专利名称：生物活性肽修饰的纳米银及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤纳米药物及其制备方法和用途，且更具体而言，涉及一种生物活性肽修饰的纳米银及其制备方法和用途。本发明的生物活性肽修饰的纳米银是一种可对多药耐药性肿瘤具有高效细胞毒作用的纳米药物。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病。据报道，我国每年癌症发病人数约260万，死亡人数约180万，过去30年中国癌症死亡率增加了 80%，成为中国城市和农村居民的第一位死因。尽管人们为治疗癌症尝试了诸多方法，但依然没有取得重大突破。目前，由于化疗药物的广泛使用，更是造成了很多肿瘤细胞的多药耐药性，使得癌症这一难题更难攻克。近年来，银作为生物安全性高、稳定性好的材料引起广泛关注，纳米材料因其独特的量子效应、小尺寸效应以及比较大的比表面积表现出很多特有的性质，引起人们广泛的研究兴趣。近年来，人们越来越多的把目光放在纳米材料的性质及应用上，纳米银(AgNP)的生理活性作用也引起了人们的高度注意。在已报道的文献中，人们发现AgNP不但具有明显的抗菌活性，还有抗病毒、抗肿瘤等生物活性。如=Gopinath等报道了 AgNP可以使细胞内的线粒体膜通透性发生改变，从而促进肿瘤细胞的凋亡；Verma等也发现AgNP具有较好的抗癌活性；Youngs等报道了 AgNP对乳腺癌细胞的抑制杀伤作用。但是AgNP作为一种刚性的无机纳米材料较难进入细胞，令其治疗应用受到较大的限制。穿膜肽是一段富含精氨酸的生物活性多肽，体内体外实验都验证了不同种类的穿膜肽具有良好的快速穿膜进入细胞的作用。穿膜肽还可以与生物大分子和纳米粒子通过化学偶联的方法结合从而促进它们进入细胞和动物的组织，同时并不影响所携带蛋白质的生物活性。穿膜肽(细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)),是一类小于30个氨基酸的多肽，它们可以以能量依赖的方式进入细胞。这类肽在文献报道中有不同的名称，例如膜移位序列(membrane translocation sequence,MTS)是另一种常用来描述这些多肽穿细胞膜能力的名称。CPPs来源于某些蛋白质的蛋白转导域(protein transduction domains,PTD)部分，顾名思义，这段结构域在蛋白质中起转导作用，CPPs又被称为PTD。1988年，Green等人观察到人类获得性免疫缺陷病毒HIV-1中Tat蛋白能引起活细胞内化作用而产生穿膜作用，随后发现了一段86个氨基酸长度的活性片段Tat-86。几年之后有文献报道果蝇的触角足蛋白中60个氨基酸的同源结构域也能穿透细胞膜。为了研究清楚内化作用的驱动力，人们对同源结构域进行定点突变，发现第三个螺旋结构是穿膜所必需的，继而发现了这类穿膜蛋白的基本序列YGRKKRRQRRR。它是一段由11个氨基酸组成的富含精氨酸的多肽，是目前研究应用最为广泛的穿膜肽。因此我们首次提出这样一个新策略，即基于穿膜肽修饰技术来提高AgNP的穿越细胞的能力，从而增强AgNP对多药耐药肿瘤细胞的细胞毒作用。同时，由于纳米银的 纳米尺寸效应，它超出了多药耐药细胞膜药物外排转运蛋白的转运能力，令药物外排蛋白不能有效地将纳米银药物外排出细胞外，从而使纳米银药物在肿瘤细胞内维持有效的浓度，发挥杀灭肿瘤作用。
目前AgNP本身作为一个金属纳米材料，其对生物膜的穿透效果不是很好，因此只是单纯的用AgNP作为纳米药物，其入胞效果欠佳，从而不能很好发挥作用。将具有生物活性的穿膜肽连接在AgNP上后，可以在很大程度提高AgNP穿过生物膜进入细胞的效率，从而使AgNP的抗肿瘤效果得到较大程度的发挥。但是现有技术中，用生物活性多肽来修饰AgNP粒子还存在多肽与金属纳米材料难以直接进行表面修饰的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，发明人致力于研究通过对纳米银(AgNP)采用穿膜肽修饰技术从而得到的一种可对多药耐药性肿瘤具有高效细胞毒作用的纳米药物。本发明人发现，由于银-硫键(Ag-S)的形成比较容易实现，而且Ag-S在生理条件下比较稳定，因此，通过在具有生物活性的穿膜肽序列的末端引入一个半胱氨酸而得到一个巯基，再通过该巯基与纳米粒表面的银原子形成的Ag-S键，从而可得到稳定的生物活性肽修饰的纳米银偶联物。本申请的生物活性肽修饰的纳米银不仅实现了无机纳米材料AgNP穿过细胞膜的能力从而极大地提高其对多药耐药肿瘤细胞生长的抑制作用，而且为肿瘤治疗找到了一种新的潜在药物。因此，本发明的一个目的是提供一种生物活性肽修饰的纳米银，所述生物活性肽为含有疏基的穿I吴妝。本发明的另一个目的是提供一种制备所述生物活性肽修饰的纳米银的方法。本发明的又一个目的是提供一种药物组合物，其包含有效剂量范围的生物活性肽修饰的纳米银作为有效成分，并且优选地其可进一步含有药学上可接受的载体及辅料。本发明的再一个目的是提供生物活性肽修饰的纳米银在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。为实现上述目的，本发明提供了一种生物活性肽修饰的纳米银，其中，所述生物活性肽为含有巯基的穿膜肽，所述生物活性肽修饰的纳米银是使含有巯基的穿膜肽通过Ag-S键共价连接到AgNP的表面上而形成。本发明中，优选地，所述穿膜肽可以包括YGRKKRRQRRR(TAT)或者VSRRRRRRGGRRRR(LMWP)。本发明中，优选地，所述含有巯基的穿膜肽为通过化学修饰而含有巯基的穿膜肽。本发明中，优选地，所述化学修饰包括在所述穿膜肽序列的末端(即C端或N端)引入含有巯基的氨基酸，或者在所述穿膜肽的C端或N端引入带有巯基或可活化为巯基的基团且能够与所述穿膜肽发生缩合反应的化合物，从而可通过银-硫键与纳米银偶联。其中，所述含有巯基的氨基酸的实例包括半胱氨酸；所述含有巯基的氨基酸的数量可为I 3 ;所述带有巯基或可活化为巯基的基团且能够与所述穿膜肽发生缩合反应的化合物的实例可为3-(2-卩比唳二硫代)丙酸-N-琥拍酰亚胺酯(N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)-propionate)、2_ 亚氨氢氯化硫醇(2_Iminothiolanehydrochloride)或N-琥拍酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯(N-succinimidyl
S-acetylthioacetate)。 本发明中，优选地，所述化学修饰进一步包括在穿膜肽序列中引入保护穿膜功能的氨基酸。其中，所述保护穿膜功能的氨基酸种类可以不限制，本领域已知的氨基酸种类均可，如甘氨酸、赖氨酸或丝氨酸；所述保护穿膜功能的氨基酸的数量可为I 6 ;引入所述保护穿膜功能的氨基酸的位置可为在穿膜肽和含有巯基的氨基酸或者化合物之间。本发明中，优选地，所述含有巯基的穿膜肽的氨基酸序列可为:(SH)CGGGYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)。所述氨基酸序列为在穿膜肽TAT的11个氨基酸序列(YGRKKRRQRRR) (SEQ ID NO:2)的基础上多接了三个甘氨酸和一个半胱氨酸，此处所加的巯基是为了方便修饰连接至AgNP而在穿膜肽上通过肽键连接一个含有巯基的半胱氨酸，所述三个甘氨酸是为了保护TAT修饰到大分子上后原有的功能而加。本发明中，优选地，所述含有巯基的穿膜肽的氨基酸序列可为:(SH) VSRRRRRRGGRRRR (SEQ ID NO:3)。上述氨基酸序列中的巯基为穿膜肽LMWP (VSRRRRRRGGRRRR, SEQ ID NO:4)通过与带有巯基或可活化为巯基的基团的化合物发生缩合反应所得，化合物的实例可为3-(2-吡啶二硫代)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate)、2_ 亚氨氢氯化硫醇(2-1minothiolane hydrochloride)或N-琥拍酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯(N-succinimidyl S-acetylthioacetate)。由于具有生物活性的这一类穿膜肽都具有能够促进金属纳米材料穿过细胞膜的作用，因此本申请中所述的穿膜肽并不限于此，这是因为具有生物活性的这一类穿膜肽应该都具有提高AgNP穿过生物膜的作用。根据本发明的另一目的，提供了一种制备生物活性肽修饰的纳米银的方法，其中，所述生物活性肽为含有巯基的穿膜肽，该方法包括如下步骤:(a)在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中加入适量超纯水使PVP充分溶胀，再先后加入硝酸银溶液和NaBH4,搅拌以得到纳米银AgNP ；(b)在步骤(a)得到的AgNP中加入所述含有巯基的穿膜肽，37°C水浴中反应2 3h后取出，再分别进行透析和超滤离心以得到所述生物活性肽修饰的纳米银。其中，所述步骤(a)中，加入硝酸银溶液和NaBH4时，先慢慢滴加硝酸银溶液并搅拌15 50min，再快速注入NaBH4并快速搅拌60 80min。所述步骤(a)中，所述透析为采用截留分子量为12000的透析袋进行透析以除去溶液中游离的含有巯基的穿膜肽。所述步骤(a)中，所述超滤离心为采用截留分子量为10000的超滤管进行超滤离心从而浓缩。根据本发明的又一个目的，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效剂量范围的生物活性肽修饰的纳米银作为有效成分，并且优选地其可进一步含有药学上可接受的载体及辅料。根据本发明的再一个目的，本发明提供了生物活性肽修饰的纳米银在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。其中，所述肿瘤包括所有实体瘤，优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌等等，但不限于上述肿瘤。本发明提供的生物活性肽修饰的纳米银的治疗方法适应于所有实体瘤。本发明采用生物活性多肽表面修饰技术，在无机纳米银表面引入穿膜肽，由于穿膜肽可有效地介导无机纳米银穿透进入细胞内部，从而显著增强了其抗肿瘤的效果。我们的研究表明，由于纳米药物的尺度效应，可有效地避免耐药肿瘤细胞的药物外排作用，从而对耐药肿瘤仍维持高效抗肿瘤活性，因此该穿膜肽修饰的纳米银对耐药肿瘤具有显著的治疗作用，有希望成为新型的抗肿瘤新治疗手段及新型纳米药物。
图1为根据本发明一个实施方式中的AgNP-TAT的结构图。图2为根据本发明一个实施方式中的AgNP-TAT对抗P糖蛋白外排机制的尺寸效应机理图。图3为根据本发明一个实施方式中的AgNP和AgNP-TAT的紫外光谱图。图4为根据本发明一个实施方式中的AgNP和AgNP-TAT的粒径图。图5为根据本发明一个实施方式中的AgNP和AgNP-TAT的电位图。图6为根据本发明一个实施方式中的AgNP的TEM (透射电子显微镜)图。图7为根据本发明一个实施方式中的AgNP-TAT的TEM图。图8为根据本发明一个实施方式中的AgNP和AgNP-TAT的温谱图。图9为根据本发明一个实施方式中的不同浓度的AgNP和AgNP-TAT对B16、Hela、MCF-7和MCF-7/ADR细胞增殖的半数抑制率的图。图10为根据本发明一个实施方式中的B16细胞的时间依赖性抑制率图。图11为根据本发明一个实施方式中的各组的肿瘤照片，从上到下依次为:空白对照组:生理盐水，AgNP-TAT 组(c = 363 μ M(单位换算后 C = 0.2mg/kg/d)), AgNP-TAT 组(c = 1818 μ Μ(单位换算后 c = l.0mg/kg/d)), AgNP-TAT 组(c = 3636 μ Μ(单位换算后c = 2.0mg/kg/d))，ADR 组(c = 688.65 μ M(单位换算后 c = l.5mg/kg/d))，ADR 组(c =1239.58 μ M(单位换算后 c = 2.5mg/kg/d))。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。制备实施例实施例1穿膜肽TAT修饰的纳米银(AgNP-TAT纳米粒)的合成及表征(I)纳米银的合成在25ml的圆底烧瓶中加入200mg聚乙烯吡咯烷酮K_30 (PVP，购自国药集团化学试剂有限公司)和5-10ml超纯水，常温下搅拌30min，使PVP充分溶胀。然后慢慢滴加0.006mol/l的硝酸银(购自国药集团化学试剂有限公司)溶液l_2ml搅拌30min,快速注入0.008mol/l新配制的NaBH4 (购自国药集团化学试剂有限公司)5_8ml,快速搅拌60min以得到纳米银(AgNP)。(2)纳米银的修饰取上述制备好的AgNP 2ml注入到5ml的EP管里,加入2_4mg/ml的含有巯基的穿膜肽TAT ((SH) CGGGYGRKKRRQRRR，采用本领域中公知的标准的固相合成法通过固相合成所得，即在已知的11个氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)的基础上多接了三个甘氨酸和一个半胱氨酸。)lml，将两溶液混合均匀， 37°C水浴中反应2.5h后取出。用截留分子量为12000的透析袋透析去除溶液中游离的TAT，用截留分子量为10000的超滤管超滤离心对其进行浓缩，从而得到AgNP-TAT纳米粒(结构如图1所示)。(3) AgNP-TAT纳米粒的表征用UV-2450分光光度计(日本岛津)对相同浓度的AgNP和AgNP-TAT的UV吸收光谱进行扫描，扫描的波长范围200-1000nm。用MALVERN ZELA SIZER N 粒度仪分析仪(型号 ZEN3690，Malvern, UK)对 AgNP 和AgNP-TAT的粒径及电位进行测定分析。用JEM-200CX透射电子显微镜(日本日立公司)对AgNP和AgNP-TAT的形貌及均匀性进行分析。用NETZSCH TG 209 F3热重分析仪(NETZSCH)对AgNP和AgNP-TAT进行热重分析。热重分析的温度范围是30°C 400°C，上升速率是10°C /min。检测结果:用UV-2450紫外分光光度计对AgNP和AgNP-TAT在200 800nm范围内进行光谱扫描结果见图3。纳米银形成过程包括成核和长大两个过程，两者的相对速率决定了纳米银溶胶的粒径分布状况。一般情况银纳米粒产生等离子共振的区域在380 400nm。本实施例中AgNP的最大吸收波长为394nm，符合纳米银的最大吸收波长的范围，经穿膜肽TAT修饰后的AgNP (AgNP-TAT)的吸收峰基本没有红移，表明纳米粒的性质基本上没有变化。用MALVERN Z ELA SIZER N粒度仪分析仪对AgNP和AgNP-TAT的粒径及电位进行测定分析。测得AgNP的粒径在8 10nm，连接上穿膜肽TAT后粒径基本没有多大的变化(图4)。测得的电位为-1OmV左右，连接TAT后电位在23 25mV(图5)。由于穿膜肽TAT带有较强的正电荷，所以由纳米粒电位的变化可以证明在AgNP上连接上了 TAT。本实施例中使用的TAT的末端有一个巯基，巯基很容易与AgNP的表面结合生成Ag-S键，进一步推断AgNP与TAT发生了共价连接。用JEM-200CX透射电子显微镜对AgNP及AgNP-TAT的形貌及均匀性进行分析(图
6、图7)。TEM图6显示AgNP的形状多为球形，粒径在IOnm左右，粒子大小比较均一，说明AgNP形成过程中各粒子晶核的长大及稳定性比较平衡。图7为修饰过的AgNP的图片，图中粒子多为规整的球形，且粒径上没有多大的变化。用NETZSCH TG 209F3热重分析仪对AgNP及AgNP-TAT进行热重分析，从而对连接在AgNP上的TAT做进一步的定量分析。图8为AgNP和AgNP-TAT在30°C 400°C温度范围内的温谱图。做TGA (热重分析)时使用的AgNP及合成AgNP-TAT时使用的AgNP是同一批次的，并经过相同的处理过程冻干成固体。由图8可知，在温度上升至400°C时，AgNP的质量减少了 24.56%,AgNP-TAT的质量减少了 29.44%，两者质量变化的差值是由于AgNP-TAT表面的TAT引起的，因此可以进一步证明，TAT通过Ag-S键连接在了 AgNP的表面。实施例2低分子量鱼精蛋白(LMWP)穿膜肽修饰的纳米银(AgNP-LMWP)的合成(I)纳米银的制备如实施例1所述。(2)低分子量鱼精蛋白(LMWP)穿膜肽修饰纳米银取上述制备好的AgNP 2ml注入到5ml的EP管里,加入2_4mg/ml的含有巯基的穿膜肽LMWP ((SH) VSRRRRRRGGRRRR) (SEQ ID NO:3) lml，该穿膜肽的制备即可采用本领域中公知的标准的固相合成法通过固相合成所得，也可以从鱼精蛋白(protamine)酶切得到该多肽序列，然后，通过与3- (2-吡啶二硫代)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯发生缩合反应并经二硫苏糖醇(二硫键还原试剂)活化而带有巯基。将两溶液混合均匀，37°C水浴中反应2.5h后取出。用截留分子量为12000的透析袋透析去除溶液中游离的LMWP，用截留分子量为10000的超滤管超滤离心对其进行浓缩，即得到AgNP-LMWP纳米粒。实验实施例实验例I1、MTT(2-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴蓝，商品名:噻唑蓝)法测定AgNP-TAT的体外抗肿瘤效应(I)浓度依赖性抑制实验将对数生长期的B16、Hela, MCF_7、MCF-7/ADR细胞(B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)购自中科院上海细胞库，HeLa (人系宫颈癌)细胞购自中科院上海细胞库，MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)购自中科院上海细胞库，MCF-7/ADR细胞(人乳腺癌耐药细胞)购自中科院上海细胞库)消化后稀释成密度为1.5 X IO4个细胞/ml的细胞悬液，转移到Corning的96细胞培养孔板中，每孔加入200 μ I细胞悬液，用含10%小牛血清的1640完全培养基培养24h (37°C，5 % CO2)。通过预实验确定最佳药物浓度范围，用阿霉素(ADR，购自大连美仑生物技术有限公司)作为阳性对照，加入不同浓度的制备实施例1制备的AgNP和AgNP-TAT，溶液每个浓度做6个复孔。为了排除TAT毒性的影响，同时设定TAT组，TAT的浓度为Img/ml，此浓度与AgNP表 面的TAT的最大理论值相近；为了排除药物的颜色干扰，同时设定相应不同浓度的空白对照(在96孔板中，不加细胞，其余操作与实验组一样，然后加入对应浓度的样品，以排除AgNP和AgNP-TAT自身颜色对实验结果产生的影响)。培养24小时，加入MTT(5mg/ml，购自美国Amresco公司)20 μ 1，培养4h，加DMSO 200 μ 1，震荡使结晶物充分溶解混匀。用酶标仪(型号:511 19300 FI, Fisher)测定各组OD值，主波长为570nm，参考波长为490nm。计算各组的细胞增殖抑制率，并按照下述公式计算不同药物的半数抑制率(IC50):(半数抑制率没有具体的计算公式，增殖抑制率为50%时的浓度即为此药物的半数抑制率。)增殖抑制率=(对照组-实验组)/对照组X 100 %。(2)时间依赖性抑制实验将对数生长期的B16细胞消化后稀释成密度为1.5 X IO4个细胞/ml的细胞悬液，转移到Corning的96孔细胞培养板中，每孔加入200 μ I细胞悬液，用含10%小牛血清的1640完全培养基培养24h(37°C，5% CO2)。根据预实验结果分别加入制备实施例1制备的AgNP和AgNP-TAT的溶液及新鲜的完全1640培养基，使AgNP和AgNP-TAT的最终浓度为80 μ mol/1，用最终浓度为61.2 μ M的阿霉素溶液做阳性对照，分别在0.5h、lh、3h、5h、7h、24h用MTT法测定不同药物对B16细胞的增殖抑制作用。测定方法同浓度依赖性抑制实验。每个时间点做6个复孔，并设定不同时间点的空白对照。2、AgNP-TAT的体内抗肿瘤实验(1)B16鼠源黑色素荷瘤裸鼠模型的建立将对数生长期的B16细胞经0.25 %胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备5X IO6个细胞/ml的细胞悬液。取18-22g的nu/nu雄性裸鼠(购自上海斯莱科实验动物有限公司)22只，在裸鼠背部皮下注射细胞悬液100 μ I/只。观察Β16细胞在裸鼠体内的生长和成瘤情况。(2)荷瘤裸鼠AgNP抗肿瘤效应当肿瘤体积为IOOmm3左右时将其随机分成6组:生理盐水组、AgNP-TAT组(363.6 μ M(0.2mg/kg/d)、1818 μ M(1.0mg/kg/d) ,3636 μ M(2.0mg/kg/d))、阿霉素(ADR)组(688.65 μ M (1.5mg/kg/d) >1239.58 μ M (2.5mg/kg/d))。各组均使用瘤周注射方式给药,每次给药量为100 μ I/只，每日一次，给药至最大肿瘤的任意方向瘤径超过2厘米(IACUC^l定的动物福利标准)时停止给药。给药期间每天测定瘤的长径(L)、短径(S)，计算肿瘤体积:V = LXS2/2。给药10天后，将裸鼠脱臼处死，取下肿瘤，小心去除瘤表明的血迹及包膜，称重，按照下述公式计算抑瘤率:抑瘤率(%) = (1-T/C) X 100%其中，T:治疗组平均瘤重；C:阴性对照组平均瘤重。3、结果与讨论(I)MTT法测定纳米银的体外抗肿瘤效应在浓度依赖性抑制实验中，非耐药细胞阳性对照组ADR的浓度梯度为:
0.184μ M 91.82 μ M，耐药细胞阳性对照组ADR的浓度梯度为:18.4μ M 367.28 μ M0所有细胞中加入的AgNP及AgNP-TAT的浓度是一致的，AgNP的浓度梯度为:5 200 μ M ;AgNP-TAT的浓度梯度为:5 200 μ M。AgNP和AgNP-TAT的浓度通过Ρ-4010电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP，日本日立公司)测定。四种细胞分别加入相同浓度的AgNP和AgNP-TAT。实验结果显示TAT组对细胞的增殖几乎没有抑制作用。根据不同浓度对细胞增殖的抑制率计算半数抑制率(IC5tl),绘制不同种类细胞的半数抑制率图表，如图9。结果显示，AgNP-TAT组的半数抑制率浓度比AgNP组都要小，数据统计得AgNP-TAT对B16、Hela,MCF-7、MCF-7/ADR四种细胞的增殖抑制作用比AgNP提高的倍数依次是:4倍、23.7倍、9倍、
7.3倍，由此可证明对AgNP进行修饰连接穿膜肽后，明显增强了纳米银的体外抗肿瘤活性。表I是各实验药品对MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞的IC50。由表中数据可以看出各药品对MCF-7/ADR的IC50值均大于MCF-7，ADR溶液对MCF-7/ADR的IC50比对MCF-7的IC50大了 28.6倍，但是相同浓度的AgNP-TAT对MCF-7/ADR的IC50比对MCF-7的IC50只高了 1.5倍，说明耐药细胞MCF-7/ADR对AgNP-TAT的敏感性比阿霉素要高很多。这表明由于纳米银的纳米尺度效应(其尺寸超出了耐药肿瘤细胞膜的药物外排转运蛋白的负载能力)，令药物外排蛋白不能将其有效地运转出胞外，从而滞留在胞内并维持有效的药物浓度，杀伤耐药肿瘤细胞。(图2)
表I
权利要求
1.一种生物活性肽修饰的纳米银，其中，所述生物活性肽为含有巯基的穿膜肽，所述生物活性肽修饰的纳米银是使含有巯基的穿膜肽通过Ag-S键共价连接到纳米银的表面上而形成。
2.根据权利要求1所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述穿膜肽包括YGRKKRRQRRR 或者 VSRRRRRRGGRRRR。
3.根据权利要求1或2所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述含有巯基的穿膜肽为通过化学修饰而含有巯基的穿膜肽。
4.根据权利要求3所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述化学修饰包括在所述穿膜肽序列的C端或N端引入含有巯基的氨基酸，或者在所述穿膜肽的C端或N端引入带有巯基或可活化为巯基的基团且能够与所述穿膜肽发生缩合反应的化合物。
5.根据权利要求4所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述含有巯基的氨基酸包括半胱氨酸。
6.根据权利要求4所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述含有巯基的氨基酸的数量为I 3。
7.根据权利要求4所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述通过化学反应连接带有巯基或可活化为巯基的基团且能够与所述穿膜肽发生缩合反应的化合物包括3-(2-吡啶二硫代)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯、2-亚氨氢氯化硫醇或N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯。
8.根据权利要求4所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述化学修饰进一步包括在所述穿膜肽序列中弓I入保护穿膜功能的氨基酸。
9.根据权利要求8所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述保护穿膜功能的氨基酸选自甘氨酸、赖氨 酸和丝氨酸中。
10.根据权利要求8所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述保护穿膜功能的氨基酸的数量为I 6。
11.根据权利要求8所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，引入所述保护穿膜功能的氨基酸的位置在穿膜肽和含有巯基的氨基酸或者化合物之间。
12.根据权利要求1所述的生物活性肽修饰的纳米银，其特征在于，所述含有巯基的穿膜肽的氨基酸序列为:(SH)CGGGYGRKKRRQRRR ;或者所述含有巯基的穿膜肽的氨基酸序列为:(SH)VSRRRRRRGGRRRRο
13.—种制备生物活性肽修饰的纳米银的方法，其中，所述生物活性肽为含有巯基的穿膜肽，该方法包括如下步骤: (a)在聚乙烯吡咯烷酮中加入适量超纯水使其充分溶胀，再先后加入硝酸银溶液和NaBH4，搅拌以得到纳米银； (b)在步骤(a)得到的纳米银中加入含有巯基的穿膜肽，37°C水浴中反应2 3h后取出，再分别进行透析和超滤离心以得到所述生物活性肽修饰的纳米银。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，加入硝酸银溶液和NaBH4时，先慢慢滴加硝酸银溶液并搅拌15 50min，再快速注入NaBH4并快速搅拌60 80mino
15.一种药物组合物，其包含有效剂量范围的权利要求1所述的生物活性肽修饰的纳米银作为有效成分，并且优选地其可进一步含有药学上可接受的载体及辅料。
16.权利要求1所述的生物活性肽修饰的纳米银在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括所有实体瘤。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌。
全文摘要
本发明涉及一种生物活性肽修饰的纳米银，其中，所述生物活性肽为含有巯基的穿膜肽，所述生物活性肽修饰的纳米银是使含有巯基的穿膜肽通过Ag-S键共价连接到AgNP的表面上而形成。本发明提供的生物活性肽修饰的纳米银不仅实现了无机纳米材料AgNP穿过细胞膜的能力从而极大地提高其对肿瘤细胞生长的抑制作用，而且为肿瘤治疗找到了一种新的潜在药物。
文档编号A61P35/00GK103169982SQ20111044071
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者黄永焯, 刘金华 申请人:中国科学院上海药物研究所