针对胞内劳森菌和猪圆环病毒2型的疫苗的制作方法【专利摘要】本发明涉及包含灭活全细胞胞内劳森菌细菌和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白质组合的疫苗，用于通过该疫苗的皮内施用而保护猪对抗胞内劳森菌和PCV2的感染。本发明还涉及保护猪对抗胞内劳森菌细菌和PCV2感染的方法。【专利说明】针对胞内劳森菌和猪圆环病毒2型的疫苗[0001]本发明的一般领域[0002]本发明一般性地涉及猪健康领域。猪易感许多致病性微生物。感染的控制通常是通过饲养场所和饲料的管理，用药物(如抗病毒药和抗生素）治疗，或使用疫苗的预防性治疗而完成的。[0003]本发明的目的[0004]对于用于猪健康管理的方便，安全和有效的手段有持续的需求。[0005]发明概述[0006]为了满足本发明的目的，设计了用于抗各种导致疾病的微生物感染的猪的组合保护的新疫苗，所述疫苗包括灭活全细胞胞内劳森菌细菌（Lawsoniaintracellularisbactria)和猪圆环病毒2型(PCV2)0RF2蛋白的组合。由于它们对猪健康的负面影响，PCV2和胞内劳森菌都导致巨大的经济损失。虽然药物和疫苗是已知的并且可商购的以治疗PCV2和/或劳森菌感染，但仍存在着对以安全和方便的方式提供良好保护的新方式的持续需求。已经描述了抗PCV2和劳森菌感染的组合疫苗，但是不可商购的。实际上，并不是所有的设计或建议的抗原组合，尤其不是每个和各种施用方式，都可获得安全和有效的组合疫苗。事实上，关于组合疫苗的安全和效力总存在不确定性水平，特别是当施用方案被改变时。[0007]欧洲药品评估局(EMEA)的兽药产品委员会在其出版物"指南:对于组合兽药产品要求（Noteforguidance：requirementsforcombinedveterinaryproducts)''（EMEA，2000年，CVMP/IWP/52/97-FINAL)中，宣称(第2/6页）"组合疫苗的开发并不简单。每个组合应该在质量，安全性和有效性方面分别地开发和研究"。该委员会还指出，对于良好组合疫苗的探索通常包括在组合疫苗中各个成分之间的相容性，包括例如防腐剂，赋形剂和稳定剂，灭活剂和佐剂。在第3页首段，指出"在组合疫苗中，多于一种成分的存在可以经常引起相互作用，导致对个别成分减弱或增加的反应，相比于当特定成分被单独施用时......这种相互作用往往本质上是免疫学的，但也可以是通过对免疫系统具有较少直接效应的其它因素引起的"，并且还有"当佐剂被用于增加对组合疫苗的免疫应答时，可出现特殊的问题"。[0008]美国卫生和人类服务部，食品和药品管理局，生物制品评价和研究中心(DepartmentofHealthandHumanServices,FoodandDrugAdministration,CenterforBiologiesEvaluationandResearch)在1997年4月发布了"行业指南，对组合疫苗可预防疾病的评价：生产，测试和临床研究"（GuidanceforIndustry，fortheevaluationofcombinationvaccinesforpreventablediseases：Production,TestingandClinicalStudies"，在指南中指出（第3页，"成分的相容性（CompatibilityofComponents)"）"实验显示组合的单价疫苗可能产生新的组合，其比所期望的具有较低的安全性或效力。有时灭活疫苗的成分可以对一个或多个活性成分起相反作用"，表明尤其是灭活疫苗可负面影响活疫苗的效力，如例如当活的百日咳疫苗和灭活脊髓灰质炎病毒组合时发生，其导致疫苗具有降低的百日咳效力。这表明当相比于个别疫苗时，在疫苗中任何其它成分可能使最终产品的安全性和效力复杂化。[0009]世界卫生组织(WHO)发布了名为"疫苗安全基础"的电子学习课程，在模块2中考虑了组合疫苗。这个模块开始于"特许的组合疫苗在被国家当局批准之前进行充分的测试以确保产品是安全，有效和质量合格的。"它也指出"对于所有的组合，制造商必须因此评估每个抗原成分的效力，当结合以诱导免疫时所述疫苗成分的有效性，可能回复到毒性的风险，和与其他疫苗成分的反应。"[0010]在这个电子课程的第53页，WHO报道"施用途径是通过其将疫苗(或药物)与身体接触的途径。这是免疫成功的关键因素。物质必须从进入的部位输送到希望其发挥作用的身体部位。然而，为了这个目的使用人体的运输机制，并非是不重要的。"[0011]加利福尼亚健康服务部门计划免疫科（CaliforniaDepartmentofHealthServices7ImmunizationBranch)^-^[：Twww.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/appendices/d/vacc_admin.pdf)。涉及施用部位的是在第7页，第1全段中宣称"对于每个疫苗的推荐途径和部位是基于临床试验，实际经验和理论考虑的。该信息包括在每个疫苗的制造商产品信息中。在疫苗施用中使用5种途径。偏离推荐途径可降低疫苗的效力或增加局部的不良反应。"第14页唯一获得美国许可的皮内疫苗写到"FluzoneIntradermal是美国许可的仅有的通过皮内途径施用的疫苗。它仅被批准在18至64岁的人群中使用。此Fluzone制剂与灭活流感疫苗肌内制剂(TIV)是不同的。其它的TIV制剂不应当通过皮内途径施用。"[0012]总之，特定抗原和施用部位的任意组合并不简单，并需要实验来确定安全性和有效性。[0013]本发明，除了疫苗本身，还涉及用于保护猪对抗胞内劳森菌细菌和PCV2感染的方法，包括在皮内施用所述疫苗，并且涉及构建这种疫苗的方法。[0014]定义[0015]疫苗是保护对抗(疫苗接种后)致病性微生物感染的构成。[0016]保护对抗致病性微生物感染表示在接种宿主中预防或降低通过微生物本身的感染，或预防或减少由感染产生的(亚)临床疾病，通常通过干扰微生物本身，例如通过抗体。[0017]包含灭活全细胞细菌作为抗原的组合物，包括衍生自活的、全细胞细菌的灭活的抗原构成。这不排除该细菌细胞(至少部分)在灭活过程中破裂，或者说，灭活全细胞的提取物或匀浆物实际上是作为本发明意义上的"包含灭活全细胞细菌疫苗"的抗原提供。灭活全细胞胞内劳森菌是例如W02009/144088和W097/20050中已知的。[0018]PCV20RF2蛋白质是猪圆环病毒2型衣壳蛋白。PCV2的0RF2编码约28kDa的蛋白质。所有PCV-2分离株的0RF2共享91-100%的核苷酸序列同一性和90-100%推断的氨基酸序列同一性(Fenaux等人，J.Clin.Micorbiol.，38(7),2494-2503，2000年K0RF2蛋白质可以例如是重组表达的，例如在杆状病毒表达系统中，如在W02007/028823，W02007/094893或W02008/076915中所描述的。[0019]疫苗的皮内施用意味着足够量的疫苗沉积于真皮内，导致与用相同疫苗和其体积肌内施用显著不同的免疫应答（特别是：当在如在实施例3中所概述设置的测试中使用Wilcoxon秩和检验时，p值应小于0.10,优选小于0.05)。几个装置是可商购的用于皮内接种，例如，在Vaccine，2012年1月11日；30(3):523-38中描述的IDAL?vaccinator(MSDAnimalHealth)，Pulse50MicroDose(脉冲无针系统（PulseNeedleFreeSystems))或其他装置(具体见表1，第525页："用于液体和固体制剂施用的不同装置概述(Anoverviewofdifferentdevicesforliquidandsolidformulationadministration)''）。[0020]用于在保护中使用的疫苗的单次注射施用意味着为了获得保护性免疫，接种并不需要第二次施用加强。在一个两次注射方案中，第一(初始的）疫苗接种典型地从第一次施用6周内加强，通常是从第一次施用3周内或甚至2周内，而可以理解只有在第二(加强)施用后才可能获得保护性免疫。[0021]药学上可接受的载体是生物相容的介质，即经过施用后介质在受试动物中不诱导显著的不良反应，能够在疫苗施用后呈递抗原给宿主动物免疫系统。这样的载体可以是含有水和/或任何其它生物相容性溶剂的液体，也可以是固体，如通常用于获得冻干疫苗的固体(基于糖和/或蛋白质）。[0022]发明的实施方案[0023]在一个实施方案中，疫苗用于在单次注射施用后对猪的保护。有利地发现，即使在单次注射施用疫苗后猪也被保护对抗两种病原体。这个实施方案不排除进行后续接种，例如在第一次疫苗接种6至12个月后接种以延续保护水平。这个后续接种不同于初始-加强的疫苗接种方案中的加强接种，其中保护仅被认为是在加强接种后获得。在初始-加强的方案中，两次接种通常分隔2-3周进行。[0024]在一个实施方案中，疫苗包含佐剂。我们发现佐剂，其通常用于改善灭活抗原的免疫反应，当施用疫苗至真皮内（其不良反应已知的部位)时，不会负面干扰劳森菌或PCV2抗原，也不过度增加对其它抗原的反应性，尽管WHO在其疫苗安全基础课程(见上文)课程第1页最后2行(小节"组合疫苗"）中明确警告这种类型的干扰和反应性。在进一步的实施方案中，佐剂包含非生物可降解的油，如例如可以从ExxonMobil?得到的饱和烃油(Marcol?52)〇[0025]在一个实施方案中，疫苗进一步包括灭活的猪肺炎支原体（mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo)抗原，优选Mhyo菌苗。这已证明获得了对抗三种主要猪病原的方便、安全和有效的疫苗。[0026]在又一个实施方案中，疫苗包含每剂量1X109灭活的胞内劳森菌细菌，即灭活的胞内劳森菌抗原以这样的载量，所述载量使得所述疫苗每剂量包含对应于1X1〇9胞内劳森菌细菌的胞内劳森菌抗原。更高的抗原载量，未在本实施方案中排除的，可以积极地影响保护的水平和免疫期。[0027]在一个实施方案中，劳森菌细菌是在添加细菌到组合物中之前被冷冻干燥，例如含有水性组合物或乳液的PCV20RF2，以构成疫苗。[0028]用同样的方法，在构建用于皮内施用疫苗的方法中，所述方法包括:组合灭活的全细胞胞内劳森菌和猪圆环病毒(PCV2)0RF2蛋白质与药学上可接受的载体，所述灭活的全细胞胞内劳森菌可以是冷冻干燥的形式，并且加入到包含载体和PCV20RF2蛋白质的液体制剂中，通常在施用前1小时加入。[0029]本发明将使用下面的实施例和附图作进一步的解释。实施例[0030]实施例1是一个实验，其表明单剂量的皮内接种可以提供抗猪圆环病毒2型感染的23周免疫。[0031]实施例2是另一个实验，用PCV2ID-次接种方式表明接种是安全的并且导致保护性滴度。[0032]实施例3是在皮内和肌内接种之间的直接比较。[0033]实施例4描述了用组合的皮内接种的实验。[0034]实施例5描述了组合疫苗，各种抗原剂量和各种佐剂的实验。[0035]实施例6描述了组合疫苗的进一步实验。[0036]图1在免疫期研究中的血清学[0037]图2在血清，粪便和器官中的病毒载量[0038]图3平均体温[0039]图4平均总PCV2IgAb结果[0040]图5平均PCV2IgMAb结果[0041]图6在持续研究中抗体的滴度[0042]图7在器官中的病毒载量[0043]图8在器官中的病毒载量[0044]实施例1[0045]实验设计[0046]具有抗PCV2抗体的10头母猪的后代被用于这项研究。一窝仔猪被划分为2组每组15头动物。在3周龄，组1的仔猪在颈部的右侧用0.2ml包括重组表达的猪圆环病毒2型的0RF2蛋白质的疫苗进行皮内接种(对于蛋白质的提供，参见W02007/028823)，使用市售的皮内注射装置IDAL?(售自MSDAnimalHealth，Boxmeer，荷兰），而组2未被接种并且作为对照组。每天观察所有研究动物的临床表征。在疫苗接种时，9，17，19和21周后，收集所有动物的血液样品。在接种23周后，使用鼻内施用野生型PCV2攻击病毒株感染攻击每头动物。[0047]在攻击前1天和攻击1，2和3周后，收集血清样品和粪便拭子并且通过定量PCR检查PCV2病毒核酸。另外的，检查血清样本的PCV2抗体。[0048]攻击3周以后，所有动物进行尸检并且腹股沟淋巴结，扁桃体和肺组织被取样用于测定PCV2病毒抗原和核酸。[0049]使用的疫苗是作为水包油型乳液提供的，其包含5%v/v的矿物油Marcol?52(Exxon)，0.30%w/v的乙酸维生素E和0.32%的吐温80(吐温80;SigmaAldrich)，注射用水和每0.2毫升的2000AUPCV2蛋白。该AU单位是基于PerkinElmer的AlphaLISA测试而计算的。对于这个测试，聚苯乙烯微量滴定板的孔中填充有含有PCV20RF2抗原的测试样品的连续稀释液和参照标准品的的连续稀释液。[0050]这些稀释液与受体珠(包被有针对PCV20RF2的单克隆抗体），和生物素标记的也针对PCV20RF2的第二抗体一起孵育。然后通过与链霉亲和素包被的供体珠一起孵育和化学发光检测定量结合第二抗体的数量。参照标准品使得可以商购的疫苗Porcilis?PCV被设置为每(2毫升)剂量包含5000AU。[0051]实验步骤[0052]每日观察[0053]所有猪每天观察疾病的临床表征。观察结果包括全身反应，其包括食欲不振，倾向躺下，精神萎靡或嗜睡，发抖，毛发直立，水肿(特别是眼睛周围），呕吐，腹泻和呼吸困难。[0054]血液采样[0055]在接种疫苗前，9，17，19和21周后收集血液样品。在攻击前1天，和攻击后7，13和19天收集血液样品。这是在所有猪上单个进行的[0056]粪便擦拭[0057]在攻击前1天，和攻击后7、13和18天，从所有动物收集粪拭子，每个动物使用一个干燥的拭子。使用标准程序收集拭子到含有抗生素的培养基中。在培养基中擦拭材料的悬浮液通过离心而澄清，等分并且储存在<-18°C下直至进一步的应用。[0058]血清学[0059]使用标准ELISA程序，检测所有的血清样本的抗PCV2抗体。简而言之，连续稀释的血清样品在包被有杆状病毒表达的PCV20RF2抗原的微量滴定板中孵育。除去血清后，将所有孔用固定量的生物素标记的PCV2特异性单克隆抗体孵育。然后用过氧化物酶缀合的链霉亲核素孵育结合的MoAb，随后进行发色检测。滴度表示为log2滴度。[0060]尸检检查[0061]在实验结束时，所有动物通过击晕后放血而被安乐死。在尸检期间，打开动物，原位检查内脏，要特别注意以下器官:肺，腹股沟和肠系膜淋巴结，扁桃体，胸腺，脾脏，肝脏和肾脏。在此之后，来自扁桃体，肺(肺叶附件），和腹股沟淋巴结的样品被移除而用于快速冷冻并且用于后期的通过定量PCR(qPCR)的分析。[0062]定量PCR[0063]在所有血清和粪便拭子，和在扁桃体，肺和腹股沟淋巴结的10%组织匀浆上实施定量PCR(qPCR)。简而言之，使用商业试剂盒从样品中提取DNA。通过聚合酶链反应(PCR)定量每个样品中的PCV2基因组DNA，所述PCR反应使用引物和一个PCV2特异性的双重标记的水解探针。特定荧光超过阈值的循环数是与一组含有已知量的包含PCV2质粒的样品的循环数相关。结果表示为loglO拷贝AU反应混合物(loglOc/yl)。[0064]结果[0065]在实验开始时，发现所有的动物是健康的。在对照组中，发现一只动物在接种6周后(wpv)死亡。两只接种疫苗的动物有轻微的局部问题，即轻微的动感功能障碍(一条腿僵硬）。考虑到是小问题，没有治疗这些动物。在接种的动物中没有显示出任何疾病或全身反应，如高热，减少的食物摄入，过敏性休克或呕吐。[0066]血清学的结果显示在图1中。很显然，接种疫苗的动物似乎维持到约4.01og2水平的抗-PCV2滴度，而在对照动物中滴度降低到检测限以下。在攻击后(接种23周后，在26周龄），在接种组中滴度小幅上涨。在对照组中滴度上升到相同的水平。[0067]定量PCR的结果显示在图2A，2B和2C("dpc"=攻击后的天数）中。似乎接种的动物，在接种疫苗23周后被保护免于PCV2感染的攻击，如在血清，淋巴器官和肺中PCV2核酸的显著减少所示。此外，该疫苗能减少病毒脱落，如通过在至少23周的抗PCV2的粪便拭子上的病毒载量的显著减少所证明。这是在具有大约Hog2的循环抗体滴度的野生动物中进行，所述滴度被认为是中等的水平。[0068]实施例2[0069]实验设计[0070]来自一个产仔批次的一批共46个仔猪被分配到4个治疗组:2个接种组每组13头仔猪和2个对照组每组10头仔猪。当仔猪是大约2周龄时，组1按照上述实施例1所示被接种，当仔猪是大约3周龄时，组2被接种。用单剂量疫苗在颈部的右侧皮内接种仔猪。组3(对照组2周龄的动物)和组4(对照组3周龄的动物)未被接种。在接种疫苗当天，接种2,3和4周后收集所有动物的血清样品。在接种前1天，接种当天和接种后4小时以及接种1，2,3,4天后测量温度。[0071]实验步骤[0072]在接种前，观察仔猪的一般健康。在Τ=_1天，T=0天的接种后0和4小时，和在接种后Τ=1，2，3，4天，测量所有仔猪的体温。[0073]在接种当天和接种2,3和4周后收集血液样品。根据标准程序，对所有猪分别进行。不加入抗凝血剂收集血液样品。血清从凝结的血液样品中制备并且等分试样装填并且保存于-20°C下直至分析。[0074]根据在上文实施例1("血清学"）所示，测试总PCV2的Ig抗体和PCV2IgM抗体ELISA，除了在IgM抗体ELISA的情况下，用IgM抗体包被该平板，然后用PCV20RF2抗原孵育，在用固定量的生物素标记的PCV2特异性单克隆抗体孵育之前。[0075]结果[0076]在实验开始时，发现所有的动物是健康的。体温的平均结果显示在图3中。在2和3周龄动物之间的体温平均增加没有看到差异(最大平均增加是在〇.〇_〇.3°C之间）。另外，在1组和2组中动物个体体温的最大增加是可以与在两个对照组中动物个体的最大温度增加相当。[0077]总PCV2Ig抗体ELISA[0078]总PCV2Ig抗体反应的平均结果概述在图4中。在接种时，2周龄的接种仔猪相比于3周龄的接种仔猪具有较高的(最可能母体来源的)PCV2抗体滴度。接种的动物表现出比对照动物显著较高的滴度增加。[0079]PCV2IgM抗体ELISA[0080]PCV2IgM抗体反应的平均结果显示在图5中。在接种时所有动物呈现出IgM抗体阴性。接种后，3周龄的动物相比于2周龄的动物具有相当更快和更高的IgM抗体反应。对照动物在整个研究中保持阴性。[0081]基于这些结果，可以得出结论，在2和3周龄仔猪的单一剂量皮内接种导致了可接受的安全性和良好的血清学反应。可以获得与另一个实验相当的结果(数据未显示），其中循环抗体滴度的起始水平甚至更高，即高达9.41og2，这被认为是在中等范围的高端。[0082]实施例3[0083]实验设计[0084]总共30头仔猪被分配到3个治疗组，每组30头。按照上文实施例1所述用单剂量疫苗皮内接种组1的仔猪。在相同位置(在颈部）以相同剂量，用单剂量的相同疫苗肌内接种组2的仔猪，并且组3的仔猪未经处理。在接种当天，接种3和5周后收集所有动物的血清样本。[0085]实验步骤[0086]在接种前，根据标准程序，观察仔猪的一般健康。根据按照上文实施例2所述的程序进行总抗PCV2抗体和PCV20RF2特异性IgM抗体的血液以及血清学取样。[0087]结果[0088]在研究开始发现所有的动物是健康的。血清学的结果概述在表1(滴度表示为log2)中。在接种疫苗时，平均抗体滴度是较高的。接种疫苗之后，没有动物表现出PCV2抗体滴度的增加。在接种3和5周后，可以观察到ID组比頂组具有较高的平均PCV2抗体滴度。[0089]抗PCV2IgM血清学的结果概述在表2(滴度表示为log2)中。在接种3周后，ID组的抗PCV21gM抗体滴度显著高于頂组和对照组。[0090]表1:平均抗体的结果[0093]表2:抗PCV2的IgM抗体的平均结果[0095]当使用Wilcoxon秩和检验时，对于ID组相比于IM组的IgM应答差异的p值是0.0001。[0096]实施例4[0097]具有抗PCV2抗体的几头母猪的后代可以用于这项研究。一窝仔猪18头动物被划分为3组。在3周龄，根据上文实施例1所述皮内接种组1和组2的仔猪。根据制造商的说明在颈部的另一侧，组2的动物在相同的时间用市售疫苗灭活Mhyo疫苗P〇rcilis?MHyoIDOnce(包含Mhyo菌苗）进行皮内接种。组3(对照组）的动物保持未处理。每日观察所有的研究动物。在接种疫苗时和每隔一周的时间直至动物被送去屠宰(23-25周龄)收集血清样品。检查这些样品的PCV2抗体。[0098]实验程序是按照上文实施例1所述的。获得的血清学显示在图6中。从该图中可以清楚地看到抗PCV2滴度在根据实施例1所述的实验中确定的41og2水平以上维持的很好，并且被发现是保护性的。在疫苗之间没有负干扰的指示。[0099]重复这个实验以检查抗致命的猪肺炎支原体的保护。对于这个重复实验，使用了60头仔猪。40头动物在18-24天龄接种Mhyo疫苗并且这些动物中的20头也接种PCV疫苗。20头动物未接种疫苗并且作为攻击对照。接种后三周，用致命性猪肺炎支原体菌株感染所有动物，并且攻击后3周所有动物都进行尸检研究肺损伤。在各组之间比较肺损伤评分(LLS)。[0100]用P〇rcilis?MHyoIDOnce接种的组的LLS是显著低于那些对照组（p<0.05，Dunr/s检验）。在已经用P〇rcilis?MHyoIDOnce单独或与PCV疫苗联用接种的组之间没有显著差异。因此可以得出结论，将组合的疫苗接种对用P〇rcilis?MHyoIDOnce获得的免疫没有负面影响。[0101]实施例5[0102]总共八支疫苗配制成含有PCV20RF2蛋白质（250至6000AU/0.2毫升），猪肺炎支原体(与P〇rcilis?MHyoIDOnce具有相同的水平)和胞内劳森菌抗原(参见W020089/127684，实施例2的灭活全细胞抗原：以每0.2毫升大约IX109个细胞的水平）。该疫苗含有不同的佐剂。一些疫苗使用现有的包含生物可降解油的佐剂DiluvacForte(MSDAniamlHealth，Boxmeer，荷兰;所谓的"DF"）。其它使用的佐剂制剂根据上文实施例1所述(被称为"X-solve12"），或具有与X-solve12相同成分配制成的佐剂，但是以X-solve12的一半的浓度(被称为1-8〇1￥66"）或2.5倍浓度(被称为1-8〇1￥630"）。所得疫苗分别如下(11^〇和胞内劳森菌抗原没有被列举;每剂量的含量）：[0103]第1组：2000AUPCV2/X_solve30[0104]第2组：250AUPCV2/X-solve12[0105]第3组：500AUPCV2/X_solve12[0106]第4组：2000AUPCV2/X_solve12[0107]第5组：2000AUPCV2/X_solve6[0108]第6组：500AUPCV2/DF[0109]第7组：2000AUPCV2/DF[0110]第8组：6000AUPCV2/DF[0111]8头母猪的后代被用于本研究。仔猪具有抗PCV2的中等（中等水平)母体来源抗体(MDA)(平均:6.71og2)。在3/4周龄，使用IDAL?疫苗接种器，单剂量皮内接种组1至8的仔猪。组9的仔猪维持未接种。接种7周后，所有动物被运送到攻击装置。一天后用PCV2攻击菌株感染攻击所有的动物。所有仔猪每天观察临床表征。[0112]通过触诊监测局部反应，在接种当天开始并且在接种后每两天直到接种20天后。[0113]在接种当天和接种后3周，攻击前1天，攻击后1和2周以及尸检时，收集所有动物的血液样品。从每只动物取的血清样品用于抗PCV2和猪肺炎支原体抗体测试。在尸检期间，肠系膜和腹股沟淋巴结，扁桃体和肺被取样用于PCV2核酸定量。[0114]实验程序与根据上文实施例2所述相同。在接种时PCV2的IgM抗体应答低于所有组的检测水平(低于2.01og2)。接种3周后，对于2000AUPCV2/X-slove30疫苗的PVC抗体的滴度最高，8卩201(^2<^-8〇1￥612组，包括每剂量250-，500-和200(^1]?(^2抗原分别具有9，16和191og2的滴度。接受2000AU/X-sl〇Ve6疫苗的组具有151og2的滴度。每剂量包含500-，2000-和6000AUPCV2抗原的DF组分别具有8，14和161og2的滴度。对照具有低于检测水平的滴度。[0115]在这项研究中，全身和局部反应进行了评估。没有观察到归因于疫苗接种的全身反应。至于局部效应而言，不多于3头接种疫苗的动物（已经分别接受每剂量疫苗X-solve12500和2000AU，或DF6000AUPCV2)具有轻微运动的问题，与在对照动物中数目相同。为此，这些反应可合理地被认为是与疫苗接种不相关的。对于其他局部反应，用X-solve接种的许多动物（约60-100%之间）显示出局部反应，肿胀的平均尺寸是小于3厘米，即在1-2厘米之间，并且肿胀在2-6天内消失。使用DF，只有约30%的动物表现为局部肿胀，平均大小小于ο.5厘米，并且它们在一天内消失。[0116]在图7和8中，器官的病毒载量(平均)针对不同的疫苗进行描绘。似乎所有疫苗都能够实质上(在这些情况下至少3个数量级)降低在相关的器官中的病毒载量。[0117]在这项研究中似乎使用的所有佐剂均是安全的，诱导抗PCV2的IgM应答，并且能治疗动物对抗致病性猪圆环病毒2型的感染。在不同抗原之间没有发现负干扰。劳森菌血清学(未显示）显示出良好的抗体应答，在此基础上可以相信获得了抗胞内劳森菌感染的保护。为了证实这一点，进行包括使用致病性胞内劳森菌攻击的下一个实验(见实施例6)。[0118]实施例6[0119]为了证实动物被保护抗胞内劳森菌的攻击，具有不同数量佐剂X-solve的疫苗制剂，如实施例5中所描述的，被新鲜配制用于各种攻击实验。这些疫苗的基础是含有PCV20RF2蛋白质的PCV2疫苗。第一疫苗被配制在如实施例5所示的X-solve30中。第二疫苗被配制在X-solve12中，其中劳森菌抗原是通过在施用前30分钟内添加冷冻干燥的灭活劳森菌细胞(实施例5所用的相同抗原)到即用的PCV2疫苗中而引入。在这两个疫苗中PCV20RF2蛋白质的最终浓度为2000AU/0.2毫升。劳森菌抗原的浓度与用于实施例5中所述实验相同（每〇.2毫升约1X109细胞）。所得疫苗如下：[0120]1:2000AUPCV2/劳森菌/X-solve30[0121]2:2000AUPCV2/劳森菌/X-solve12[0122]使用疫苗1号(X-solve30)进行第一项研究。使用39头猪，分别分配为19头和20头猪的2组。两组在3周龄时用0.2ml疫苗通过如实施例1中所示在颈部皮内接种而免疫接种。第一组用上文所述的疫苗1号接种，第二组用没有劳森菌抗原的相同疫苗接种。这个组作为劳森菌攻击的对照。所有动物均在22周龄被攻击。未发现不可接受的安全问题。关于平均日增重(在攻击后14-21天期间），回肠评分(攻击后3周；，得分与内劳森感染存在导致的回肠病变的存在成比例）和PPE发病率的结果显示在表3中。统计学差异值(双侧检验，p<0.05;用于ADWG的协方差分析测试，用于回肠评分累积logit模型和用于PPE发病率的Fischer's精确检验)都是用星号表示的。[0123]表3[0125]使用疫苗2号(X-solve12)进行第二项研究。使用50头猪，分为2组，每组25头猪。一组在3周龄时用上文指示的2号疫苗接种，通过如实施例1中所示用0.2ml疫苗该在颈部皮内接种。第二组未被接种并且作为对照。所有动物均在24周龄被攻击。关于平均日增重(在攻击后13-20天期间），回肠评分(攻击后3周;得分与内劳森感染存在导致的回肠病变的存在成比例）和PPE发病率的结果显示在表4中。统计学差异值(双侧检验，p<0.05;用于ADWG的协方差分析测试，用于回肠评分的累积logit模型和对PPE发病率的Fischer's精确检验）都是用星号表示的。在测试期间，由于特定的，非疫苗相关的问题，每一组中的1个试验动物不得不被安乐死。[0126]表4[0128]结果表明，用包含PCV20RF2蛋白和灭活胞内劳森菌细菌的组合疫苗的动物皮内接种提供了对抗致病性胞内劳森菌感染的保护。此外，在配制前劳森菌抗原的冻干似乎对效力没有负面影响。【主权项】1.包含灭活全细胞胞内劳森菌细菌和猪圆环病毒2型（PCV2)0RF2蛋白质组合的疫苗，用于通过所述疫苗的皮内施用而保护猪对抗胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)和PCV2的感染的用途。2.用于根据权利要求1中用途的疫苗，其特征在于所述应用是在单次注射施用后用于猪的保护。3.用于根据前述任一项权利要求中用途的疫苗，其特征在于所述疫苗包含佐剂。4.用于根据权利要求3中用途的疫苗，其特征在于所述佐剂包括非生物可降解的油。5.用于根据前述任一项权利要求中用途的疫苗，其特征在于所述疫苗进一步包含灭活的猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)(Mhyo)抗原。6.用于根据权利要求5中用途的疫苗，其特征在于所述灭活的猪肺炎支原体抗原包括Mhyo菌苗。7.用于根据前述任一项权利要求中用途的疫苗，其特征在于所述疫苗包含每剂量IX1〇9灭活的胞内劳森菌细菌。8.用于根据前述任一项权利要求中用途的疫苗，其特征在于所述胞内劳森菌细菌是在添加细菌到组合物中以构成疫苗之前是冷冻干燥的。9.保护猪对抗胞内劳森菌细菌和PCV2感染的方法，包括施用包含灭活全细胞胞内劳森菌细菌和猪圆环病毒2型(PCV2)0RF2蛋白质组合的疫苗到动物真皮内。10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述方法在疫苗单次注射施用后会导致保护。11.一种构建用于皮内施用疫苗的方法，其特征在于所述方法包括组合灭活全细胞胞内劳森菌细菌和猪圆环病毒2型(PCV2)0RF2蛋白质与药学上可接受的载体。12.根据权利要求11的方法，其特征在于灭活的全细胞胞内劳森菌细菌是冷冻干燥的形式，并且加入到包含载体和PCV20RF2蛋白质的液体制剂中。【文档编号】A61P31/04GK105848676SQ201480066508【公开日】2016年8月10日【申请日】2014年12月2日【发明人】A·A·C·贾科布斯,V·发钦格,M·斯诺,M·H·维特韦里伊特【申请人】英特维特国际股份有限公司