抗体-尿素酶偶联物在诊断和治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开的内容提供了具有治疗和诊断效用的抗体-尿素酶偶联物。更加具体 而言，本发明公开的内容涉及通过将一个或多于一个完全抗体与尿素酶偶联而制备的诊断 偶联物和/或治疗偶联物。
【背景技术】
[0002] 癌症占美国总死亡率的五分之一，并且是第二致死病因。癌症通常由细胞群的不 受控的分化来表征。这种不受控的分化可涉及血细胞，例如各种不同类型的淋巴瘤，或在 特定组织或器官中聚集的或特定组织或器官本身具有的细胞，例如，实体瘤，所述实体瘤例 如，继发性或原发性乳腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、肠肿瘤、脑肿瘤、骨肿瘤 或前列腺肿瘤。
[0003] 多种治疗方式已计划用于癌症治疗。一种这样的治疗方式涉及使用特定酶抑制癌 细胞的生长。本领域已知的一种这样的酶是尿素酶，其是催化尿素水解成二氧化碳和氨的 酶。更加具体而言，尿素酶催化尿素水解以生成氨和氨基甲酸盐，生成的氨基甲酸盐随后通 过自发水解作用降解而生成另一氨和碳酸。就这点而言，尿素酶的活性倾向于增加其所在 的局部环境的pH值，因为尿素酶产生氨，氨为碱性分子。
[0004] 在本领域中，已意识到在治疗癌症中使用靶向肿瘤相关抗原的抗体的概念有一段 时间（1^1'171161:.31.，（1980)〇311〇611^8631'(31140,717)。然而，就尿素酶而言，毒性成分是 尿的酶降解产生的碱性环境。在这种情况下，所使用的抗体仅需要具有对对应抗原的高结 合亲和性。虽然治疗性抗体可与尿素酶一同使用，但是，目前正在进行的临床试验仅仅使用 了高亲和性抗体片段。这种方式产生了若干独特的考虑因素，包括尿素酶是非常大的酶而 抗体片段显著较小这一事实。为了解决由尿素酶的尺寸产生的可能的空间位阻，常规使用 非人类抗体片段的多个拷贝。
[0005] 因为这些片段的多个拷贝被用于确保合适的结合，需要限制抗体上所包括的其他 成分。而且，因为抗体片段上的结合位点可能有限，所以通过单一栓系（tether)使各个抗 体片段与尿素酶结合。而且，虽然抗体片段的免疫原性看起来最小，但是非免疫原性方式会 消除不良免疫反应的甚至最小的可能性或消除联合给药免疫抑制剂的需要。
【发明内容】
[0006] 本发明公开的内容涉及抗体-尿素酶偶联物。所述偶联物包括共价结合至尿素酶 的一个或两个抗体，所述抗体与尿素酶共价结合从而形成抗体-尿素酶偶联物，所述偶联 物任选地包括与所述尿素酶或所述抗体结合的一个或多于一个治疗剂。
[0007] 在一种实施方式中，本发明提供抗体-尿素酶偶联物，该偶联物包含共价结合至 尿素酶的抗体，所述抗体共价结合至尿素酶从而形成抗体-尿素酶偶联物。一方面，所述偶 联物还包含共价结合至所述抗体或所述尿素酶的治疗剂。
[0008] -方面，所述抗体-尿素酶偶联物包括共价结合至所述尿素酶的至少两个抗体。 在一些方面，所述抗体中的至少一个在两个或多于两个位点处共价结合至所述尿素酶。在 一些方面，所述抗体中的至少一个在三个或多于三个位点处共价结合至所述尿素酶。在一 些方面，抗体中的每一个在两个或多于两个位点处共价结合至所述尿素酶。
[0009]在一些方面，所述抗体中的至少一个是完全抗体。在一些方面，所述完全抗体包 括至少两个Fab片段和Fc片段。在一些方面，所述完全抗体的分子量为至少120kDa，或 130kDa，或140kDa或150kDa。在一些方面，所述完全抗体在两个或多于两个位点处共价结 合至所述尿素酶。
[0010] 在一些方面，所述抗体不指向异常朊病毒。
[0011] 本发明的这些方面和其他方面在下文中进一步描述。
【具体实施方式】
[0012] 歷义
[0013]应当注意地是，除非上下文另有明确说明，本文以及后附的权利要求书中所使用 的单数形式（"a"，"an"和"the"）包括复数指代物。因此，例如，涉及"溶剂（solvent)" 的内容包括多种这样的溶剂。
[0014] 本文使用的术语"包含（comprising或comprises) "是指组合物和方法包括所记 载的元素，但是不排除其他元素。当使用"基本由……构成"限定组合物和方法时，其是指 排除对用于所述目的的组合具有实质性意义的其他元素。因此，基本由本文限定的元素构 成的组合物或工艺不排除对要求保护的内容的基本特性和新特性不产生实质性影响的其 他物质或步骤。"由……构成"是指排除超过痕量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这 些过渡术语中的每一个限定的实施方式在本发明公开的内容的范围内。
[0015] 除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表达成分的量、反应条件等的所 有数字在所有情况下均被理解为由术语"约"修饰。因此，除非有相反说明，在下文的说明 书和所附的权利要求书中列出的数字参数是近似值。每个数字参数应至少根据所报告的有 效数字的数值并应用常规四舍五入法来解释。当在数字标号（例如，温度、时间、量和浓度， 包括范围）之前使用术语"约"时表明可改变正负10%、正负5%或正负1%的近似值。
[0016] 术语"尿素酶"是指具有尿素酰胺水解酶（E. C. 3. 5. 1. 5)的酶活性的酶，其是天然 生成的或通过例如重组核酸技术和/或化学合成而获得。尿素酶还包括融合蛋白，该融合 蛋白包括整个尿素酶，其亚单位或片段，和/或保持多肽的尿素酰胺水解酶活性的带有氨 基酸取代、缺失或添加的尿素酶。
[0017] "偶联物"是指共价连接以形成较大的构建体的两个或多于两个分子。在一些实施 方式中，所述偶联物包括结合至一个抗体或共价连接的两个抗体的尿素酶。一方面，所述连 接是直接连接，其中，尿素酶上的反应性官能团结合至抗体上的互补反应性官能团，例如赖 氨酸的氨基官能团结合至天冬氨酸或谷氨酸的羧基官能团。应当理解的是，这种反应可能 需要对羧基基团进行常规修饰以使其更具有反应性。
[0018] 另一方面，所述连接通过具有两个或多于两个官能团的连接体实现，所述官能团 例如，羧基或氨基，所述官能团使得连接体与尿素酶和抗体这两者发生反应。连接体是本领 域熟知的并且通常包括1至20个原子，所述原子包括碳、氮、氢、氧、硫，等等。所述反应性 官能团可以是相同的，例如，草酸、琥珀酸，等等；或者可以是正交官能团，例如，氨基（偶联 之后成为NH)和羧基（偶联之后成为CO或COO)。
[0019] 一方面，合适的连接体是f-L-R2,其中，R1和R 2是相同的官能团或不同的官能团， R1和R2中的一个连接至抗体，另一个连接至尿素酶。R 1和R2可独立地选自：-NH-，-C0-，-C00 -，-0-，-S-，-NHNH-，-N = N-，= N-NH-，等等。L可以是直烃链或分支的烃链，例如，烷基链， 其中，一个或多于一个碳被氧、氮、酰胺、硫、亚砜、砜、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基等任 选地取代。另一方面，所述连接体可以是氨基酸残基或肽。在一些情况下，所述连接体是可 由酶裂解的或通过pH的改变在靶定位点或接近靶定位点处裂解。一些连接体和适于制备 偶联物的步骤在美国专利 US 4,414，148，US 4,545,985，US 4,569,789，US 4,671，958，US 4, 659, 839, US 4, 680, 338, US 4, 699, 784, US 4, 894, 443 和 US 6, 521，431 中描述。
[0020] 术语"抗体"是指完全或基本完全哺乳动物抗体，包括从小鼠、美洲驼、猪、大鼠、 牛、绵羊等获得的那些抗体。基本完全抗体包含与完全抗体具有至少90%同源性或所述基 本完全抗体被截短以包括抗体的结合位点和完全抗体的至少70%。诸如包含少于抗体的 70%的那些抗体片段之类的抗体片段不在本文公开的抗体的定义范围内。本文使用的"抗 体片段"是指少于抗体的70%的完全抗体的一部分。优选地，抗体识