富集前、后的病毒含量检测结果。图2用荧光RT-PCR法检测富集前、后的病毒含量检测结果。
具体实施例方式
实施例1:磁性纳米颗粒和禽流感病毒多克隆抗体的偶联、纯化，禽流感病毒的富
集和检测 1、材料
pH8.0的硼酸缓冲液0.05 M硼砂30% (V/V)， 0.2 M硼酸70% (V/V)， pH值 为8。
磁性纳米颗粒(购自天津倍思乐公司产品)，EDC (乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亚胺盐酸盐)，Sulfo-NHS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，乙醇胺，1M甘氨酸，0.02 M NaH2P04， O.lMNaCl， 1%叠氮钠(质量百分比)，Sephadex G100 (购自BIO-RAD产 品)，DEAE Sepharose Fast Flow (购自Pharmacia公司)。
禽流感病毒抗原(购自哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室)。
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(购自北京市生物制品检定所)。
TRIZOL试剂(INVIOTROGEN)。
禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒(购自深圳匹基公司产品)。 禽流感病毒多克隆抗体(6.25mg/ml)，自制；其制备方法为用禽流感病毒抗原分4 次免疫新西兰大白兔，第1次免疫取2.0mL (250 pg/mL)禽流感病毒抗原与等体积 弗氏完全佐剂，充分研磨至完全乳化，兔颈背部皮下多点注射；间隔3周后进行第2次 免疫取2.0mL (150 pg/mL)禽流感病毒抗原与等体积弗氏不完全佐剂，充分研磨至 完全乳化，兔颈背部皮下多点注射；间隔3周后进行第3次免疫取2.0mL(150pg/mL) 布氏杆菌可溶性抗原，兔耳静脉注射。20天后，颈动脉放血收获抗血清。
取20ml上述血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH4) 2304饱和溶液10ml，使 成20% (NH4) 2S04溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。 4°C, 3000r/min离 心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。在上清液中再加(NH4) 2S04饱和溶液30ml， 使成50% (NH4) 2S04溶液，充分混合，静置30min。 4°C， 3000r/min离心20min，弃 上清。于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4) 2S04饱和溶液10ml，使成 33% (NH4) 2S04溶液，充分混合后，静置30min。 4°C， 3000r/min离心20min，弃上 清，以除去白蛋白。用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。4。C冰箱中透析除盐，在 常水中透析过夜，再在生理盐水中于4。C透析24h，中间换液5次。4°C， 3000r/min离心10min去沉淀，上清液即为粗提禽流感病毒多克隆抗体。 粗提禽流感病毒多克隆抗体的离子交换树脂纯化
1) 取体积分数为20%酒精浸泡的DEAE Sepharose Fast Flow填料20mL装填柱子(112 cmx20 cmMillipore,购自BIO-RAD公司)，先用200 mL纯水以1.5 mL/min洗柱，再 用100 mL的Buffer A( 10 mmol/LTris-HClpH 8.0)以1.5 mL/min平衡柱子。
2) 将初纯后所得的禽流感病毒多克隆抗体样品利用透析袋更换成Buffer A缓冲液， 以1.0 mL/min流速上样，同时开启紫外检测仪，开始记录。
3) 上样完毕后,首先用Buffer A洗脱,洗脱速度为1.0 mL/min ，并收集洗脱峰后；随 后用含有0.1 mol/LNaCl Buffer A溶液进行等梯度洗脱，收集洗脱峰1，标记为P1， PI 样品即为纯化的禽流感病毒多克隆抗体，于4"冰箱保存。
2.方法
(1) 磁性纳米颗粒和抗体的偶联浓度为0.01 M的磁性纳米颗粒混悬液取100 ^ 加硼酸缓冲液补至800 pl，加入EDC 2mg和Sulfo-NHS 4mg，室温反应15分钟。然后 加入10 ^乙醇胺淬灭EDC 。加100 ^禽流感病毒多克隆抗体(6.25 mg/ml)，室温反 应2小时。加100 ^ 1 M甘氨酸，封闭磁性纳米颗粒上的未反应的羧基。最后加入10 (^11%叠氮钠，放到2'C冰箱中保存。
(2) 分离未偶联的磁性纳米颗粒和抗体(用Sephadex G100分子筛分离)取10 g SephadexG100干粉，加入适量0.1 MNaCl， 100。C加热3小时，冷却至室温后，装入层 析柱中。调整好流速后，用200mlNaH2PO4洗脱。使用紫外检测器检测洗脱液的280 nm 吸收值。收集各个组分，最前面的组分应为所需磁性纳米颗粒和抗体的偶联产物。
(3) 偶联产物富集禽流感病毒
① 抗原抗体反应取n个(11=稀释的禽流感病毒抗原个数)1.5ml离心管分别加入 按比例稀释的禽流感病毒抗原各1000pl，再在每管中各加入10(Vl偶联有抗体的磁性纳 米颗粒混悬液，盖上盖子，室温下涡旋充分混合或振荡混合，37'C培养箱中湿盒孵育60 分钟；
② 磁铁富集将离心管从37'C培养箱中取出置于磁分离架上，室温静置45分钟。 小心地吸出上清液。从磁分离架上取出离心管，加入20(^1PBS (0.02M， pH7.2)，涡旋 混合，即得到富集后的样品。
(4) 富集产物的检测将上述富集后的样品以及上清液用TRIZOL试剂提取RNA, 用禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测，具体方法详见《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》GB/T 19438.2-2004。 3.结果
如图1所示，Ct值越低病毒含量越高，Ct值越高病毒含量越低。用偶联抗体的磁性 纳米颗粒富集后的病毒含量(上面的曲线A)明显比用未偶联抗体的磁性纳米颗粒富集 后的病毒含量(中间的曲线B)以及富集前(下面的曲线C)的病毒含量高。
实施例2:磁性纳米颗粒和禽流感病毒多克隆抗体的偶联、纯化，禽流感病毒的富 集和检测
1. 材料
pH8.0的硼酸缓冲液0.05 M硼砂30% (V/V)， 0.2 M硼酸70% (V/V)，溶解后 pH为8。
磁性纳米颗粒(购自天津倍思乐公司产品)，EDC (乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亚胺盐酸盐)，乙醇胺，1M甘氨酸，0.02MNaH2PO4， O.lMNaCl， 1%叠氮钠(质 量百分比)，DEAE Sepharose Fast Flow (购自Pharmacia公司)。
禽流感病毒多克隆抗体(6.25mg/ml)，同实施例1的制备方法。 禽流感病毒抗原(购自哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室)。 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(购自北京市生物制品检定所)。 TRIZOL试剂(INVIOTROGEN)。
禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒(购自深圳匹基公司产品)。
2. 方法
(1 )磁性纳米颗粒和抗体的偶联取浓度为0.01 M磁性纳米颗粒混悬液200 Ml和 800 禽流感病毒多克隆抗体(6.25 mg/ml)，加入EDC 2mg室温反应2小时。力n 100 pllM甘氨酸，封闭磁性纳米颗粒上的未反应的羧基。最后加入10pl 1%叠氮钠，放 到2T:冰箱中保存。
(2) 分离未偶联的磁性纳米颗粒和抗体将偶联反应所得产物离心，离心条件为 4。C， 3000-12000r/min，离心10-20 min，离心后轻轻弃掉上清，所得沉淀即为偶联抗体 的磁性纳米颗粒，然后将沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS， 0.02M， pH7.2)悬浮备用。
(3) 偶联产物富集禽流感病毒
①抗原抗体反应取n个(n-稀释的禽流感病毒抗原个数)1.5ml离心管分别加入 按比例稀释的禽流感病毒抗原各1000|^1，再在每管中各加入ioow偶联有抗体的磁性纳米颗粒混悬液，盖上盖子，室温下涡旋充分混合或振荡混合，37'C培养箱中湿盒孵育60 分钟；
②磁铁富集将离心管从37i:培养箱中取出置于磁分离架上，室温静置45分钟。 小心地吸出上清液。从磁分离架上取出离心管，加入200^1 PBS (0.02M， pH7.2)，涡旋 混合，即得到富集后的样品。
4)富集产物的检测将上述富集后的样品以及上清液用TRIZOL试剂提取RNA， 用禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测，具体方法详见《H5亚型禽流感病毒 荧光RT-PCR检测方法》GB/T 19438.2-2004。
3.结果
如图2所示，Ct值越低病毒含量越高，Ct值越高病毒含量越低。用偶联抗体的磁性 纳米颗粒富集后的病毒含量(上面的曲线A)明显比用未偶联抗体的磁性纳米颗粒富集 后的病毒含量(中间的曲线B)以及富集前(下面的曲线C)的病毒含量高。
权利要求
1. 抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，包括如下步骤(1)将磁性纳米颗粒、禽流感病毒多克隆抗体和偶联剂混合，室温反应2小时，得到含有偶联有禽流感病毒多克隆抗体的磁性纳米颗粒的溶液；(2)纯化偶联产物，去除未反应的抗体和磁性纳米颗粒；(3)偶联产物和待测溶液反应后，用磁铁富集；(4)富集产物的检测。
2. 根据权利要求1所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步骤(1)将磁性纳米颗粒、禽流感病毒多克隆抗体和偶联剂混合， 得到含有偶联有禽流感病毒多克隆抗体的磁性纳米颗粒的溶液，是指将磁性纳米颗粒、 偶联剂和禽流感病毒多克隆抗体按l-2pmol: l-6mg: 0.625-5mg的比例混合。
3. 根据权利要求1所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述磁性纳米颗粒为超顺磁性的磁性纳米颗粒。
4. 根据权利要求1所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述偶联剂为乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺或者上述二者任意混合。
5. 根据权利要求4所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述偶联剂为乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
6. 根据权利要求1所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步骤(2)纯化偶联产物的方法为分子筛法纯化，分子筛为sephadex G亂
7. 根据权利要求1所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步骤(2)纯化偶联产物的方法为离心法纯化，离心条件为4°C， 3000-12000r/min,离心10-20 min,离心后弃掉上清，所得沉淀即为偶联抗体的磁性纳 米颗粒。
8. 根据权利要求1所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述禽流感病毒多克隆抗体为禽流感病毒抗原于哺乳动物皮下注射，进行 免疫后，收集被免疫动物的血清并经纯化得到的禽流感病毒多克隆抗体。
9. 根据权利要求1所述的抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步骤(4)检测富集产物的方法为用禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测.
全文摘要
本发明公开了抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，属于检验检疫领域。抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，包括如下步骤(1)将磁性纳米颗粒、禽流感病毒多克隆抗体和偶联剂混合，室温反应2小时，得到含有偶联有禽流感病毒多克隆抗体的磁性纳米颗粒的溶液；(2)纯化偶联产物，去除未反应的抗体；(3)偶联产物和待测溶液反应后，用磁铁富集；(4)富集产物的检测。本发明的优点是本发明提供的方法不损失病毒活性；本发明提供的方法速度快、效率高；本发明提供的方法灵敏度高、特异性强。本发明提供的方法快速、简便，而且设备简单、成本低廉。
文档编号G01N33/577GK101435824SQ20081023967
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者于维正, 洁 任, 丹 吴, 张向东, 柏亚铎, 琳 汪, 王孔江, 赖平安, 亮 辛, 高志强 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局