专利名称：具有杀虫活性的小分子肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种有杀虫活性的小分子肽。
背景技术：
随着科学技术的发展和经济的不断进步，人们的生活水平得到明显提高，环保意识也逐年增强，营养丰富、绿色、污染小的农副产品得到人们的喜爱。长期以来人们一直使用化学农药控制病虫害，但是化学农药的毒性较大且残留量也较高，长时间使用对环境及人们的健康都会产生严重影响，还会严重破坏生态平衡。因此，人们逐渐研究并开发出生物农药。现如今，生物农药已快速发展，许多新的品种不断涌现，并已逐步取代化学农药，成为新农药发展的有效途径之一。传统的生物农药定义是指利用活体性生物如细菌、病毒来防治病虫等有害生物的一类制剂。现在生物农药的定义已不局限于此，范围逐渐扩大，通常是指利用活体性生物或其发酵产物、转基因产物来防治病虫等有害生物的一类制剂，包括生物化学农药、转基因农药、微生物农药等等。传统的化学农药一般是消灭害虫；而生物农药则是控制和杀灭害虫，生物农药具有长效作用，针对性强，毒性小，残留量低，杀虫效果好，抗药性小，对作物产量影响也小的优点。
发明内容
本发明是提供了一种具有杀虫活性的小分子肽。本发明具有杀虫活性的小分子肽的氨基酸序列为SerGluProAlaGlnIIeValIIeVal AspGlyValAspTyrTrp。本发明具有杀虫活性的小分子肽由15个氨基酸组成，分子量为1691. 3。本发明具有杀虫活性的小分子肽具有对人畜无毒性和环保性。经试验测试可知，本发明具有杀虫活性的小分子肽针对性强，对蚜虫的防治效果达100%，对红蜘蛛的防治效果可达90%，对木虱、白粉虱等均有杀灭作用，且常温下3年内持久有效。本发明具有杀虫活性的小分子肽化学稳定性强，在pH = 2. 0 11. 0、温度为20 80°C条件下均具有杀虫活性。本发明具有杀虫活性的小分子肽是一种广谱性的杀虫剂，不产生药害，无残留。成本低，与化学药剂比较，可节省90%的成本；而且用量少，每亩用量仅为2克。
图1是具体实施方式
一中所需样品粗品初步分离的结果图。图2是具体实施方式
一中峰IB12-IC1组分进一步分离的结果图。图3是具体实施方式
一中具有杀虫活性的小分子肽的纯度结果检测图。图4是具体实施方式
一中本实施方式具有杀虫活性的小分子肽浓度测定标准蛋白的标准曲线图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式具有杀虫活性的小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本实施方式具有杀虫活性的小分子肽的获取方法一、将链霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU，2008H008 经 LB 培养基活化后，按 10%接种量将孢子悬液接入种子培养基(种子培养基LB培养基，pH值7. 2士0. 05)，于 28°C摇床培养48h后，按10%接种量将种子液接入IOL发酵培养基(发酵培养基玉米淀粉 5.0%,黄豆饼粉3.0%，酵母粉1. 6 %，α -淀粉酶0.3%，消泡剂0.05%，硫酸镁0.05%，和余量蒸馏水配制，pH值7. 5士0.05，121°C高压灭菌30min)的发酵罐中，置于121r/min、培养基中溶解氧含量为60%、起始pH值为8. 0、发酵温度为28°C条件下搅拌发酵培养96h。二、取 IOOmL 链霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU, 2008H008 发酵液用 4 层纱布过滤，加入IOOmL的丙酮溶液，搅拌均勻，30分钟后2000r/min离心10分钟，弃沉淀，取上清清液于30°C旋蒸除去丙酮，得所需样品粗品。三、采用反相高效液相色谱法，C18柱，运用紫外检测器，以甲醇-水(甲醇与水的体积比10 90)作为流动相，进行样品的一级制备；C18柱柱高25cm，柱体积4.155mL，柱压13MP，最大流速1. 5mL/min，初步分离的结果如图1所示，收集峰IB12-IC1组分。四、将收集到的峰IB12-IC1组分进一步分离纯化离子交换分析，C18柱，pH值为 8. 5的TBS缓冲液，214nm反相色谱，柱高:25cm，柱体积4. 155mL,柱压13MP，最大流速 1. 5mL/min，进一步分离的结果如图2所示，收集峰2Di_2D2组分，即得到本实施方式具有杀虫活性的小分子肽。本实施方式所用的链霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU，2008H008在中国发明专利“一株具有高效杀虫作用的菌株”(申请公布日2011年11月23日，申请号 201110179632. 5)中公布，其保藏编号为CCTCC No =M 2011028，保藏日期为2011年01月21曰。取5mL本实施方式具有杀虫活性的小分子肽进行纯度测定，避开疏水差异，电荷差异的分离手段，采用分子量大小差异分离分析，判断纯度。纯度结果如图3所示，本实施方式具有杀虫活性的小分子肽的纯度大于95%。(纯度测定方法将本实施方式具有杀虫活性的小分子肽用高效液相色谱HPLC测定柱体C18柱，流动相体积浓度为35%的甲醇， 柱压76 78kgf/cm2，波长=A265，保留时间为4分55秒，柱箱温度:30°C )取5mL本实施方式具有杀虫活性的小分子肽进行浓度测定。测定的标准蛋白的标准曲线如图4所示，测定结果为0. 8mg/mL。本实施方式具有杀虫活性的小分子肽经质谱测定，其分子量为1691. 377。本实施方式具有杀虫活性的小分子肽用氨基酸测序仪测定氨基酸序列为15个氨基酸组成的小肽，理论分子量为1691. 3与质谱测定的分子量值相符。可采用分子生物学手段合成本实施方式具有杀虫活性的小分子肽。本实施方式具有杀虫活性的小分子肽杀虫活性鉴定(根据中华人民共和国农业部(NY/T1154，14-2008) 2008，07，01起实施的规程进行操作)将新鲜生菜，剪成与平皿(直径9mm)底部大小一致，平铺在平皿的底部。在每个铺有生菜的平皿中加入2mL的本实施方式具有杀虫活性的小分子肽，浸泡生菜叶子2min 后，将叶子取出，用棉花蘸去表面液体。阴性对照为水。分别在每片经过处理后的叶片上接种20头蚜虫，保证每头蚜虫的个体大小一致，处理后置于温度25士0.5°C、光周期L D = 14 10、相对湿度为75% 85%的培养箱中饲养。饲养48h后检查幼虫死亡率杀虫死亡率(％)；校正公式=(实验组死亡率-对照组死亡率)/(1_对照组死亡率)X 100。本实施方式具有杀虫活性的小分子肽对蚜虫的杀虫率为100%。将新鲜生菜，剪成与平皿(直径9mm)底部大小一致，平铺在平皿的底部。在每个铺有生菜的平皿中加入2mL的本实施方式具有杀虫活性的小分子肽，浸泡生菜叶子2min后， 将叶子取出，用棉花蘸去表面液体。阴性对照为水。分别在每片经过处理后的叶片上接种 20头红蜘蛛，保证每头红蜘蛛的个体大小一致，处理后置于温度25士0.5°C、光周期L D =14 10、相对湿度为75% 85%的培养箱中饲养。饲养48h后检查幼虫死亡率。杀虫死亡率(％)；校正公式=(实验组死亡率-对照组死亡率)/(1_对照组死亡率)X 100。本实施方式具有杀虫活性的小分子肽对红蜘蛛的杀虫率为90%。而且本实施方式具有杀虫活性的小分子肽对木虱、白粉虱均有杀灭作用。将本实施方式获得的具有杀虫活性的小分子肽冻干，每亩本实施方式具有杀虫活性的小分子肽冻干粉用量仅为2克。将本实施方式具有杀虫活性的小分子肽冻干粉加入水中配置成浓度为50 60ppm的生物药液，即可使用，有效杀灭害虫。与使用化学药剂相比， 可节省农药成本约90%。本发明具有杀虫活性的小分子肽化学稳定性强，在pH = 2. 0 11. 0、温度为20 80°C条件下均保持较高杀虫活性。与未遭受虫害的作物进行对比试验，使用本实施方式具有杀虫活性的小分子肽的作物产量无明显变化。
权利要求
1.具有杀虫活性的小分子肽，其特征在于具有杀虫活性的小分子肽的氨基酸序列如 SEQID NO 1 所示。
全文摘要
具有杀虫活性的小分子肽，它涉及一种有杀虫活性的小分子肽。本发明是提供了一种具有杀虫活性的小分子肽。本发明具有杀虫活性的小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明具有杀虫活性的小分子肽可用于虫害防治。
文档编号A01P7/00GK102492025SQ20111043938
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者余琼, 张巍, 张朝晖, 穆丹, 马东升, 高金胜 申请人:黑龙江大学