专利名称：一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特征，病猪主要表现生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。自1991年在加拿大猪群中爆发PMWS以来，PMWS已给全世界养猪业造成极大的经济损失。PCV2不但可以引发断奶仔猪多系统的衰竭，还能够使感染猪的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，引起继发感染，加重病情。此外，PCV2还与母猪繁殖障碍、增生性坏死性肺炎、猪皮炎肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征等病症相关。近年来，我国猪群也有PMWS流行，所造成的危害十分严重。
疫苗免疫是控制PCV2感染及其相关疾病的重要手段。目前，国内生产的疫苗为全病毒灭活疫苗，如文献CN10124(^64A公开了一种全病毒灭活疫苗，但PCV2在体外细胞内增殖能力弱，培养难度较大，病毒最终滴度低，提供的病毒抗原含量有限，制备高质量PCV2疫苗需要浓缩病毒抗原，这将直接导致疫苗生产成本高昂，不能满足动物疫苗质优价廉的实际要求。文献CN101180406A、CN101884787A和CN101358182A均公开了用重组杆状病毒表达PCV20RF2基因编码的Cap蛋白，并将其用于制备PCV2疫苗，其中，所描述的重组杆状病毒都只含有一个启动子，且未优化其生产工艺条件，致使生产获得的病毒蛋白产率及质量均较低，且所表达的目的基因有其它多余序列(如6XHis标签、分泌性信号肽等)的修饰， 不利于表达的外源蛋白形成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)，这些重组杆状病毒构建技术策略存在表达的目的蛋白免疫原性部分丧失的缺陷。此外，由于该亚单位疫苗的佐剂和免疫刺激物等因素影响，其实践中的免疫效果并不佳。因此，急需研制一种产率更高、免疫原性及免疫效果更佳的PCV2亚单位疫苗及其制备方法和其所制备的疫苗组合物。发明内容
本发明的目的在于提供一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在 pFastBacDual转移载体的PlO启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2是完整的、 未经修饰的PCMb 0RF2。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
在本发明的一个优选技术方案中，所述PCV2Cap蛋白编码基因0RF2分别通过BamH I/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。
在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dual-20RF2o
本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤
(1)获得本发明所述的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual_20RF2 ；
(2)同源重组，产生重组杆状病毒DNA ；
(3)包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DHlOBac中，产生重组杆状病毒DNA。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的包装是将步骤( 产生的重组杆状病毒 DNA感染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。
本发明的另一目的在于提供一种重组杆状病毒，由本发明所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法制得。
在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒为rBac-20RF2。
本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤
(1)获得本发明制备的重组杆状病毒；
(2)培养宿主细胞，接种步骤(1)的重组杆状病毒；
(3)灭活病毒；
(4)分离纯化重组PCV2Cap蛋白；
(5)用纯化的重组PCV2Cap蛋白制备亚单位疫苗。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的步骤( 包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数(MOI)为0. 001-10的量接种步骤(1)所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。
在本发明的一个优选技术方案中，所述生物反应器的培养参数设定为pH 6. 0-6. 5，温度25-27°C，溶氧30-80%，搅拌速度100_180rpm，优选所述生物反应器的培养参数设定为PH 6. 2，温度27°C，溶氧50%，搅拌速度100_180rpm。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤( 包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过 5L-50L-500L培养体积逐级放大培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤( 采用批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤( 采用分批补料培养方法。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤C3)包括向细胞培养液中加入二乙烯亚胺(BEI)灭活剂灭活所述的重组杆状病毒，并可选的，在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤(4)包括收集步骤C3)灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞培养上清。
在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤(5)包括对步骤⑷纯化的重组 PCV2Cap蛋白进行定量，加入佐剂，制备疫苗。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗包括8 μ g/ml的纯化的重组 PCV2Cap蛋白和lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗还包括适量的防腐剂。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗还包括免疫刺激复合物。
在本发明的一个优选技术方案中，所述免疫刺激复合物的主要成分为Quil A皂苷、胆固醇和磷脂的复合物，其中，Quil A皂苷胆固醇磷脂的质量比为1 1 1。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的亚单位疫苗还包括适量的佐剂。
在本发明的一个优选技术方案中，所述佐剂选自水性佐剂、油性佐剂、纳米佐剂或缓释佐剂的任一种或其组合。
在本发明的一个优选技术方案中，每头份所述的亚单位疫苗包括不低于8 μ g/ ml的PCV2Cap蛋白，lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂，组成为50 μ g/ml Quil A皂苷、50 μ g/ml 胆固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激复合物，按疫苗最终体积计，含量不高于0. 01%的硫柳
本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，利用本发明所述重组杆状病毒制备得到。
本发明的另一目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，由本发明所述的制备方法制备得到。
在本发明的一个优选技术方案中，每头份所述的亚单位疫苗包括不低于8 μ g/ ml的PCV2Cap蛋白，lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂，组成为50 μ g/ml Quil A皂苷、50μ g/ml胆固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激复合物。
在本发明的一个优选技术方案中，每头份所述疫苗组合物的组成包括每头份所述的亚单位疫苗包括不低于8 μ g/ml的PCV2 Cap蛋白，lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂，组成为50 μ g/ml Quil A皂苷、50 μ g/ml胆固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激复合物，以及按疫苗最终体积计，含量不高于0. 01%的硫柳汞。
本发明的另一目的在于提供本发明所述的重组杆状病毒转移载体在制备PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗中的应用。
本发明的另一目的在于提供本发明所述的重组杆状病毒在制备PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗中的应用。
在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗用于预防由猪圆环病毒2型(PCV-2)感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。
为了清楚表述本发明的保护范围，本发明对下述术语进行如下界定
本发明所述的免疫刺激复合物其主要成分为Quil A皂苷、胆固醇和磷脂的复合物，其中，Quil A皂苷胆固醇磷脂的质量比为1 1 1，该复合物能形成一种具有较高活性的脂质小泡，又是一种全新的抗原递呈系统，对机体有免疫增强作用，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可产生“全面”免疫应答的效力，并长期增强特异性抗体应答。
本发明所述的“每头份”是指每头猪每次免疫的剂量。6
除非另有说明，本发明所述的百分比为液体与液体之间的百分比时为体积/体积百分比，当百分比为液体与固体之间的百分比时为体积/重量百分比，当百分比为固体与液体之间的百分比时为重量/体积百分比，其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述优点
1、经试验验证，本发明采用中国流行的PCV2b亚型的编码Cap蛋白的基因序列可针对性地用于预防中国流行的猪圆环病毒病；
2、本发明所述重组杆状病毒含有双启动子(多角体蛋白启动子和PlO启动子)，可表达双拷贝的Cap蛋白编码基因，显著提高了蛋白的表达效率；并且，插入的外源基因所表达的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒样颗粒(VLPs)，提高了表达蛋白的免疫原性， 且生产的抗原含量高；
3、本发明的制备方法利用生物反应器、大规模无血清悬浮培养sf9昆虫细胞，并将其用于制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗，显著提高了猪圆环病毒2型亚单位疫苗的病毒蛋白产率及质量，所制得的疫苗组合物具有免疫效果稳定、持久、安全性高等优点；
4、本发明制备的猪圆环病毒2型亚单位疫苗具有良好的安全性和免疫效力，能够对猪抵抗圆环病毒2型感染提供良好的免疫保护；
5、本发明提供的应用生物反应器猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，具有设备占地面积小、生产规模大、生产效率高，并可实现生产自动化控制和工业化生产等优点。
图1本发明的重组杆状病毒转移载体构建流程图。
图2本发明的重组杆状病毒构建流程图。
图3单拷贝、双拷贝重组kicmid PCR鉴定图。
图4本发明的PCV2亚单位疫苗制备工艺流程图。
图5本发明表达的Cap蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)电镜图片。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
实施例1重组杆状病毒的构建
使用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒，根据GENBANK公布的基因序列(NCBI登陆号EU340257. 1)设计以下引物
PlTCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG
P2 GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
P3 TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG
P4 GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
以PCV2b株病毒0RF2序列为模板(该模板根据已公布的PCV2b 0RF2序列登陆号 EU340257. 1合成获得)，Pl，P2扩增PCV2 0RF2基因，并将该基因克隆入pMD_19T载体中， 获得重组载体PMD-19T-0RF2-1，以PCWb株病毒0RF2序列为模板，P3，P4扩增PCV2 0RF2 基因，并将该基因克隆入PMD-19T载体中，获得重组载体pMD-19T-0RF2-2。
通过BamH I和Hind III双酶切pMD-19T-0RF2_l，将0RF2基因克隆入转移载体pFastBac Dual中，构建载体pFastBac Dual_0RF2 ；通过Kpn I和Xho I双酶切 PMD-19T-0RF2-2,将0RF2基因克隆入转移载体pFastBac Dual_0RF2中，构建包含双拷贝0RF2基因的重组转移载体pFastBac Dual-20RF2,将该重组转移载体转化大肠杆菌 DHlOBac，获得插入双拷贝0RF2基因的重组质粒l3acmid-20RF2 (PUC M13F/R引物鉴定 bacmid结果见图3A)，将该重组质粒bacmid-20RF2转染入昆虫细胞Sf9中，获得重组杆状病毒rBac-20RF2 (0RF2序列如SEQ ID NO 1所述)，扩增重组杆状病毒rBac_20RF2作为种毒备用。将重组转移载体pFastBac Dual_0RF2转化大肠杆菌DHlOBac，获得插入单拷贝 0RF2基因的重组质粒bacmid-0RF2，将该重组质粒l3acmid-ORF2转染入昆虫细胞Sf9中，获得重组杆状病毒rBac-0RF2 (0RF2序列如SEQ ID NO 1所述)，扩增重组杆状病毒rBac_0RF2 备用(PUC M13F/R引物鉴定bacmid结果见图3B)。
实施例2昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及Cap蛋白的表达定量
在IOOOml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3_4天，待浓度长到3_5X 106cellS/ml， 活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8X105cells/ml。当细胞浓度达到3-5X106cells/ml时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为 3-5X106Cells/ml，接种至IJ 500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-8X 106cells/ml时，接种重组病毒rBac-20RF2或rBac-0RF2，感染复数(MOI)为0. 001-10，反应器培养条件为pH 6. 0-6. 5、温度25-27°C、溶氧30-80%、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件， 优选的PH 6.2、细胞培养阶段温度设定271、溶氧50(%、搅拌速度100-180印111。在感染之后继续培养5-9天后，加入终浓度为5mmol/L的BEI，37°C作用24h后，加lmol/L Na2S2O3至终浓度5mmol/L终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8°C保存疫苗原液。
制备的疫苗抗原中所含的Cap蛋白通过ELISA定量检测。用包被缓冲液稀释纯化的捕获抗体兔抗PCV2-Cap蛋白多抗至合适浓度，每孔100μ 1，4°C过夜，PBST洗涤三次，BSA封闭1小时。加入不同浓度的抗原标准品(通过CsCl密度梯度离心纯化的形成病毒样颗粒VLPs的Cap蛋白)和梯度稀释待检样品，37°C孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测抗体-抗PCV2Cap蛋白的单克隆抗体，37°C孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H2SO4终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中Cap蛋白的量。
使用三种不同M0I(0.01、0. 1、1)接种两种不同的病毒，分别于接种后7_11天取样定量分析培养上清中的目的蛋白含量，结果见表1。
表1不同感染复数接种两种病毒蛋白表达量(μ g/ml)分析
权利要求
1.一种重组杆状病毒转移载体，所述载体是分别在PFastBac Dual转移载体的PlO启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2Cap蛋白编码基因 0RF2，优选所述的PCV2 Cap蛋白编码基因0RF2是完整的、未经修饰的PCV2b 0RF2，更优选所述PCV2 Cap蛋白编码基因0RF2分别通过BamH I/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入 pFastBac Dual转移载体中。
2.如权利要求1所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
3.如权利要求1-2任一项所述的重组杆状病毒转移载体，其特征在于，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBac Dual_20RF2。
4.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗生产用毒株的制备方法，包括如下步骤(1)获得如权利要求1-5任一项所述的重组杆状病毒转移载体；(2)同源重组，产生重组杆状病毒DNA;(3)包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的同源重组是将步骤(1) 所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DHlOBac 中，产生重组杆状病毒DNA。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的包装是将步骤(2) 产生的重组杆状病毒DNA转染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。
7.—种重组杆状病毒，由权利要求4-6任一项所述的方法制备得到，优选所述重组杆状病毒为rBac-20RF2o
8.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤(1)获得权利要求9所述的重组杆状病毒；(2)培养宿主细胞，接种步骤(1)的重组杆状病毒；(3)灭活病毒；(4)分离纯化重组PCV2Cap蛋白；(5)用纯化的重组PCV2Cap蛋白制备亚单位疫苗。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养Sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数(MOI)为0. 001-10的量接种步骤 (1)所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2 Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，生物反应器的培养参数设定为pH 6. 0-6. 5、温度25-27°C、溶氧30-80%、搅拌速度100_180rpm，优选生物反应器的培养参数设定为PH 6. 2，温度27°C，溶氧50%，搅拌速度100_180rpm。
11.如权利要求8-10任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤( 包括将细胞经过 5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者， 将细胞经过5L-50L-500L培养体积逐级放大的培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。
12.如权利要求8-11任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤( 采用批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合进行培养，优选为分批补料培养方法进行培养。
13.如权利要求8-12任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C3)包括向细胞培养液中加入BEI灭活剂灭活所述的重组杆状病毒，并在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。
14.如权利要求8-13任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)包括收集步骤(3)灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞培养上清。
15.如权利要求8-14任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤( 包括对步骤(4)纯化的重组PCV2Cap蛋白进行定量，加入佐剂，制备疫苗。
16.如权利要求8-15任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的亚单位疫苗包括 8 μ g/ml的纯化的重组PCV2 Cap蛋白、lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂，优选所述的亚单位疫苗还包括适量的防腐剂。
17.如权利要求8-16任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的亚单位疫苗还包括免疫刺激复合物，优选所述免疫刺激复合物为Quil A皂苷、胆固醇和磷脂的复合物，其中， Quil A皂苷胆固醇磷脂的质量比为1 1 1，优选所述的亚单位疫苗还包括适量的佐剂，更优选所述佐剂选自水性佐剂、油性佐剂、纳米佐剂或缓释佐剂的任一种或其组合。
18.如权利要求8-17任一项所述的制备方法，其特征在于，每头份所述的亚单位疫苗包括8 μ g/ml的PCV2 Cap蛋白、lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂、组成为50 μ g/ml的Quil A皂苷、50 μ g/ml胆固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激复合物；优选每头份所述的亚单位疫苗包括8 μ g/ml的PCV2 Cap蛋白、lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂、组成为50 μ g/ml的Quil A皂苷、50 μ g/ml胆固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激复合物，以及按疫苗最终体积计算不高于 0.01%的硫柳汞。
19.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，利用权利要求7所述重组杆状病毒制得，或者如权利要求8-18任一项所述的方法制备得到。
20.如权利要求19所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗，其特征在于，每头份所述疫苗组合物的组成包括，8 μ g/ml的PCV2 Cap蛋白、lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂、组成为50 μ g/ml 的Quil A皂苷、50 μ g/ml胆固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激复合物；优选每头份所述疫苗组合物的组成包括8 μ g/ml的PCV2 Cap蛋白、lmg/ml的氢氧化铝胶佐剂、组成为50 μ g/ ml的Quil A皂苷、50 μ g/ml胆固醇和50 μ g/ml磷脂的免疫刺激复合物，以及按疫苗最终体积计算不高于0. 01%的硫柳汞。
21.权利要求1-3任一项所述的重组杆状病毒转移载体或者权利要求7所述重组杆状病毒在制备PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗中的应用。
22.如权利要求21所述的应用，所述的PCV2重组Cap蛋白或PCV2亚单位疫苗用于预防由猪圆环病毒2型感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。
全文摘要
本发明涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用，所述重组杆状病毒含有双启动子(多角体蛋白启动子和P10启动子)，可表达双拷贝的Cap蛋白编码基因，显著提高了蛋白的表达效率；并且，插入的外源基因所表达的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒样颗粒(VLPs)，提高了表达蛋白的免疫原性，且生产的抗原含量高；本发明的猪圆环病毒2型亚单位疫苗，显著提高了猪圆环病毒2型亚单位疫苗的病毒蛋白产率及质量，所制得的疫苗组合物具有免疫效果稳定、持久、安全性高等优点。
文档编号A61P31/20GK102517331SQ201110440750
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者刘洁, 吴玉石, 廖园园, 张萍, 朱薇, 李伟, 温文生, 漆世华, 熊媛媛, 王桢桢, 秦红刚, 谢红玲, 靖志强, 韩兴 申请人:武汉中博生物股份有限公司