体不指向异常朊病毒。
[0056]
[0057] 本发明公开的抗体-尿素酶偶联物可通过本领域已知的任何常规手段制备。例 如，抗体可直接偶联至尿素酶或通过连接体偶联至尿素酶。化学偶联分子的方式是本领 域技术人员所熟知的。将抗体偶联至尿素酶的方法在例如美国专利US7, 211，250和US 7, 264, 800中公开，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。
[0058] 稳宙尿素酶
[0059] 在一些实施方式中，本发明提供通过将尿素酶与一个或两个或多于两个抗体偶联 稳定尿素酶的方法，所述抗体用于本发明公开的内容中描述的尿素酶-抗体偶联物。这种 偶联被认为增加抗体-尿素酶偶联物与抗原靶点的结合亲和性，因为抗体的尺寸与尿素酶 的尺寸大致相同，从而显著降低了由使用抗体片段而产生的任何空间位阻。亲和性的这种 增加允许每个尿素酶使用1个或2个抗体。而且，本发明公开的内容的抗体-尿素酶偶联物 可直接结合至一个或两个抗体，任选地可通过连接体结合至一个或两个抗体。抗体尺寸相 对于抗体片段尺寸的增加允许使用多个位点偶联以使结合得以稳定。在一种实施方式中， 偶联物包括在单个抗体和单个尿素酶之间的1个至8个偶联位点。在另一实施方式中，偶 联位点的数目是2个至8个。在一种实施方式中，偶联物包括在单个抗体和单个尿素酶之 间的2个，或3个，或4个至8个偶联位点。在另一实施方式中，偶联位点数目是至少2个， 3个或4个。
[0060] 在一些实施方式中，抗体和尿素酶至少形成防止或减少抗体和尿素酶之间的解离 的化学键，例如，共价键或离子键。一方面，所述化学键是不稳定的，这样，所述化学键在某 些体内环境中降解（例如，肿瘤细胞附近，肿瘤细胞附近的pH不同于正常组织）。另一方 面，所述化学键是非不稳定的并且在正常生理条件下是稳定的。
[0061] 实施例
[0062] 下列实施例以举例说明本发明公开的各种不同的实施方式的目的给出。这些实施 方式无意以任何方式限定本发明公开的内容。本领域技术人员会理解的是，本发明公开的 内容恰好适于实施本发明的目的并且获得本文所述的结果和优势，以及本文固有的任何目 的、结果和优势。本实施例（以及本文所述的方法）目前代表优选的实施方式。它们是示 例性的并且无意限定本发明公开的范围。如权利要求书的范围所限定的，包括在本发明公 开的内容的实质范围内的各种不同的改变和其他应用对于本领域技术人员而言是明显的。
[0063] 实施例1
[0064] 抗体-尿素酶偶联物通过使用SIAB(琥珀酰亚胺基-(4-碘代乙酰基）氨基苯甲 酸酯）作为连接体，将抗_ErbB2单克隆抗体4D5与尿素酶偶联而制备。SIAB是用于通过 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)酯和碘代乙酰基反应性基团进行胺-与-巯基偶联的中等长度的 交联体。SIAB生成长度为约10. 6埃的间隔臂。SIAB由Thermo Scientific销售，并且其 在偶联中的应用在例如 Hermanson, Biocon jugate Techniques, 1996, San Diego, Academic Press中第542页，553页和568页描述。偶联程度可通过增加相对于抗体使用的连接体的 量来增加。而且，抗体可首先通过使用连接体的多个等同物由连接体处理，随后连接体和抗 体的组合可与尿素酶结合。
[0065] 首先，抗4482单克隆抗体405由3148(3148:186的摩尔比=3.8 :1)在原始缓 冲基质的pH条件下活化70分钟。随后加入Tris-HCl缓冲液在室温下淬灭反应10分钟， 得到最终浓度5mM。得到的溶液用冰/水冷却，并且在涡流搅拌的同时加入冷却的高纯度 的尿素酶（5mg/ml，~0C，GMP等级的jack bean尿素酶）。蛋白质摩尔比为l:2/IgG:HPU。 添加1/10体积的Tris-HCl (200mM，pH 8. 45)以在90分钟内调节pH至8. 0-8. 3。对于稳 定性而言，添加水解的SIAB，使大部分尿素酶的表面亚硫酸氢盐溢出。摩尔比为1:7 (尿素 酶：氢-SIAB)，室温，30分钟。随后通过添加半胱氨酸溶液（200mM Tris-HCl缓冲液中含有 100mM，pH8. 45)淬灭反应，得到最终浓度5mM，室温，十分钟。得到的混合物由GE healthcare Superose 610/300柱进行SEC分离，收集各个组分。汇集组分F10-13分钟并且相对于含 有1 %蔗糖和〇. 2mM的EDTA的20mM的精氨酸缓冲液，在pH7. 0的条件下进行透析（MWC0 12-14kD)。随后，通过下列方法分析收集的样品：SDS-PAGE，采用BCA规程的蛋白质分析方 法，采用管规程的尿素酶活性分析方法，以及ELISA结合分析方法以揭示偶联物是活性的。
[0066] 通过上述内容可以理解的是，虽然本发明公开的特定实施方式以举例说明的目的 在本文中进行描述，但是，在不背离本发明公开的实质和范围的条件下可做出各种不同的 改变。
[0067] 在本发明公开的内容的全文中参考了各种不同的专利申请和公开出版物，各种不 同的专利申请和公开出版物中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
【主权项】
1. 一种抗体-尿素酶偶联物，该偶联物包含共价结合至尿素酶的一个或两个抗体，所 述抗体共价结合至尿素酶从而形成抗体-尿素酶偶联物，所述偶联物任选地包含结合至所 述尿素酶或所述抗体的一个或多于一个治疗剂。2. -种抗体-尿素酶偶联物，该偶联物包含共价结合至尿素酶的抗体，所述抗体共价 结合至尿素酶从而形成抗体-尿素酶偶联物。3. 如权利要求2所述的抗体-尿素酶偶联物，所述偶联物还包含共价结合至所述抗体 或所述尿素酶的治疗剂。4. 如权利要求1至3中任一项所述的抗体-尿素酶偶联物，所述偶联物包含共价结合 至所述尿素酶的至少两个抗体。5. 如权利要求1至4中任一项所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述抗体中的至少一 个在两个或多于两个位点处共价结合至所述尿素酶。6. 如权利要求1至5中任一项所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述抗体中的至少一 个在三个或多于三个位点处共价结合至所述尿素酶。7. 如权利要求1至6中任一项所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述抗体中的每一个 在两个或多于两个位点处共价结合至所述尿素酶。8. 如权利要求1至7中任一项所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述抗体中的至少一 个是完全抗体。9. 如权利要求8所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述完全抗体包含至少两个Fab片 段和Fc片段。10. 如权利要求8所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述完全抗体的分子量为至少 120kDa〇11. 如权利要求8所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述完全抗体在两个或多于两个 位点处共价结合至所述尿素酶。12. 如权利要求11所述的抗体-尿素酶偶联物，其中，所述抗体不指向异常朊病毒。13. -种稳定尿素酶的方法，所述方法包括在一个或多于一个位点处使所述尿素酶与 至少一个抗体偶联以形成抗体-尿素酶偶联物。14. 如权利要求13所述的方法，其中，所述尿素酶在一个至八个位点处与所述抗体偶 联。
【专利摘要】本发明公开的内容提供了具有治疗和诊断效用的抗体-尿素酶偶联物。更加具体而言，本发明公开的内容涉及通过将一个或多于一个完全抗体与尿素酶偶联而制备的诊断偶联物和/或治疗偶联物。
【IPC分类】C12N9/96, C07K16/00, A61P35/00, C07K16/28, C12N9/80, A61K47/48
【公开号】CN105247047
【申请号】CN201480025121
【发明人】巢立文
【申请人】赫利克斯生物药品公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年4月3日
【公告号】CA2908475A1, EP2984170A1, US20160138002, WO2014165985A1