一种rhHER2抗体与MMAE偶联物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗体-小分子化合物偶联物（ADC)，特别涉及一种rhHER2抗体与 MMAE偶联物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate，ADC)是将具有特异性识别的单克隆 抗体和高效杀伤力的小分子化合物通过一个具有连接功能的连接子连接在一起，形成的抗 体药物复合物。既能避免单克隆抗体后期产生的耐药性导致的疗效不佳，又能克服小分子 损伤正常组织引起的副作用等缺点。目前有三个ADC药物已经获得了美国FDA批准上市， 一个是gemtuzumAbozoGamicin(商品名Mylotarg，麦罗塔），是由重组人源化lgG4单克隆 抗体（吉妥珠单抗）与细胞毒抗肿瘤抗生素刺孢霉素（calicheamicin)偶联而成。这个药 物已于2010年被撤出市场；另一个药物是bren-tuximabvedotin(商品名Adecetris)，由 CD30的单克隆抗体cACIO与MMAE相偶联所构成，用于治疗复发性霍奇金淋巴瘤（HL)和复 发的系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL)。另一个药物是人表皮生长因子受体2 (HER2)抗 体与美登素衍生物DMl偶联的药物trastuzumab emtansine (简称T-DMl，商品名Kadcyla)， 用于治疗晚期转移性乳腺癌。
[0003] ADC药物由三部分组成：抗体、小分子化合物和连接子。抗HER2人源化单克隆抗 体作为肿瘤治疗药物在临床试验和后续应用中均取得了确切的疗效，是目前最常用的ADC 药物的抗体。MMAE是除TMl之外的另一种最常使用的ADC荷载的化合物，它是一种细胞有 丝分裂的抑制剂，来源于尾海兔毒素家族。MMAE本身对肿瘤的抑制作用并不高，但令人惊 奇的是，MME与单克隆抗体，如anti-⑶30抗体cACIO连接构成ADC后则具有很好的疗效。 连接子是ADC药物的重要组成部分，因为不同的连接子会影响到ADC药物的许多性质，如药 物在体内的半衰期、药代动力学以及药物的旁观者效应（bystander effect)。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种rhHER2抗体与 MMAE偶联物的制备方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的rhHER2抗体与MMAE偶联 物。
[0006] 本发明的再一目的在于提供所述rhHER2抗体与MMAE偶联物的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方 法，包括如下步骤：
[0008] (1)用三（2-羧乙基）膦盐酸盐还原rhHER2抗体；
[0009] (2)还原后的HER2抗体与MMAE的偶联，得到rhHER2抗体与MMAE偶联物。
[0010] 步骤（1)中所述的还原的条件优选为：三（2-羧乙基）膦盐酸盐和rhHER2抗体 按摩尔比1~4 :1配比，于37°C还原30~120min ;更优选为：三（2-羧乙基）膦盐酸盐和 rhHER2抗体按摩尔比3 :1配比，于37 °C还原30min。
[0011] 步骤⑵中所述的偶联的条件优选为：MMAE与还原后的HER2抗体按摩尔比1~ 2 :1配比，于0~37°C反应30~120min ;更优选为：MMAE与还原后的HER2抗体按摩尔比 1. 5~2 :1配比，于0°C反应120min。
[0012] 步骤（2)中所述的MMAE为含有连接子MC-Val-Cit-PAB的MMAE。
[0013] -种rhHER2抗体与MMAE偶联物，通过上述制备方法得到。
[0014] 所述的rhHER2抗体与MMAE偶联物特别适用于制备抗肿瘤的药物。
[0015] 所述的肿瘤优选为乳腺癌。
[0016] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的制备方法简单，得 到的rhHER2抗体与MMAE偶联物抗肿瘤效果强。
【附图说明】
[0017] 图1是抗体还原程度与还原剂量的关系图。
[0018] 图2是还原程度与还原时间的关系图。
[0019] 图3是PH-MMAE结构图。
[0020] 图4是检测ADC的SDS-PAGE图；其中，泳道1和2为还原条件下的PH-MMAE和抗 体（PH)，泳道M为标准蛋白，泳道3和4分别为非还原条件下的抗体（PH)和PH-MMAE。
[0021] 图5是PH-MMAE和PH亲和力比较结果图。
[0022] 图6是PH-MMAE对BT-474细胞生长的抑制结果图。
[0023] 图7是PH-MMAE对SK-BR-3细胞生长的抑制结果图。
[0024] 图8是PH-MMAE对MDA-MB-231细胞生长的抑制结果图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0026] 实施例1
[0027] 1、抗体的还原
[0028] 方法
[0029] I. 1还原剂加入量优化
[0030] 三（2-羧乙基）膦盐酸盐（Tris (2_carboxyethyl)phosphine)简称为 TCEP，是一 种常用的高效还原剂，被广泛用于蛋白质二硫键的还原。本研究选用TCEP作为抗体的还 原剂，通过优化还原剂与抗体的投料比，获得既不破坏抗体活性又能提高偶联物活性的最 佳还原剂量。分别选用TCEP/rhHER2抗体（简称PH，已在"抗人表皮生长因子受体2人源 化单克隆抗体在中国仓鼠卵巢细胞中的表达、纯化及活性测定.黄鹂等，中国药学杂志： 2012,47(11) :884-888"公开，其氨基酸序列同罗氏曲妥珠）的摩尔比=1、2、3、4,在37°C 水浴条件下，水浴120min，测定各自样品中的巯基含量。
[0031] 1.2还原时间优化
[0032] 在摩尔比=3, 37°C水浴条件下，还原时间分别30min、60min、90min、120min，测定 各自样品中疏基含量。
[0033] I. 3还原产物鉴定（DTNB法）
[0034] Ellman试剂，又称DTNB，常用于定量检测游离巯基含量。含巯基化合物能与DTNB 与反应，使DTNB的二硫键断裂，形成黄色化合物2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB)，其在412nm 处有特定的吸收。利用已知含量的巯基化合物作为标准品，绘制标准曲线，将样品测量值与 标准曲线对比即可定量样品中巯基的量。
[0035] ①常温下，将L-cys (L-半胱氨酸）标准溶液用0· 25M Tris-HCl稀释成浓度分别 为 5 μ g/ml、2. 5 μ g/ml、1. 25 μ g/ml、0. 625 μ g/ml、0. 3125 μ g/ml。
[0036] ②取10 μ I样品与190 μ I DTNB分析试剂混勾，静止lOmin。选用200 μ I DTNB分 析试剂作为空白对照。
[0037] ③使用酶标仪测定样品在412nm处吸光值。
[0038] 结果：
[0039] I. 1还原剂加入量优化
[0040] 实验分别选取还原剂（TCEP)与rhHER2抗体的投料摩尔比为1、2、3、4,还原后运 用DTNB法，测定还原样品中巯基含量，根据巯基含量判断抗体还原程度。根据还原剂量与 抗体还原程度的关系（如图1所示），在还原剂与抗体（PH)的投料摩尔比为3时，毒素分 子偶联数N趋近于4。由于Hollander等研究发现，在体外实验中，抗体偶联毒素分子数越 多，对细胞生长抑制作用就越好；但体内实验表明当偶联的毒素分子数为4时，效果反而比 偶联上6-8个毒素分子的生物活性更高，因此建议将平均偶联分子数控制在4左右。因此 本实验选择TCEP和PH的摩尔比为3时为最佳还原剂加入量。
[0041] 1.2还原时间优化
[0042] 为了验证还原程度与还原时间的关系，研究设计在最佳的还原剂加入量条件下 TCEP/PH = 3,检测不同还原时间对抗体还原的影响。设置还原时间分别为30min、60min、 90min、120min，运用DTNB法测定样品中巯基含量，同样选择用N = PH-SH/PH来表征还原程 度。结果如图2所示：在还原30min内，还原程度已经达到峰值，随着还原时间的增加，还原 程度反而有所降低。这可能是因为巯基的性质非常活泼，容易被溶液或空气中的氧化物质 氧化，随着暴露在空气中时间增长，造成巯基的氧化。据此，选择最优的还原时间为30min。
[0043] 2、HER2抗体与MMAE的偶联
[0044] 连接