本发明涉及生物医药领域，侧重于多肽类化合物分子，具体涉及一种鱼精蛋白类似活性肽及其制备方法与应用。
背景技术：
：鱼精蛋白是一类从深海鱼的精巢内提取出来的多聚阳离子碱性蛋白，分子量主要分布在4000～10000道尔顿之间。鱼精蛋白的氨基酸组成中约有三分之二为碱性氨基酸，其等电点pi在10～12之间。自从1937年就已发现鱼精蛋白具有抑菌功效，其后不断地研究已将鱼精蛋白的应用推广到食品防腐、临床拮抗肝素中。鱼精蛋白作为多聚阳离子蛋白其抑菌机理主要涉及：鱼精蛋白与细菌外壁上的肽聚糖及细胞膜起反应，引起菌壁及胞膜的性质发生变异，从而使细菌外壁的结构遭到破坏，细菌形态发生改变，扰乱细菌的营养吸收、蛋白质合成及能量转化，最终导致细菌生长的抑制和死亡。报道显示，鱼精蛋白在中性和碱性介质中显示出很强的抑菌能力，并有较高的热稳定性，在210℃条件下加热1小时仍具有活性，同时抑菌范围和食品防腐范围均较广，它对枯草杆菌、芽孢杆菌、干酪乳杆菌、胚芽乳杆菌、乳酸菌、霉菌、芽抱耐热菌和革兰氏阳性菌等均有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌抑制效果不明显。虽然鱼精蛋白在常温及高温下表现出良好的热稳定性，在中性及碱性环境中也表现出良好的稳定性，作为天然防腐剂已广泛应用于食品工业中。但是由于鱼精蛋白具有以下缺陷，因此将其抑菌性能限制在仅能应用于生物体外：1.由于鱼精蛋白来源于不同种属的鱼精巢提取物，其分子量呈非均一弥散状特征，各种鱼精蛋白混杂，制备批次之间的质量难以恒定，作为药物存在不可控性；2.如此混杂的天然鱼精蛋白大分子容易产生过敏反应，存在用药安全性问题。鱼精蛋白在临床上作为拮抗肝素药物使用时，需要直接静脉注射，由于鱼精蛋白存在以上缺陷，使用时风险很大，会引起患者低血压、心动过缓、肺动脉高压、呼吸困难、器官衰竭，甚至导致死亡；但是鱼精蛋白是目前唯一能够用于治疗因注射肝素过量所引起的出血的药物，且无其他药品可替代，所以在给患者使用时需要十分谨慎，用药安全性过低。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种鱼精蛋白类似活性肽，其结构式为：(rn)2-kx，n为自然数；其中，r代表精氨酸；k代表赖氨酸，n为r的数目，x为空或能够与赖氨酸形成肽键的任意一个或多个氨基酸或化学基团。x为g，其结构式为：(rn)2-kg，g代表甘氨酸。n为5～9。当n＝5，x为g时，鱼精蛋白类似活性肽结构式为(rrrrr)2-kg，见式1：当n＝7，x为g时，鱼精蛋白类似活性肽结构式为(rrrrrrr)2-kg，见式2：当n＝9，x为g时，鱼精蛋白类似活性肽结构式为(rrrrrrrrr)2-kg，见式3：还包括所述鱼精蛋白类似活性肽与有机酸或无机酸形成的盐类化合物；所述的鱼精蛋白类似活性肽所带有的羟基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物；所述的鱼精蛋白类似活性肽所带有的巯基可形成但不限于所形成的硫醚、硫苷，或与半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫键的化合物；所述的鱼精蛋白类似活性肽所带有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物、烃化物、与糖类物质所形成的苷类物质等；所述的鱼精蛋白类似活性肽所带有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺类化合物等；所述的鱼精蛋白类似活性肽所带有的亚氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烃化物等；所述的鱼精蛋白类似活性肽所带有的酚羟基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙类化合物，与有机碱或无机碱所形成的盐类化合物；所述的鱼精蛋白类似活性肽与金属离子所形成的配合物、络和物或螯合物；所述的鱼精蛋白类似活性肽所形成的水合物或溶剂物。第二方面，本发明提供一种药物组合物，其含有上述的鱼精蛋白类似活性肽、其几何异构体、其药学上可接受的盐或溶剂化合物以及可药用载体或赋形剂的药物组合物。第三方面，本发明提供一种制备上述鱼精蛋白类似活性肽的方法，先把x固定在固相树脂上，得到x-固相树脂，对x-固相树脂进行fmoc脱保护，缩合1个fmoc-lys(dde)-oh，完成k-y-固相树脂肽骨架的制备；再对k-y-固相树脂肽骨架进行侧链氨基dde及fmoc脱保护，在k-y-固相树脂自由氨基上同步进行r的延伸引入，获得(rn)2kx-固相树脂；将合成完毕的(rn)2kx从固相树脂上裂解下来得到肽粗品，经过高效液相色谱纯化得到鱼精蛋白类似活性肽(rn)2kx。第三方面，本发明提供一种上述鱼精蛋白类似活性肽在制备粘膜清洗消毒药物中的应用。所述粘膜为动物或人的粘膜表面或粘膜腔或伤口创面；所述粘膜表面或粘膜腔如口腔、鼻咽腔、眼睛粘膜、肠粘膜、消化道、生殖道粘膜等。所述粘膜清洗消毒药物的剂型为呼吸道给药剂型、粘膜给药剂型或腔道给药剂型；如：所述粘膜给药剂型为滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂等；优选的，所述药物为液体或固体的(优选膏体)通过粘膜给药的药物；可选的，所述液体的通过粘膜给药的药物为滴鼻液、鼻喷剂、气雾剂、滴眼剂、洗眼液、阴道清洗剂、尿道清洗剂及创口清洗剂；可选的，所述固体的通过粘膜给药的药物为吸入剂、鼻喷剂、气雾剂、阴道栓剂、阴道凝胶、眼药膏或创口涂抹剂。本发明提供了一种鱼精蛋白类似活性肽及其制备方法与应用，该鱼精蛋白类似活性肽是人为设计，经过人工合成获得的非天然结构的多肽分子，它不同于现有技术采取生物提取获得的天然鱼精蛋白的混杂分子制剂，也不同于目前报道的利用人工合成方式制备获得的单链形式的鱼精蛋白模拟肽rn。本发明提供的鱼精蛋白类似肽以其更加稳定的化学性质可作为粘膜清洗消毒药物应用在人或动物的粘膜处，发挥抑菌效果，缓解和治疗人或动物外源致病微生物、物理或化学类物质造成的气雾、粉尘、颗粒对粘膜的损害及刺激；还可用于缓解和治疗人或动物粘膜表面或创面由于自身分泌物造成的损伤及刺激，有望成为粘膜清洗消毒药物，并广泛应用。用鱼精蛋白类似活性肽作为粘膜清洗消毒药物，可采用人工合成的方式大批量产业化制备、原料供应渠道稳定、工艺流程确定、质量标准恒定、产品质量批次之间无差异、产品产量可控。此外，鱼精蛋白类似活性肽分子序列及结构明确、分子量相对小、化学稳定性良好、不易产生致敏反应，使用安全性高。具体实施方式目前常用的消毒剂原料成份中的抗菌素、激素会对机体及环境造成药物残留，产生不良后果。消毒剂中的刺激性化学物质，如碘、氯、高锰酸钾、双氧水等化学物质也不适于接触娇嫩的粘膜。本发明中使用的鱼精蛋白类似活性肽是经过人为设计，通过人工合成，制备而成的非天然结构的肽分子。这种鱼精蛋白类似活性肽既具有鱼精蛋白的化学性质及功能，分子量可控，保持均一，不易产生过敏反应，使得鱼精蛋白类似活性肽有潜力成为粘膜清洗消毒药物的主要功效成分。哺乳动物的精蛋白与鱼精蛋白的分子性状、功能及所具有的缺陷均相同，哺乳动物的精蛋白在体内的使用安全性低，也无法将其抑菌性能发挥在人或动物体的体内。1963年美国洛克菲勒大学生物化学教授r.brucemerrifield开创性地发明了便利省时高效的多肽固相合成技术，使得人工合成多肽分子易于实施，为开展多肽研究及开发多肽药物提供了便利及可能，由于r.brucemerrifield教授建立的多肽固相合成技术对蛋白质多肽的研究具有里程碑意义因此荣获了1984年的诺贝尔化学奖。多肽固相合成的原理是将拟合成的肽链羧基端(c端)的氨基酸共价连接(固定)在不溶性树脂上，然后从被“固定”在树脂上的氨基酸的氨基端(n端)与目标肽链中的氨基酸羧基进行缩合连接，逐一缩合连接目标氨基酸达到延长肽链的目的。简而言之，固相合成肽链就是从多肽链的羧基端(c端)逐个向肽链的氨基端缩合连接氨基酸进行肽链的延长。因此在进行氨基酸的缩合反应时，要将有待连接的氨基酸上的氨基及侧链基团保护起来避免发生反应。目前常用的有叔丁氧羰基(boc)保护法和芴甲氧羰基(fmoc)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次脱保护的过程(即固相载体上的氨基先脱保护，再同过量的有待连接的下一个目标氨基酸的羧基发生缩合反应以延长肽链)。通过这样的步骤反复多次地进行下去，即：缩合、洗涤、脱保护、中和、洗涤，再进入下一轮缩合(接上一个目标氨基酸)，直至达到所需要合成的目标肽链长度。合成完成后采用tfa法将目的多肽从树脂上裂解下来，得到目的肽的粗品。目的肽的粗品还要经过纯化，纯化过程如下：采用色谱柱型号daisoc18(10μm,50x250mm)，色谱操作流动相a为(按体积百分含量，含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相b为乙腈与水的体积比为9:1的乙腈水溶液，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，获得目的肽纯品溶液。收集到的目的肽纯品溶液经过冷冻干燥呈白色絮状固体，即目的肽纯品，其纯度可达99％以上。目的肽纯品经密封包装后放入冰箱保存待用。本发明提到的鱼精蛋白类似活性肽是一种主要由精氨酸组成的多肽链，2分支非天然结构的多肽分子，其多肽分子式为(rn)2kg，其中r代表碱性氨基酸中的精氨酸(arg，r),n代表多聚精氨酸的数量，k代表赖氨酸(lys，k)，g代表甘氨酸(gly，g)。精氨酸的个数n为5～9，即(r5)2kg～(r9)2kg。(rn)2kg的表达式定义了鱼精蛋白类似活性肽是一个2分支含有10～18个精氨酸的多肽，可按照常规多肽固相合成的方法制备，因此在此不再赘述,固相合成采用fmoc-aa(boc)-oh进行肽链的延长，aa代表任意氨基酸。鱼精蛋白类似活性肽(r5)2kg～(r9)2kg的最大分子量为3014.59道尔顿，pi为13.33,净电荷为19。在(r5)2kg～(r9)2kg范围内随着精氨酸(arg,r)数量的增加提升了抑菌能力。(r9)2kg肽分子表现出良好的抑菌活性。多肽合成及纯化的原理和操作参考盛树力主编，科学技术文献出版社(1998年)出版的“多肽激素的当代理论和应用”中的第三章“多肽的化学合成和纯化”。本发明合成制备多肽化合物的方式可以参照以上固相合成方式，但并不局限于此合成方式。鼻咽腔是机体呼吸道的首要门户，在空气污染，沙尘暴、雾霾、流行病的环境中，鼻咽腔是最先接收及蓄积外源微生物(包括致病微生物)、烟尘颗粒，粉尘等异物的场所。女性阴道同样也是机体与外界相通的场所，易遭到外源致病微生物的侵扰。因此，需要及时清洗去除鼻咽腔、阴道接触蓄积的外源致病微生物、异源物质，此时就要使用粘膜清洗消毒药物对鼻咽腔、阴道进行清洗或消毒，使用鱼精蛋白类似活性肽作为粘膜清洗消毒药物不仅对机体粘膜无刺激、无毒副作用、还能维护机体健康，减少疾病发生，提高生活质量，具有重要意义。同理，也可使用鱼精蛋白类似活性肽作为粘膜清洗消毒药物及时清洗去除哺乳动物家畜及家禽鼻咽腔中接触蓄积的外源致病微生物、异源物质，对维护机体健康，预防疾病，提高生存率，提升经济效益同样具有重要意义。实验例一、鱼精蛋白类似活性肽对金黄色葡萄球菌的抑制作用金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)属于革兰氏阳性菌(g+)，是造成人类伤口化脓感染的最常见的病原菌，也是引起肠炎、肺炎、败血症、脓毒症的元凶。本实验通过检测鱼精蛋白类似活性肽对金黄色葡萄球菌的抑制率，体现鱼精蛋白类似活性肽的抑菌效果。lb培养液的配制：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l，加蒸馏水至1000ml，温和摇动直至内容物溶解，使用锡箔纸包裹瓶口，经高温高压灭菌后即可使用。1、分别称取以下2mg鱼精蛋白类似活性肽冻干粉样品：(r9)2kg，分子量3014.8,纯度>98％；(r8)2kg，分子量2702.21,纯度>98％；(r7)2kg，分子量2390.05,纯度>98％；(r6)2kg，分子量2077.47,纯度>98％；(r5)2kg，分子量1765.29,纯度>98％；将各种样品分别加入2ml的lb培养液中，配成1mg/ml的母液，编号#0；2、每种样品为一组，记为a组-e组，每组取无菌消毒培养管5个，分别加入1mllb培养液，编号#1、#2、#3、#4、#5；3、取1mla组中的母液(1mg/ml)加入a组#1培养管中混匀后,再取1mla组#1培养管中的肽溶液加入a组#2培养管中混匀,以此类推得到逐级对半稀释的肽溶液，其浓度见表1，b组-e组也进行相同操作：表1编号#0-#5培养管中肽溶液的鱼精蛋白类似活性肽浓度试管编号#0#1#2#3#4#5肽浓度/μg/ml100050025012562.531.254、接种环在酒精灯火焰上灼烧冷却后挑取少许金黄色葡萄球菌置于1ml生理盐水中混匀，得到菌液，分别吸取100μl菌液加入a组-e组的#0-#5各个培养管中得到培养液；5、37℃恒温培养箱培养24小时观察各培养液中的细菌生长情况(即抑制情况)，培养管中的培养液呈现浑浊的为细菌生长阳性(+)，培养液呈现清亮的为细菌生长阴性(-)；呈现细菌生长阴性的最小肽浓度即为肽分子最小抑菌浓度mic(minimuminhibitoryconcentration)，以(r5)2kg、(r7)2kg、(r9)2kg的结果为例，结果见表2。表2鱼精蛋白类似活性肽对金黄色葡萄球菌的检测结果肽浓度/μg/ml100050025012562.531.25(r5)2kg++----(r7)2kg+++---(r9)2kg++++--实验例二、鱼精蛋白类似活性肽对绿脓杆菌的抑制作用绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)属于革兰氏阴性菌(g-)，是临床上常见的造成烧伤创面、伤口感染化脓的主要病原菌，是引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、肺炎等疾病的主要致病菌。本实验通过检测鱼精蛋白类似活性肽对绿脓杆菌的抑制率，体现鱼精蛋白类似活性肽的抑菌效果。步骤1-3同实验例一；4、接种环在酒精灯火焰上灼烧后挑取少许绿脓杆菌置于1ml生理盐水中混匀，得到菌液，吸取100μl菌液加入a组-e组的#0-#5培养管中得到培养液；5、37℃恒温培养箱培养24小时观察各培养液中的细菌生长情况(即抑制情况)，培养液呈现浑浊的为细菌生长阳性(+)，培养液呈现清亮的为细菌生长阴性(-)；呈现细菌生长阴性的最小的肽浓度即为肽分子最小抑菌浓度mic(minimuminhibitoryconcentration)，以(r5)2kg、(r7)2kg、(r9)2kg的结果为例，结果见表3。表3鱼精蛋白类似活性肽对绿脓杆菌的检测结果肽浓度/μg/ml100050025012562.531.25(r5)2kg++----(r7)2kg+++---(r9)2kg++++--实验例一和实验例二抑菌结果显示，本发明涉及的非天然结构、人工合成的肽类抑菌分子——鱼精蛋白类似活性肽对引起临床粘膜创伤，伤口感染等的常见致病菌，革兰氏阳性菌(g+)金黄色葡萄球菌与革兰氏阴性菌(g-)绿脓杆菌均具有抑制作用，且其抑制作用随着分子量的增加而增强，因此鱼精蛋白类似活性肽有潜力成为清洗消毒类药物的有效成分。本发明的鱼精蛋白类似活性肽对金黄色葡萄球菌的抑菌mic与生化提取的天然来源的鱼精蛋白分子接近，对绿脓杆菌的抑菌mic比天然鱼精蛋白低几倍；且本发明的鱼精蛋白类似活性肽具有明确的分子结构及氨基酸序列、人工合成制备肽分子的工艺可控、各批次之间质量稳定，满足产业化制药的标准和要求。实验例三、鱼精蛋白类似活性肽的致敏性检测1、取8周健康新西兰白兔4只分为2组(2只/组)：鱼精蛋白类似肽组和天然鱼精蛋白组(硫酸鱼精蛋白注射液，50mg/5ml，购自北京悦康凯悦制药有限公司)，两组中的免疫抗原分别为鱼精蛋白类似肽和天然鱼精蛋白；2、初次免疫：在每组白兔的背部分3点皮下注射含1mg/1ml免疫抗原的弗氏全佐剂乳化液；第一次加强免疫：初次免疫4周后，每组白兔再次分3点皮下注射含1mg/1ml免疫抗原的弗氏不完全佐剂乳化液；第二次加强免疫：第一次加强免疫2周后，每组白兔再次分3点皮下注射含1mg/1ml免疫抗原的弗氏不完全佐剂乳化液。3、第二次加强免疫2周后，每只兔子耳缘静脉取血1ml，室温放置3h后移至冰箱存放过夜，次日收集血清。4、将血清用pbs缓冲液稀释1000倍，用免疫抗原包被elisa板检测兔抗血清稀释液的抗体含量。以(r9)2kg为例，结果显示免疫天然鱼精蛋白的兔血清中均含有抗体(2/2)，而免疫本发明的鱼精蛋白类似肽的兔血清中均无抗体检出(0/2)，免疫其它鱼精蛋白类似肽的兔血清中也无抗体检出。分析该结果可知：本发明的鱼精蛋白类似肽由于分子较小抗原性弱，未检出抗体。而天然鱼精蛋白的分子量分布从4000-10000，分布区间大，成分组成复杂，具有显著的抗原性。可见，本发明的鱼精蛋白类似肽比天然鱼精蛋白明显不具有抗原性，表明本发明的鱼精蛋白类似肽致敏性更低，作为药物用作体内更加安全，有潜力成为作用于粘膜的清洗消毒类药物。综上，以鱼精蛋白类似活性肽(r9)2kg为例，其由20个氨基酸组成，具备明确的分子结构、分子质量和成品一致性，经过生理环境中的酶解变成更小的肽分子，2肽，3肽及游离氨基酸，成为机体基本营养元素可被直接吸收利用。以明确的鱼精蛋白类似活性肽作为药物，其优点在于分子的化学性质明确，分子比天然鱼精蛋白分子小，背景清晰、降解产物易于分析和追踪，因此其毒性、致敏性、刺激性相比天然鱼精蛋白更低，对机体的生理环境更为亲善友好，具有很好的应用安全性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12