专利名称：抗高血压活性肽ivp的制作方法
技术领域：
本发明涉及两个抗高血压活性肽，具体涉及一种通过构建定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Relationships, QSAR)数学模型和体外和体内生物活性实验筛选出两个抗高血压的合成三肽。
背景技术：
我国高血压患病率的态势越来越严峻，当前常见的治疗高血压的药物有以下六种利尿剂(可能引起低血钾症，影响糖代谢，使糖耐量下降)、3 —阻滞剂(可带来中枢神经系统、消化系统以及血管系统的不良反应)、a 一阻滞剂、钙拮抗剂(会导致水肿、头痛、潮红、多尿、低血压以及心脏传导受阻)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II受体阻滞剂(可引起干咳、血钾高、甚至血管性水肿)。由于大部分药物都有副作用，所以科学家们一直致力于开发含有抑制血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE, EC 3. 4. 15. I)活性的小肽的功能食品，使高血压患者得益。ACE酶是一种外肽酶，是调节血压的重要因子，主要存在于血管的内皮细胞，在肺毛中含量最为丰富。根据文献赵海珍，陆兆新，刘战民等.天然食品来源的血管紧张素转换酶抑制肽的研究进展[J].中国生化药物杂志，2004，25(5) :315-317及文献陈强.血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂联合应用治疗肾小球疾病[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2001，10(3) :274-277的报道，ACE酶的主要作用有两个，一个是使得血管紧张素I (AngI)转化为血管紧张素II (Ang II)，另外一个是使缓激肽失活，以这两个作用影响肾素一血管紧张素系统(RAS)来完成血压的调节。血管紧张素II可以与血管组织中的特异性受体AT1相结合，通过血流动力学作用，使得血管收缩，收缩肾小球出球小动脉，使肾血流量下降，肾小球毛细血管内压升高，缓激肽可以通过血流动力学作用，使血管舒张，舒张肾小球出球小动脉，使肾血流量上升，肾小球毛细血管内压降低。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供两种高效低毒的抗高血压活性肽。为实现上述目的，本发明使用以下技术方案两种抗高血压活性肽，其氨基酸序列分别为缴氨酸(Val)-异亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)(简称VIP)和异亮氨酸(lie)-缬氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)(简称IVP)。本发明选择了氨基酸的疏水性和氨基酸的空间占位(以分子量为衡量基准)建立了 ACE酶抑制效果(LogIC50)与乳源性抑制肽(3aa)的数学模型 Y=0. 560-0. 540*Xn_0. 007*X21_0. 054*X12+0. 010*X22+0. 696*X13+0. 006*X23。分析抗高血压活性肽的结构特征，如C-末端的氨基酸残基的疏水性和其倒数第二个氨基酸的拓扑空间结构，以及结合已知的ACE抑制二肽样本集，确定乳源抗高血压小肽的筛选原则C_末端具有疏水性，以Pro、Phe> Trp和Tyr为主；C-末端倒数第二个氨基酸具有较小的拓扑空间。选择待测三肽序列，并通过构建的QSAR数学模型，对其理论LogIC5tl值进行分析，根据其值的大小确定体内外活性检测候选小肽序列并进行合成，其中，Xu代表的是结构性质，其中，j = 1，2，3，代表的是乳源三肽中氨基酸的位置，i=l，2，分别代表的是氨基酸的疏水性和分子量，疏水性均取了正值来带入方程进行运算。所选取的ACE酶抑制活性肽均取自牛奶中主要的蛋白质，所选取出的这些小肽的LogIC50均为正值，即意味着具有ACE酶抑制活性，根据数学方程可知，C末端第一位氨基酸的疏水性具有重要的影响作用，因为，在所筛选出来的小肽中，首位为Ile和Val的小肽的抑制效果较好，即LogIC5tl的值较小。从中筛选出了 6个计算值比较理想的三肽分子异亮氨酸(Ile)-缬氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)(简称IVP)，LogIC50=O. 2 ;异亮氨酸(Ile)-天冬酰胺(Asn)-脯氨酸(Pro)(简称INP), LogIC50=O. 3878 ;异亮氨酸(Ile)-谷氨酰胺(Gln)-脯氨酸(Pro)(简称 IQP)，LogIC50=O. 5278;缬氨酸(Val)-异亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)(简称 VIP)，LogIC50=O. 5855 ;缬氨酸(Val)-亮 氨酸(Leu)-脯氨酸(Pro)(简称 VLP)，LogIC50=O. 6233 ;赖氨酸(Lys)-赖氨酸(Lys)-酪氨酸(Tyr)(简称 KKY)，LogIC50=O. 674)。再通过体外和体内生物活性验证筛选出2个抗高血压能力最强的合成三肽IVP和VIP。较佳的，本发明所述三肽分子为直链。本发明所述三肽可采用本领域常规方法制备，如采用固相多肽合成方法合成，以VIP为例，包括以下具体步骤首先在脯氨酸二氯树脂上接入芴甲氧羰基异亮氨酸，同时加入TBTU和DIEA进行偶联，偶联时间为30分钟，并用体积比为20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗涤3次去除末端芴甲氧羰基基团，然后用六氢吡啶进行脱保护，脱保护结束后再用体积比为20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗涤6次。抽干后加入芴甲氧羰基缬氨酸，TBTU和DIEA进行偶联，偶联时间为30分钟，并用20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗涤3次，用六氢吡啶进行脱保护，再用体积比为20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗涤6次抽干，最后通过半制备型反相高效液相色谱(反相柱VYDAC —C18柱(4. 6 X 250mm，5 iim);线性梯度溶液A (溶解于分析纯级乙腈的0. l%(v/v)三氟乙酸)，梯度5%-30% (v/v) 25分钟、100% (v/v) 25. I分钟、停止30分钟;溶液B (溶解于纯水的0. 1% (v/v)三氟乙酸)，梯度95%-70% (v/v)25分钟、0%25. I分钟、停止30分钟；流速1. 0毫升/分钟；分离收集洗脱峰，冻干后备用。IVP、INP、IQP、VLP和KKY的制备方法可同VIP制备方法，除了将VIP制备过程中所用氨基酸脯氨酸、异亮氨酸和缬氨酸替换为所需制备的三肽分子中相对应的位置上的氨基酸即可。本发明的优点是本发明是通过构建定量构效关系(QuantitativeStructure-Activity Relationships, QSAR)数学模型,利用乳源蛋白一级信息，筛选出6个计算值比较理想的具有抗高血压功能的三肽分子，并通过体外和体内生物活性验证筛选出2个抗高血压能力最强的合成三肽。本发明获得的具有抗高血压能力的合成三肽，可分别用于抑制血管紧张素转化酶(ACE酶)的活性，降低血管紧张素II (Ang II)的生成水平，达到降低血压的效果。其存在于乳源性蛋白中且抗高血压活性肽具有高效低毒的特点，对于开发治疗高血压药物和功能食品有着较好的应用前景。由于能通过人工化学合成技术进行大规模制备，为将来药物开发中低成本和高产率的制备奠定了基础。
图I为具体实施方式
中大鼠喂养异亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)(简称 IPP) (I. 5mg/kg)后收缩压(Systolic Blood Pressure, SBP)与时间关系。图2为具体实施方式
中大鼠喂养IVP (I. 5mg/kg)后收缩压(Systolic BloodPressure, SBP)与时间关系。图3为具体实施方式
中大鼠喂养VIP (I. 5mg/kg)后收缩压(Systolic BloodPressure, SBP)与时间关系。图4为具体实施方式
中空白组大鼠收缩压收缩压(Systolic Blood Pressure,SBP)与时间关系。
具体实施例方式实施例I :三肽分子抗高血压活性测试·实验材料新西兰大白兔上海交通大学药学院动物实验中心提供；20周龄雄性高血压模式大鼠(SHR):上海实验动物中心提供；VPP、IPP、KKY、IVP、INP、IQP、VLP、VIP，吉尔生化(上海)有限公司制备;微量移液器(100 1000 u L, 20^200 u L, 10^100 u L, 0. 5 IOy L)，Eppendorf Ltd ;过滤器(O 50mm),上海医药工业研究所；微孔滤膜(①50mm,孔径为0. 22 ii m),上海摩速科学器材有限公司；Centrifuge 5415 D小型高速离心机，EppendorfLtd ;AKTApurifier 10 层析系统，Superdex 30 prep grade 层析柱(GE Healthcare, USA)；Zorbax SB-C18反相色谱柱(Agilent);摩尔超纯水机，上海摩勒科学仪器有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器厂JY2002型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂；HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；Lab Dancer试管振荡器，IKA Works Guangzhou ；ElectroluxB⑶-252T型冰箱，伊莱克斯(中国)电器有限公司；DW-HW138型超低温冰箱，中科美菱低温科技有限责任公司；分析天平，Meitelei-tolido, German ;大鼠血压计SoftronBP_98A,北京软隆生物技术有限公司。合成三肽的体外ACE酶抑制活性结果分析马脲酰组氨酰亮氨酸(hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL)在 ACE 的催化下快速分解产生马尿酸(Hippuric Acid, HA)和二肽histidyl-leucine (HL),加入ACE抑制剂后，ACE的活性受到抑制，HA和HL的生成量减少，通过RP-HPLC方法(色谱柱=ZorbaxSB-C18 柱(80 A, 5 y m, 4. 6mmX 250mm ;流动相20%(v/v)分析纯乙腈+0. l%(v/v)三氟乙酸；流速I. 0毫升/分钟)测定228nm下HA的生成量，按公式I评价ACE抑制剂对ACE的抑制率。ACE抑制率(%) =IOOX (A对照一A样品)/ (A对照一A空白)(公式I) A对照IOOmM硼酸钠缓冲液(BBS，pH 8. 3)代替三肽时生成HA的峰面积；A样品，三肽样品时生成HA的峰面积；A空白，盐酸先于HHL加入时IOOmM硼酸钠缓冲液(BBS，pH8. 3)代替三肽时生成HA的峰面积。反应体系和条件见表I :表 I
权利要求
1.ー种抗高血压活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列为异亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸。
2.如权利要求I所述的抗高血压活性肽在制备治疗或预防高血压的药物和食物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗高血压活性肽，其氨基酸序列为异亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸；本发明是通过构建定量构效关系数学模型，利用乳源蛋白一级信息，并通过体外和体内生物活性验证筛选抗高血压能力最强的合成三肽，本发明获得的具有抗高血压能力的合成三肽，可分别用于抑制ACE酶的活性，降低AngII的生成水平，达到降低血压的效果。其存在于乳源性蛋白中且抗高血压活性肽具有高效低毒的特点，对于开发治疗高血压药物和功能食品有着较好的应用前景；由于能通过人工化学合成技术进行大规模制备，为将来药物开发中低成本和高产率的制备奠定了基础。
文档编号A23L1/305GK102786580SQ20121024817
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者张建华, 沈珊齐, 索庚, 薛婷, 赵艳云, 邓云, 金雅芳, 钱炳俊, 骆亚丽 申请人:上海交通大学