使用重组酵母全细胞的猪圆环病毒(pcv2)亚单位疫苗及其制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于为母猪和猪崽接种疫苗的重组的猪圆环病毒（PCV2)亚单位疫苗 及其生产方法，该重组的猪圆环病毒（PCV2)亚单位疫苗包括重组的酵母全细胞并且可预 防猪圆环病毒（PCV)相关的疾病。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2 (PCV-2)已知是断奶后多系统衰竭综合征（PMWS)的主要致病源的病 毒。难以开发能够预防猪圆环病毒造成伤害的疫苗的原因是，使用动物细胞生产疫苗需要 相对昂贵的培养基和动物细胞培养系统，以及在血清培养基中所含的各种异源蛋白有可能 在接种期间产生副作用。
[0003] 四种基于来自PCV2a病毒的0RF2抗原的PCV2疫苗正在全球市场上出售。在外 国，在技术上处于最高水平的公司是梅里亚（Merial，法国），该公司有很多与PCV相关的专 利，并且使用经灭活的PCV2全病毒（Circovac)。勃林格殷格翰（BoehringerIngelheim) 开发了一种通过在杆状病毒中表达0RF2所获得的基于重组蛋白的疫苗（避开了PCV和 Ciroflex)，其中该疫苗的优点在于纯化之后每次以lml的量进行注射。英特威（Intervet) 有限公司通过在杆状病毒中表达0RF2并且纯化表达产物也开发了一种基于重组蛋白的疫 苗，其中该疫苗被设计为以3周的间隔，以2ml的量注射到猪崽体内两次。FortDodge有限 公司通过在PCV-1病毒中表达PCV2的0RF2开发了一种嵌合体疫苗，其中该嵌合体疫苗以 2ml的量一次注射到猪患体内。
[0004] 在重组病毒的亚单位疫苗的情况中，形成病毒样颗粒（VLP)能增加疫苗的抗原性 是已知的。在酵母的情况中，已经开发了利用酿酒酵母（S.cerevisiae)菌株中的Tyl( - 种很久之前就已知的逆转录转座子元件）的技术。Tyl在基因、结构和功能上与逆转录病毒 的核苷/核相似。在1987年报道了使用Tyl获得的疫苗，并且当疫苗候选基因与Tyl基因 的3'区域融合并且进行表达时，有如下优点：不阻碍病毒样颗粒的形成并且可在细胞中形 成病毒样颗粒，而不需要其它分离的因子。有几篇报道指出：当在酵母中生产疫苗时，酵母 细胞壁组分还可用作佐剂（ChanGC,ChanWK，SzeDM. 2009,Theeffectsofbeta-glucan onhumanimmuneandcancercells.JHematolOncol2:25)。
[0005] 已知的是，如果裂解酵母细胞以提取在细胞中表达的抗原，则在制备细胞裂解液 之后，诸如病毒样颗粒的抗原难以稳定地保持在溶液中。此外，还可能需要各种添加剂（例 如，诸如聚山梨醇酯20的表面活性剂，诸如蔗糖、海藻糖或山梨糖醇的糖，等等），来防止 病毒样颗粒发生聚集和沉淀（LangR,WinterG,VogtL，ZuercherA，DorigoB，Schimmele B(2009))。被开发用来克服上述缺点的使用酵母全细胞的重组疫苗可享有酵母能表达一种 或多种抗原、具有高稳定性并且还易于进行大量生产的优点。
[0006] 本发明人已经发现，表达猪圆环病毒抗原0RF2的酵母全细胞疫苗具有非常高的 免疫原性，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的目标是提供一种表达重组载体的酵母全细胞，或该细胞的裂解液，包括 细胞或其裂解液的猪圆环病毒疫苗组合物，以及它们的生产方法，其中重组载体包括编码 猪圆环病毒的II型衣壳蛋白的基因0RF2。
[0009] 技术方案
[0010] 在本发明的一个实施方式中，提供了一种用于猪圆环病毒疫苗的酵母全细胞，所 述酵母全细胞包括猪圆环病毒的II型衣壳蛋白0RF2。在该实施方式中，基因0RF2可以是 由SEQIDN0:1表示的基因。酵母用作宿主细胞，并且可以是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的菌株。具体地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全细胞可经热 灭活或者经福尔马林灭活。
[0011] 在本发明的另一实施方式中，提供了一种用于猪圆环病毒疫苗的酵母全细胞的裂 解液，所述酵母全细胞的裂解液包括猪圆环病毒的Π型衣壳蛋白0RF2。基因0RF2可以 是由SEQIDN0:1表示的基因。酵母用作宿主细胞，并且可以是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的菌株。具体地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全细胞可经热灭 活或者经福尔马林灭活，并且所述酵母全细胞的裂解液可来源于经热灭活或经福尔马林灭 活的酵母全细胞。
[0012] 在又一实施方式中，提供了一种猪圆环病毒疫苗组合物，所述猪圆环病毒疫苗组 合物包括酵母全细胞或该细胞的裂解液，该酵母全细胞包括猪圆环病毒的II型衣壳蛋白 0RF2。在该实施方式中，基因0RF2可以是由SEQIDN0:1表示的基因，并且0RF2蛋白可以 是包括SEQIDN0:2的氨基酸序列的多肽。进一步地，酵母用作宿主细胞，并且可以是酿酒 酵母Saccharomycescerevisiae的菌株。具体地，所述酵母可以是Y2805菌株，并且可缺乏 半乳糖操纵子（gal)80基因。此外，所述酵母全细胞可经热灭活或者经福尔马林灭活。根 据本发明的疫苗组合物可包括浓度为4x10s的酵母全细胞或更少的细胞。
[0013] 在又一实施方式中，提供了一种生产用于猪圆环病毒疫苗的经转化的酵母全细胞 或其裂解液的方法，所述方法包括如下步骤：制备包括基因0RF2的重组表达载体，该基因 0RF2编码猪圆环病毒的II型衣壳蛋白；和，使用所述重组载体转化酵母。在该实施方式 中，基因0RF2可以是由SEQIDNO: 1表示的基因。酵母用作宿主细胞，并且可以是酿酒酵 母Saccharomycescerevisiae的菌株。具体地，所述酵母可以是缺乏gal80基因的Y2805 菌株。在该实施方式中，重组表达载体可包括GAL10启动子，因此0RF2可与Tyl融合，以便 可增加它的表达。此外，所述酵母全细胞可进一步经热灭活或者经福尔马林灭活。
[0014] 在又一实施方式中，提供了一种用于为猪接种疫苗的方法，所述方法包括：对猪 给予猪圆环病毒疫苗组合物，所述猪圆环病毒疫苗组合物包括酵母全细胞或该细胞的裂解 液，该酵母全细胞包括猪圆环病毒的II型衣壳蛋白0RF2。在该实施方式中，所述0RF2蛋白 可以由SEQIDN0:1表示的基因编码，并且可以是包括SEQIDN0:2表示的氨基酸序列的 多肽。酵母用作宿主细胞，并且可以是酿酒酵母Saccharomycescerevisiae的菌株。具体 地，所述酵母可以是Y2805菌株，并且可缺乏gal80基因。在该实施方式中，重组表达载体 可包括GAL10启动子，因此0RF2可与Tyl融合，以便增加它的表达。
[0015] 根据本发明的疫苗可按照本领域技术人员已知的技术进行灭活。所述灭活优选通 过化学途径进行，例如通过使抗原暴露于诸如甲醛（福尔马林）、多聚甲醛、β-丙内酯或吖 丙啶或其衍生物的化学试剂，但并不限于此。
[0016] 本文所使用的术语"转化株"指通过将外源DNA(例如质粒或杂种DNA)引入到细 胞中，然后使该DNA在细胞中进行复制和表达而获得的细胞。按照醋酸锂的方法（Nucleic AcidsResearch19, 5791 (1991))将包含外源DNA的质粒转化到酵母中。
[0017] 本文所使用的术语"克隆"指一系列的过程，其中，基因通过PCR技术被插入到包 括质粒的递送系统中或从该递送系统中移出，用于在基因中形成新的限制酶切位点。
[0018] 本文所使用的术语"为……接种疫苗"指如下过程：将诸如蛋白或抗原的活性成分 注入体内以产生免疫应答，从而产生记忆B细胞，然后诱导针对同一抗原的快速免疫应答， 以便活性成分可用作对抗特定疾病的治疗试剂。
[0019] 本文所使用的术语"细胞裂解"指破坏细胞膜或细胞壁以释放细胞内容物的过程 (例如搅拌珠子和细胞的过程），并且术语"细胞裂解液"指通过裂解细胞获得的细胞内组 分和细胞外组分的混合物。
[0020] 本文所使用的术语"断奶后多系统衰竭综合征（PMWS) "指以断奶猪崽中的消耗综 合征为特征的猪病，这已经在多个国家（包括加拿大、美国、北爱尔兰、欧洲、韩国、日本、台 湾等）中进行了报道。断奶后多系统衰竭综合征（PMWS)在断奶猪崽中引起死亡、萎缩或体 增重降低，并且它通常持续6个月至1年的时间段，从而带来严重的经济损失。在韩国，1997 年报道了PMWS的第一次爆发，并且PMWS在2007年导致约六百万猪崽的死亡，这对应于损 失约二十亿圆（韩国货币）（韩国农村经济研究所（KoreaRuralEconomicInstitute))。
[0021]