具有抗真菌活性的肽的制作方法

专利名称：：具有抗真菌活性的肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗真菌肽和/或抗细菌肽，特别是从昆虫中获得的抗真菌肽，所述昆虫特别是鳞翅昆虫(l印idopterans)。本发明也提供了应用这些抗真菌肽治疗或预防真菌生长的方法，所述方法被用于各种目的，例如预防植物的真菌感染、治疗动物(特别是人类)的真菌感染、以及预防食物腐败变质。
背景技术：
：真菌是真核细胞生物，它们可以有性或无性地繁殖，并且可以是双相形式的，其在自然环境是一种形式，而在感染宿主体内是另一种不同的形式。植物和动物的真菌感染都是农业、医学和食品生产/储存领域的重大问题。因为多种原因，真菌感染正成为主要的关注点，所述原因包括有限数目的可用的抗真菌剂、耐较老抗真菌剂的物种的发生率的增加、以及对机会性真菌感染高危的免疫缺陷患者人群的增长。人类的真菌病被称作霉菌病。一些霉菌病是地方性的，其中只在作为真菌的天然栖息地的地理区域内才会获得感染。这些地方性霉菌病通常是自限的，并且很少有症状。一些霉菌病主要是机会性的，出现于免疫缺陷患者体内，例如器官移植患者、进行化疗的肿瘤患者、烧伤患者、AIDS患者、或糖尿病酮症患者。真菌引起了多种植物疾病，例如但不限于霉变、腐烂、锈病、黑穗病、和枯萎病等。例如，土壤中所带有的真菌性植物病原体在农业和园艺业上都造成了巨大的经济损失。具体地，立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)是表现出强致病性的主要的真菌性植物病原体之一，它与多种植物物种及品种的幼苗性疾病及叶疾病例如种子腐烂、根部腐烂、猝倒病、叶和茎的腐烂有关，造成了巨大的经济损失。另一个实例是辣椒疫霉菌(Phytophthorac即sici)，它是广泛分布的以及高度损害性的土壤传播真菌性植物病原体，它造成了辣椒(Capsicuma皿皿mL.)的根部腐烂和根茎腐烂以及叶、果实和茎的气生性枯萎病。植物的真菌感染是潮湿气候中的特殊问题，它可以成为谷物储存中的主要问题。植物可以发育出某些程度的对致病性真菌的天然抗性，但是现代的生长方法、收获和储存系统时常给植物病原体提供良好的环境。抗真菌剂包括多烯衍生物，例如两性霉素B和结构相关的化合物如制霉菌素和匹马菌素。此外，已经从多种天然存在的来源中分离出了抗真菌肽(DeLuccaandWalsh，1999)。但是，仍需要鉴定出更多的具有能在医学、农业和工业相关应用中所使用的抗真菌活性的化合物，以便控制和/或预防真菌生长。
发明内容发明人以前鉴定了moricin肽家族成员具有抗真菌活性(W02005/080423)。这些以前的研究包括了对大蜡螟(Galleriamellonella)肽组(p印tidome)的详细分析以鉴定蜡螟moricin肽。然而，发明人还令人吃惊地鉴定了大蜡螟moricin肽，其在结构上与以前描述的moricin相关肽不同。因此，在本发明的第一个部分，提供了基本上纯化的肽，其包括选自以下一组的序列i)SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；ii)与SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:3具有至少85%相同性的氨基酸序列；iii)SEQIDNO:5所示的氨基酸序列;iv)与SEQIDNO:5具有至少98%相同性的氨基酸序列；v)SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示的氨基酸序列;vi)与SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:9具有至少64%相同性的氨基酸序列;vii)i)-vi)中任一项的生物活性片段；viii)包含i)到viii)中任一项的氨基酸序列的前体，其中所述肽或其片段具有抗真菌的和/或抗细菌的活性。在第一个部分的优选实施方式中，有关的肽与SEQIDNO:1，SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7和/或SEQIDNO:9所示的序列具有至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少92%、更优选地至少95%、更优选地至少97%、以及甚至更优选地至少99%相同性。优选地，SEQIDNO:1的前体是SEQIDNO:2，SEQIDNO:3的前体是SEQIDNO:4，SEQIDNO:5的前体是SEQIDNO:6，SEQIDNO:7的前体是SEQIDNO:8，SEQIDNO:9的前体是SEQIDNO:10。优选地，可以从昆虫中纯化出所述肽。更优选地，可以从鳞翅昆虫中纯化出所述肽。更优选地，可以从螟蛾科(Pyralidae)的鳞翅昆虫中纯化出所述肽。更优选地，可以从蜡螟(Galleriasp.)中纯化出所述肽。甚至更优选地，可以从大蜡螟(Galleriamellone11a)中纯化出所述肽。在特别优选的实施方式中，可以从已经被暴露于真菌或细菌感染的昆虫中纯化出所述肽。对于鳞翅昆虫而言，优选地可以从已经暴露于细菌(例如但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)和/或藤黄微球菌(Micrococcusluteus))的末龄幼虫中纯化出所述肽。在另一个实施方式中，优选地，肽具有约4.5kDa到约3.3kDa之间的分子量。更优选地，肽具有约3.9kDa或约3.8kDa的分子量。仍在更优选的实施方式中，肽包括N末端的包括螺旋结构的两亲性区域(至少相对于C末端)、C末端的也包括螺旋结构和酸性残基的疏水性区域(至少相对于N末端)、和带电荷的C末端的尾部。在更优选的实施方式中，与SEQIDN0:1和SEQIDNO:3具有至少85%相同性的肽包括氨基酸序列Xaa工LysXaa2Xaa3Xaa4Xaa5AlalieLysLysGlyGlyXaa6Xaa7lieXaa8Xaa9Xaa工oXaa工iXaa工2Xaa工3Xaa工4Xaa工sXaa工6AlaXaa"Thi*AlaHisXaaigXaa^Xaa^oXaa^iXa&22Xa&23Xa&24Xaa^sXaa犯Xaa^7Xaa^sXaa^gXaa30Xaa31(SEQIDNO:21)。优选地，Xaai是Gly、Pro、Ala或缺失，更优选地是Gly或缺失；优选地，Xaa2是Ile、Val、Ala、Leu、Met或Phe，更优选地是lie或Val;Asn;Ser;优选地，Xaa3是Pro,Gly，Asn，Gin或His,更优选地是Pro或Asn;优选地，Xaa4是11e、Val、Ala、Leu、Met或Phe，更优选地是lie或Val;优选地，Xaa5是Lys、Arg、Gly、Pro、Ala、Asn、Gin或His,更优选地是Lys、Gly或优选地，Xaa6是Gln、Asn、His、Lys或Arg，优选地是Gin或Lys;优选地，Xaa7是Ile、Val、Ala、Leu或Gly、更优选地是lie或Ala;优选地，Xaa8是Gly、Pro、Ala、Lys或Arg，更优选地是Gly或Lys;优选地，Xaa9是Thr或Ser，更优选地是Thr;优选地，Xaa1Q是Val、Leu、Ile、Gly、Pro或Ala，更优选地是Ala或Gly优选地，Xaan是11e、Val、Met、Ala、Phe或Leu，更优选地是Leu或Phe优选地，Xaa12是Arg、Lys、Gly、Pro或Ala，更优选地是Arg、Gly或Lys优选地，Xaau是Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Leu、Met、或Phe，更优选地是Gly或Val;优选地，Xaa^是11e、Leu、Val、Ala、Met或Phe，更优选地是Val、Ile或Leu;优选地，Xaa^是Asn、Gln、His、Gly、Pro、Ala、Ser或Thr，更优选地是Asn、Gly或优选地，Xaa16是Ile、Val、Ala、Leu或Gly，更优选地是Ile或Ala;优选地，Xaa17是Ser、Thr、Gly、Pro或Ala，更优选地是Ser或Gly;优选地，Xaa18是Asp或Glu;优选地，Xaa!9是11e、Leu、Val、Ala、Met或Phe，更优选lie或Val;优选地，Xaa20是Ile，Leu，Val，Ala，Tyr、Trp或Phe，更优选地是lie或Tyr;优选地，Xaa^是Ser、Thr、Asn、Gln、His、Glu或Asp，更优选地是Ser、Asn或Glu;优选地，Xaa22是Gln、Asn或His，更优选地是Gln或His;优选地，Xaa23是Phe、Leu、Val、Ala、lie或Met，更优选地是Phe、Val或lie;优选地，Xaa24是Lys或Arg;优选地，Xaa25是Pro、Gly、Asn、Gln或His，更优选地是Pro或Asn;优选地，Xaa26是Lys或Arg;优选地，Xaa27是Lys、Arg、His、Asn或Gln，更优选地是Lys、His、Gln或Arg;优选地，Xaa28是Lys、Arg、His、Asn、Gln或缺失，更优选地是Lys、His或缺失；优选地，Xaa29是Lys、Arg或缺失，更优选地是Lys或缺失；优选地，Xaa3。是Asn、Gln、His或缺失，更优选地是Asn或缺失；优选地，Xaa31是His、Asn、Gln或缺失，更优选地是His或缺失。在更优选的实施方式中，与SEQIDN0:7和/或SEQIDNO:9具有至少64%相同性的肽包括氨基酸序列LysGlyX叫GlyXaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6GlyGlyLysXaa7IleLysXaa8GlyLeuXaa9Xaa1QXaauGlyXaa12Xaa13Xaa14Xaa15GlyXaa16Xaa17Xaa18TyrXaa19Xaa2。Xaa21Xaa22AsnXaa23Xaa24(SEQIDNO:22)。优选地，Xaa丄是Ile，Val，Ala，Leu或Gly，更优选Ile。优选地，Xaa2是Ser，Lys，Thr或Arg，更优选Ser。优选地，Xaa3是Ala，Ile，Leu，Val或Gly，更优选Ala。6优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，优选地，XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa4是Ile，Val，Ala，Leu，Met或Phe，更优选Leu。Xaa5是Lys或Arg，更优选Lys。Xaa6是Lys或Arg。Xaa7是Ile，Val，Leu，Ala，Met或Phe，更优选Ile。Xaa8是Gly，His，Ala，Pro，Asn或Gln，更优选Gly。Xaa9是Gly，Thr，Ala，Pro或Ser，更优选Gly。Xaa10是Ala，Val，Leu，Ile，Gly，Met或Phe，更优选Ala。Val，Met，Ala，Phe或Leu，更优选Leu。Val，Ile，Leu，Val，Gly，Met或Phe，更优选Ala。Gly，Pro，Ala，Val或Leu，更优选Ile。Ala，Pro，Val，Leu或Ile，更优选Gly。Ala，Ser，Val，Leu，lie或Gly，更优选Thr。His或Asn，更优选Gln。Glu，Asp，Asn或His，更优选Gln。Val，Leu，Ile，Gly，Met或Phe，更优选Val。Gln，Arg，Asp，Asn，His或Lys，更优选Glu。Asp，Glu，Gln或Asn，更优选His。Ser，Ala，Thr，Ile，Leu，Met，Phe或Gly，更优选Val。Lys，Asn，His或Arg，更优选Gln。Ser，Gln，Lys，Thr，Asn或His，更优选Arg。Gly，Asn，His,Ala或Pro，更优选Gln。,所述肽(或其片段)具有抗真菌活性。更优选地，所述肽具有针对真菌科的抗真菌活性，所述真菌科选自但不限于赤壳科、格孢腔菌科、球腔菌科、黑痣菌科、小球腔菌科、胡刷菌科。更优选地，所述肽具有针对真菌属的抗真菌活性，所述真菌属选自但不限于镰孢属(在本领域也称作赤霉属)、链格孢属、壳二孢属、剌盘孢属、剌盘孢属和曲霉属。在特别优选的实施方式中，所述肽具有针对真菌属的抗真菌活性，所述的感染植物真菌属选自但不限于链格孢属、壳二孢属、灰霉菌属、尾孢属、剌盘孢属、色二孢属、白粉菌属、镰孢属、顶囊壳属、长蠕孢属、小球腔菌属、壳球孢菌属、丛赤壳属、斜尖状孢子菌属、疱霉属、瘤梗孢属、疫霉属、单轴霉属、足球菌属、柄锈菌属、Puthium、核球壳素、梨孢属、腐霉属、丝核菌属、Scerotium、核盘菌属、壳针孢属、根串株霉、钩丝壳属、黑星菌属、和轮枝孢属。在更优选的实施方式中，所述肽具有针对真菌的抗真菌活性，所述真菌选自禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、尖抱嫌抱(Fusariumoxysporum)、狂犬壳二抱(Ascochytarabiei)禾口十字花禾斗小球腔菌(L印tosphaeriamaculans)。在另一个方面，本发明提供了与至少一种其它多肽/肽序列融合的本发明的肽。在一个优选的实施方式中，至少一种其它多肽/肽选自增强本发明的肽的稳定性的多肽/肽、辅助纯化融合蛋白的多肽/肽、辅助细胞(特别是植物细胞)分泌本发明的肽的多肽/肽、使得融合蛋白对真菌或细胞无毒性，但经例如蛋白裂解性降解的加工处理后生成本发明的抗真菌肽的多肽/肽。在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，多核苷酸包括选自以下一组的序是Ile，是Ala，是Ile，是Gly，是Thr，是Gln，是Gln，是Ala，是Glu，Xaa^oHis，Xaa21是Val，Xaa22是Gln，Xaa23是Arg，Xaa24是Gln，7列i)SEQIDNO:11-20之一所示的核苷酸序列；ii)编码本发明的肽的序列；iii)与至少SEQIDNO:11-14之一具有至少85%相同性的核苷酸序列；iv)与SEQIDNO:15禾P/或SEQIDNO:16具有至少98%相同性的核苷酸序列；v)与至少SEQIDNO:17-20之一具有至少64%相同性的序列；禾口vi)在高严格条件下与(i)到(v)中任一项杂交的序列。优选地，多核苷酸编码具有抗真菌和/或抗细菌活性的肽。在一个优选的实施方式中，相关的多核苷酸与至少SEQIDNO:11_20之一具有至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少92%、更优选地至少95%、更优选地至少97%、以及更优选地至少99%相同性。优选地，可以从昆虫中分离出多核苷酸。更优选地，可以从鳞翅昆虫中分离出多核苷酸。更优选地，可以从螟蛾科的鳞翅昆虫中分离出多核苷酸。更优选地，可以从蜡螟中分离出多核苷酸。甚至更优选地，可以从大蜡螟中分离出多核苷酸。在另一个实施方式中，多核苷酸包括SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17或SEQIDN0:19所示的序列。此外，本发明提供了用于复制和/或表达本发明的多核苷酸的合适载体。因此，也提供了包括本发明的多核苷酸的载体。载体例如可以是例如质粒、病毒、转座子或噬菌体载体，所述载体具有复制起点、和优选地用于表达多核苷酸的启动子以及任选的启动子的调节子。所述载体可以含有一个或多个选择性标记物，例如对于细菌质粒而言，标记物是氨苄西林耐药基因；或者对于哺乳动物表达载体是新霉素耐药基因。载体可以被用于例如体外生成RNA或者被用于转染或转化宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了包括本发明的载体或多核苷酸的宿主细胞。优选地，宿主细胞是动物的、酵母菌的、细菌的或植物的细胞。更优选地，宿主细胞是植物细胞。在进一步的方面，本发明提供了用于制备第一方面中的肽的方法，所述方法包括在使得编码所述肽的多核苷酸表达的条件下培育本发明的宿主细胞，并回收所表达的肽。本发明也提供了用本发明的方法所产生的肽。也提供了与第一方面中的肽特异性结合的抗体。这些抗体可以被用作在转基因系统例如转基因植物中的肽生产的标记物。另外，这些抗体可以被用于从昆虫裂解物和/或重组表达系统中纯化出本发明的肽的方法。在进一步的方面，本发明提供了包括本发明的肽、多核苷酸、载体、抗体或宿主细胞、以及一种或数种可接受的载体的组合物。在一个实施方式中，载体是药用可接受的、兽医用可接受的或农业用可接受的载体。在仍另一个实施方式中，本发明提供了用于杀死真菌、或抑制真菌的生长和/或繁殖的方法，方法包括将真菌暴露于本发明的肽。本领域技术人员要知道，可以用本领域已知的任一方法将真菌暴露于肽。在一个实施方式中，将真菌暴露于包括肽的组合物。在另一个实施方式中，将真菌暴露于产肽的宿主细胞。通过将本发明的多核苷酸引入到植物或动物体内，使得在转基因生物体中生成所述肽，可以生成抗真菌感染的植物和非人的动物。因此，在另一个方面，本发明提供了转基因植物，植物已经用本发明的多核苷酸转化，其中植物产生本发明的肽。转基因植物可以是任一种植物，但是，植物优选地是农作物。这些农作物实例包括但不限于小麦、大麦、水稻、鹰嘴豆、豌豆等。本领域技术人员将理解，本发明的转基因植物可以已经用所述的多核苷酸转化，或者是经直接转化的植物的子代。更具体地，经转化的用于指所述多核苷酸对于所述植物而言是外来的。在进一步的方面，本发明提供了控制农作物中的真菌感染的方法，该方法包括培育本发明的转基因植物的农作物。另外，在另一个方面，本发明提供了转基因的非人的动物，动物已经用本发明的多核苷酸转化，其中动物产生本发明的肽。在进一步的方面，本发明提供了治疗或预防患者体内的真菌感染的方法，方法包括给患者施用本发明的肽。另外，本发明提供了本发明的肽在生产治疗或预防患者体内的真菌感染的药物中的用途。本发明者预见到本发明的肽也具有抗细菌的活性。因此，本发明也提供了用于杀死细菌、或抑制细菌的生长和/或繁殖的方法，方法包括将细菌暴露于本发明的肽。细菌可以是革兰阳性或革兰阴性的细菌。如本领域技术人员所知道的，可以用本领域已知的任一方法将细菌暴露于肽。在一个实施方式中，将细菌暴露于包括肽的组合物。在另一个实施方式中，将细菌暴露于产生肽的宿主细胞。在进一步的方面，本发明提供了控制农作物中的细菌感染的方法，方法包括培育本发明的转基因植物的农作物。在进一步的方面，本发明提供了一种治疗或预防患者体内的细菌感染的方法，方法包括给患者施用本发明的肽。另外，本发明提供了本发明的肽在生产用于治疗或预防患者体内的细菌感染的药物中的用途。还提供了包含本发明的肽，本发明的多核苷酸，本发明的载体，本发明的宿主细胞，本发明的抗体和/或本发明的组合物的试剂盒。本发明人首先鉴定了与大蜡螟moricinD相关的肽具有抗真菌活性，诸如来自家蚕蛾的moricinB1-B8(SEQIDNO44-48)。因此，在进一步的方面，本发明提供了用于杀死真菌或抑制真菌的生长或繁殖的方法，方法包括将真菌暴露于一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQIDNO:44-48之一的残基28到65的氨基酸序列、ii)包含SEQIDNO:49的26到残基63的氨基酸序列、iii)包括SEQIDNO:50-52之一的残基26到66的氨基酸序列、iv)与i)到iii)中任一项具有至少50%相同性的氨基酸序列、v)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。在进一步的方面，本发明提供了控制农作物的真菌感染的方法，方法包括培育转基因植物的农作物，其产生包括选自以下一组的序列的肽i)包括SEQIDNO:44-48之一的26到65位残基的氨基酸序列、ii)包括SEQIDNO:49的26到63位残基的氨基酸序列、iii)包括SEQIDNO:50-52之一的26到66位残基的氨基酸序列、iv)与i)到iii)中任一项具有至少50%相同性的氨基酸序列、禾口v)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。在另一方面，本发明提供了治疗或预防患者体内的真菌感染的方法，方法包括给患者施用一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQIDNO:44-48之一的残基28到65的氨基酸序列、ii)包括SEQIDNO:49的26到残基63的氨基酸序列、iii)包括SEQIDNO:50-52之一的残基26到66的氨基酸序列、iv)与i)到iii)中任一项具有至少50%相同性的氨基酸序列、v)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。还提供了肽在生产用于治疗或预防患者体内的真菌感染的药物中的用途，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQIDNO:44-48之一的残基28到65的氨基酸序列、ii)包括SEQIDNO:49的26到残基63的氨基酸序列、iii)包括SEQIDNO:50-52之一的残基26到66的氨基酸序列、iv)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。显而易见的是，本发明的一个方面的优选的特点和特征都可应用于本发明的多个其它的方面。在本说明书全文中，用语"包括"或"包含"被理解为表示包括给定的元件、整数或步骤、或元件、整数或步骤的组，但不排除其它任何的元件、整数或步骤、或元件、整数或步骤的组。此外将用下面的不受限的实施例的方式并参照附图描述本发明。图1:通过对cDNA文库的PCR获得的大蜡螟的Gm-moricinC3基因的核苷酸序列和推定的前前蛋白序列(分别是SEQIDN0:25和6)。所推定的蛋白序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。斜体显示了预测的分泌信号肽，以及用黑体突出显示了成熟的Gm-moricinC3肽。用下划线显示出通过对纯化的Gm-moricinC3肽的Edman测序所得到的肽序列(SEQIDNO:23)。用肽序列下方的单箭头表明所预测的信号肽的解离(SignalP)位点，以及用双箭头表明了预测的生成肽的成熟形式的解离位点。图2.通过对cDNA文库的PCR获得的两个GmmoricinD基因(Gm-moricinD-SEQIDNO:26;Gm-moricinDl-SEQIDNO:27)的核苷酸序列的序列比对。黑体显示了起始和终止密码子。下划线显示了非保守氨基酸，以及用双下划线表示造成Gm-moricinDl中氨基酸取代的突变。图3.通过对cDNA文库的PCR获得的两个GmmoricinD基因(SEQIDNO:8和SEQIDNO:10)的推定的蛋白序列的序列比对。下划线显示了变体Gm-moricinDl中的非保守氨基酸。用粗体表示Edman降解确定的成熟肽的起始氨基酸。图4:通过对cDNA文库的PCR获得的大蜡螟的Gm-moricinD基因的核苷酸序列和推定的前前蛋白序列(分别是SEQIDN0:26和8)。所推定的蛋白序列开始于骨架内的第一个甲硫氨酸残基。斜体显示了预测的分泌信号肽，以及用黑体突出显示了成熟的Gm-moricinD肽。用下划线显示出通过对纯化的Gm-moricinD肽的Edman测序所得到的肽序列(SEQIDNO:24)。用肽序列下方的单箭头表明所预测的信号肽的解离(SignalP)位点，以及用双箭头表明了预测的生成肽的成熟形式的解离位点。图5:通过对cDNA文库的PCR获得的两个GmmoricinC4(SEQIDN0:28)和GmmoricinC5(SEQIDNO:29)的核苷酸序列的序列比对。黑体显示了起始和终止密码子。下划线显示了Gm-moricinC5的开放阅读框中的不同于Gm-moricinC4的核苷酸，以及用双下划线表示造成氨基酸取代的突变。图6:通过对cDNA文库的PCR获得的两个GmmoricinC4(SEQIDN0:2)和GmmoricinC5(SEQIDNO:4)基因的推定的蛋白序列的序列比对。下划线显示非保守残基。预测的成熟肽的起始氨基酸用黑体显示。图7:来自大蜡螟的抗真菌肽与来自其他鳞翅类家蚕蛾的moricin的ClustalW比对。大蜡螟(对于Gm-A，B，C1禾口C2，见W02005/080423:本发明公开的Gm_C3，C4，C5和D)，家蚕蛾(Bmmor，P82818)(SEQIDNO:16-A1_NP_001036829，Bm-A2_CH391671，Bm_A3_AADK01025872，Bm_A4_AV402493，Bm—Bl禾卩Bm_B2_CH380045，Bm—B3，B6禾卩B8-CH380569)，斜纹夜蛾(Spodopteralitura)(Slmor，BAC79440)(SEQIDNO:14)，甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)(Semor，AAT38873)(SEQIDN0:57)，烟草天蛾(Manducasexta)(Msmor，AA074637)(SEQIDNO:15)，烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)(Hvvir，P83416)(SEQIDNO:17)，全须夜蛾(Hyblae即uera)(Hpmor，AAW21268)(SEQIDNO:58)，Caligoillioneus(CiP1646，CiP1647，CiP1648)，Lonomiaobliqua(CX816233的翻译)，柞蚕(Antheraeapernyi)(Ap，ABF69030)。序列表说明SEQIDNO:1_大蜡螟的Gm-moricinC4。SEQIDNO:2_大蜡螟的前Gm-moricinC4。SEQIDNO:3_大蜡螟的Gm-moricinC5。SEQIDNO:4_大蜡螟的前Gm-moricinC5。SEQIDNO:5_大蜡螟的Gm-moricinC3。SEQIDNO:6_大蜡螟的前Gm-moricinC3。SEQIDNO:7_大蜡螟的Gm-moricinD。SEQIDNO:8_大蜡螟的前Gm-moricinD。SEQIDNO:9_大蜡螟的Gm-moricinD的变体(Dl)。SEQIDNO:10-大蜡螟的前Gm-moricinD的变体(Dl)0167]SEQIDNOll-编码大蜡螟的Gm-moricinC4的cDNA。0168]SEQIDNO12-编码大蜡螟的前Gm-moricinC4的cDNA。0169]SEQIDNO13-编码大蜡螟的Gm-moricinC5的cDNA。0170]SEQIDNO14-编码大蜡螟的前Gm-moricinC5的cDNA。0171]SEQIDNOis-编码大蜡螟的Gm-moricinC3的cDNA。0172]SEQIDNOle-编码大蜡螟的前Gm-moricinC3的cDNA。0173]SEQIDNO17-编码大蜡螟的Gm-moricinD的cDNA。0174]SEQIDNO18-编码大蜡螟的前Gm-moricinD的cDNA。0175]SEQIDNO19-编码大蜡螟的Gm-moricinD的变体(Dl)的cDNA。0176]SEQIDNO20-编码大蜡螟的前Gm-moricinD的变体(Dl)的cDNA。:0177]SEQIDNO:21-与Gm-moricinC4和Gm-moricinC5相关的抗真菌肽的共有序列。:0178]SEQIDNO:22-与Gm-moricinD相关的抗真菌肽的共有序列。:0179]SEQIDNO:23-纯化自大蜡螟的Gm-moricinC3的部分序列。:0180]SEQIDNO:24-纯化自大蜡螟的Gm-moricinD的部分序列。:0181]SEQIDNO:25-编码大蜡螟的Gm-moricinC3的全长cDNA。:0182]SEQIDNO:26-编码大蜡螟的Gm-moricinD的全长cDNA。:0183]SEQIDNO:27-编码大蜡螟的Gm-moricinD变体(Dl)的全长cDNA。:0184]SEQIDNO:28-编码大蜡螟的Gm-moricinC4的全长cDNA。:0185]SEQIDNO:29-编码大蜡螟的Gm-moricinC5的全长cDNA。:0186]SEQIDNO:30-分离的Gm-moricinCl的N末端序列。:0187]SEQIDNO:31-家蚕蛾前-moricinAl。:0188]SEQIDNO:32-柞蚕moricin。SEQIDNO:33-烟芽夜蛾moricin。SEQIDNO:34-斜纹夜蛾前-moricin。SEQIDNO:35-甜菜夜蛾前-moricin。SEQIDNO:36-烟草天蛾前-moricin。SEQIDNO:37-CaligoillioneusmoricinCi-P1647。SEQIDNO:38-CaligoillioneusmoricinCi_P1648。SEQIDNO:39-CaligoillioneusmoricinCi_P1646。SEQIDNO:40-大蜡螟前-moricinB。SEQIDNO:41-大蜡螟前-moricinCl。SEQIDNO:42-大蜡螟前ioricinC2。SEQIDNO:43-大蜡螟前-moricinA。SEQIDNO:44-家蚕蛾前-moricinB3。SEQIDNO:45-家蚕蛾前-moricin朋。SEQIDNO:46-家蚕蛾前-moricinB2。SEQIDNO:47-家蚕蛾前-moricinB8。SEQIDNO:48-家蚕蛾前-moricinBl。SEQIDNO:49一Lonomiaobliqim前—moricin。SEQIDNO:50-家蚕蛾前-moricinA4。SEQIDNO:51-家蚕蛾前-moricinA3。SEQIDNO:52-家蚕蛾前-moricinAl。SEQIDNO's53_74_寡核苷酸引物。具体实施例方式常用技术和定义除非有具体说明，在此所用的所有技术和科学术语都应当被认为具有和本领域普通技术人员通常所理解的意义(例如，细胞培养、微生物学、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、真菌学和生物化学领域)。除非另有说明，在本发明中所用的重组蛋白、细胞培养、转基因植物生产和微生物学技术都是本领域技术人员所公知的标准方法。在文献中都描述并解释了这些技术，文献来源例如是J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984);J.S咖brooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryMaruml，ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989);T.A.Brown(editor)，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,Volumes1and2，IRLPress(1991);D.M.GloverandB.D.Hames(editors)，DNACloning:APracticalApproach,Volumes1-4，IRLPress(1995andl996);禾口F.M.Ausubeletal.(editors)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience(1988，包括至lj目前为止的所有改版)，在此通过引用将其所有内容并入本申请。术语"抗真菌"肽在此指的是具有抗真菌性能的肽，例如抑制真菌细胞的生长，或杀死真菌细胞，或中断或延迟真菌生命周期中的某个阶段例如孢子发生、孢子生成和交配。术语"抗细菌"肽在此指的是具有抗细菌性能的肽，例如抑制细菌细胞的生长，或杀死细菌细胞，或中断或延迟细菌生命周期的阶段例如孢子形成、和细胞分裂。多月太/月太我们用"基本上纯化的肽"或"纯化的肽"表示通常已经与脂类、核酸、其它肽、以及与其天然状态相关的其它污染分子分离开了的肽。优选地，基本上纯化的肽或纯化的肽的至少60%、更优选地是至少75%、以及更优选地是至少90%与其它与之天然相关的组分是游离的。术语"多肽"和"肽"通常可以互换使用。但是，术语"肽"一般用于表示不大的氨基酸链，例如长度为100个或更短的氨基酸残基。用GAP(NeedlemanandWunsch，1970)分析(GCG程序)确定出肽的％相同性，其中缺口生成补偿=8，以及缺口延伸补偿=3。查询序列的长度至少为15个氨基酸，GAP分析在至少15个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度至少为50个氨基酸，GAP分析在至少50个氨基酸的区域上比对两个序列。优选地，GAP分析比对两个序列的全长。"生物学活性"片段在此表示本发明的肽的一部分，其保留了全长肽所定义确定的活性。在绝大多数实施方式中，该活性是抗真菌活性，但是，在一些实施方式中，该活性是抗细菌活性。生物学活性片段可以是任一长度，只要它们保留了所定义的活性，但是，在优选13的实施方式中，它们的长度是至少IO个氨基酸，更优选地是至少15个氨基酸。通过往本发明的核酸中引入合适的核苷酸变化，或者通过体外合成所需的肽都可以制备出本发明的肽的氨基酸序列突变体。这些突变体包括例如氨基酸序列中的残基缺失、插入或取代。可以进行缺失、插入和取代的组合以便得到最终的构建体，只要终末的肽产物具有所需的特征。利用本领域已知的任一技术可以制备突变的(改变的)肽。例如，本发明的多核苷酸可以进行体外诱变。这些体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适载体内，将载体转化到"诱变"株例如大肠杆菌XL-1红(Stratagene)内，以及繁殖所转化的细菌到合适数目的世代。在另一个实施例中，本发明的多核苷酸进行如Harayama(1998)所广泛描述的DNA改组技术。这些DNA改组技术可以包括与本发明的那些基因相关的基因，例如编码家蚕蛾的moricin的基因(HaraandYamakawa，1995)。利用在此所述的技术可以容易地筛选源自突变的/改变的DNA的肽产物，以确定出它们是否具有抗真菌和/抗细菌的活性。在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质将依赖于所要修饰的特征。可以单个地或系列地修饰突变的位置，例如通过(1)首先用保守氨基酸选择物进行取代，然后根据所得到的结果进行更重要的选择；(2)缺失靶残基；或(3)在定位的位点附近插入其它残基。氨基酸序列缺失的范围通常是约1到15个残基，更优选地是约1到10个残基以及一般是约1到5个连续残基。取代突变体是在肽分子中去除至少一个氨基酸残基并在该位置所插入的不同的残基。与取代诱变最为相关的位点包括被鉴定为活性位点的位点。其它有关的位点是这样一些位点，在所述位点上从各种菌株或物种中所得到的特定残基都相同。这些位置对于生物学活性可能是重要的。对于这些位点，特别是处于具有至少三个其它的相同保守位点的序列内的位点，优选地以相对保守的方式取代。在题为"取代示例"的表1中显示了这些保守取代。表1:取代示例<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>原残基取代示例Glu(E)aspGly(G)pro，H是(H)asn^glnIle(I)leu^val^alaLeu(L)ile;val;met;ala;pheLys(K)Met(M)leu^phePhe(F)leu^val^alaPro(P)glySer(S)thrThr(T)Trp(W)tyrTyr(Y)trp^pheVal(V)ile;leu;met;phe，ala具体地，先前已经显示moricin具有两个a螺旋结构(Hemmietal，2002)。考虑到本发明的肽与moricin样肽的亲缘关系(见图7)，可能的是，相似的结构对于保持本发明的肽的抗真菌活性也是重要的。因此，当设计例如SEQIDN0:4的突变体时，本领域人员利用特殊氨基酸的化学知识以及联合已知的推定肽四级结构的方法，可以容易地产生具有一个或数个氨基酸变异的肽(与SEQIDNO:1相比较)，其具有抗真菌活性。此外，如果需要，可以将非天然的氨基酸或化学的氨基酸类似物作为取代物或添加物引入到本发明的肽中。这些氨基酸包括，但不限于，常用氨基酸的D异构体、2，4-二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4_氨基丁酸、2_氨基丁酸、6_氨基己酸、2_氨基异丁酸、3_氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、P-丙氨酸、氟氨基酸、设计者氨基酸(designeraminoacids)例如P_甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸、和常15用的氨基酸类似物。本发明的范围也包括本发明的肽在合成的过程中或之后被生物素化、苄基化、糖基化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白裂解性解离、与抗体分子或其它细胞配体相连接等所不同地修饰。这些修饰可以作用为增加本发明的肽的稳定性和/或生物学活性。用各种方法都可以生成本发明的肽，包括生产和回收天然肽、生产和回收重组肽、以及化学合成肽。在一个实施方式中，通过培养能在足以生成肽的条件下表达肽的细胞，并回收肽可以生成本发明的分离的肽。用于培养的优选细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括，但不限于，有效的培养基、生物反应器、温度、pH值和使得肽生产的氧气条件。有效的培养基指的是其中细胞被培养产生本发明的肽的任一培养基。这些培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷源、和合适的盐、矿物质、金属和其它养分例如维生素的水性培养基。本发明的细胞可以被培养在传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿、和Petri培养板中。可以在适合于重组细胞的温度、PH值和氧饱和度条件下进行培养。这些培养条件都是在本领域一般技术人员的专业知识之内。多核苷酸我们用"分离的多核苷酸"表示通常已经从在自然状态下与其相关的或相连的多核苷酸序列中分离出来的多核苷酸。优选地，分离多核苷酸的至少60%、更优选地是至少75%、以及更优选地是至少90%与其它与之天然相关的组分是游离的。此外，术语"多核苷酸"在此可以与术语"核酸分子"互换使用。用GAP(NeedlemanandWunsch，1970)分析(GCG程序)确定出多核苷酸的％相同性，其中缺口生成补偿=8，以及缺口延伸补偿=3。查询序列的长度至少为45个核苷酸，GAP分析在至少45个核苷酸的区域上比对两个序列。更优选地，查询序列的长度至少为150个核苷酸，GAP分析在至少150个核苷酸的区域上比对两个序列。优选地，GAP分析比对两个序列的全长。在高度严格的条件下，本发明的多核苷酸可以与编码本发明的肽的多核苷酸选择性地杂交。此外，本发明的寡核苷酸具有在严格条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的序列。高严格条件在此是下面的条件(l)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015MNaC1/0.0015拧檬酸钠/0.1%Na2S04，50°C;(2)在杂交期间采用去污齐U，例如甲酰胺例如50%(体积/体积)甲酰胺和O.1%牛血清白蛋白、0.1%Fico11、0.1%聚乙烯吡咯酮、50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)、和750mMNaCl、75mM柠檬酸钠、42"C;或者(3)采用50%甲酰胺、5xSCC(O.75MNaC1、0.075M拧檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、5xDenhardt溶液、经超声处理过的鲑精DNA(50g/m1)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖、42"(0.2xSCC和0.1XSDS)。当与天然存在的分子比较时，本发明的多核苷酸可以具有一种或多种突变，所述突变可以是核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变体可以是天然存在的(即从天然来源中分离到的)或合成的(例如如上述的通过对核酸进行定向诱变或DNA改造)。因此，显而易见的是本发明的多核苷酸可以是天然存在的或重组的。本发明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或它们的衍生物。这些寡核苷酸的最小的大小是在寡核苷酸和本发明的核酸分子上的互补序列之间形成稳定的杂交体所需的大小。本发明包括可以被用作例如鉴定核酸分子的探针的寡核苷酸，或用作扩增本发明的核酸分子的引物的寡核苷酸。重组载体本发明的一个实施方式包括重组载体，其包括至少一个本发明的分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被插入到任一能将多核苷酸分子转运到宿主细胞内的载体内。这样一种载体含有异源的多核苷酸序列，即没有天然地发现与本发明的多核苷酸分子相邻的多核苷酸序列，或优选地源自不同于本发明的多核苷酸所来源的物种。载体可以是RNA或DNA，或者是原核的或真核的，以及通常是转座子(例如在US5，792，294中所述的转座子)、病毒或质粒。—种类型的重组载体包括与表达载体可操纵地连接的多核苷酸分子。词语"可操纵地连接"指的是多核苷酸分子以使得分子在被转化到宿主细胞内后能被表达的方式插入到表达载体内。表达载体在此是能转化宿主细胞以及能影响特异多核苷酸分子的表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体也能在宿主细胞内进行复制。表达载体可以是原核的或真核的，以及通常是病毒或质粒。本发明的表达载体包括任一在本发明的重组细胞内具有功能(即指导基因表达)的载体，所述重组细胞包括细菌、真菌、体内寄生虫、节肢动物、动物、和植物细胞。本发明的特别优选的表达载体可以指导植物细胞内的基因表达。本发明的载体也可以被用于在无细胞的表达系统中生产肽，这些系统在本领域是公知的。具体而言，本发明的表达载体含有调节序列例如转录调节序列、翻译调节序列、复制起点、和其它的与重组细胞相兼容的并能调节本发明的多核苷酸分子的表达的调控序列。具体而言，本发明的重组分子包括转录调节序列。转录调节序列是控制转录的启动、延伸和终止的序列。特别重要的转录调节序列是控制转录启动的序列，例如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。合适的转录调节序列包括任一能在至少一种本发明的重组细胞内发挥作用的转录调节序列。各种这样的转录调节序列对于本领域的技术人员是熟知的。优选的转录调节序列包括那些在细菌、酵母菌、节肢动物和哺乳动物细胞内发挥作用的序列，其包括但不限于tac、lac、trp、trc、oxy~pro、omp/lpp、rrnB、入卩筮菌体、卩筮菌体T7、T71ac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、a-配对因子、毕赤酵母醇氧化酶、甲病毒亚基因组启动子(例如辛德比斯病毒亚基因组启动子)、抗生素耐药基因、杆状病毒、玉米夜蛾昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(例如中间早期启动子)、猿猴病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒的长末端重复、Rous肉瘤病毒、热休克蛋白、磷酸和硝酸转录调节序列以及其它能控制原核或真核细胞内的基因表达的序列。特别优选的转录调节序列是能积极指导植物内的转录的启动子，或者是组成型的或阶段和/或组织特异的，这依赖于植物或其部分的用途。这些植物启动子包括，但不限于，表现为组成型表达的启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；用于叶特异性表达的启动子例如二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的启动子；用于根特异性表达的启动子例如来自谷氨酰胺合酶基因的启动子；用于种子特异性表达的启动子例如欧洲油菜(Brassican即us)的cruciferinA启动子；用于脉管特异性表达的启动子例如马铃薯的I型patatin启动子以及用于果实特异性表达的启动子例如番茄的聚半乳糖醛酸酶(PG)启动子。本发明的重组分子也可以(a)含有分泌信号(即信号片段的核酸序列)，以便使得17细胞能分泌所表达的本发明的肽，这就产生肽和/或(b)含有导致本发明的核酸分子表达为融合蛋白的融合序列。合适的信号片段的实例包括任一能指导本发明的肽的分泌的信号片段。优选的信号片段包括，但不限于，组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、干扰素、白介素、生长因子、病毒的被膜糖蛋白信号片段、烟草的nectarin信号肽(US5，939，288)、烟草的延伸蛋白信号、大豆的油质蛋白油状体结合蛋白信号、拟南芥的空泡样碱性甲壳酶信号肽、以及本发明的天然的信号序列。另外，本发明的核酸分子可以与融合信号相连接，所述融合信号能指导所表达的肽进入到蛋白体内，例如泛素融合片段。重组分子也可以含有位于本发明的核酸分子的核酸序列的周围和/或之内的插入的和/或未翻译的序列。宿主细胞本发明的另一个实施方式包括重组细胞，其包括经本发明的一种或多种重组分子所转化的宿主细胞。用任一可以将多核苷酸插入到细胞内的方法可以完成多核苷酸向细胞内的转化。转化技术包括，但不限于，转染、电穿孔、微注射、脂染、吸附、原生质体融合。重组细胞可以保持为单个细胞的生物体或者可以生长成组织、器官或多细胞的生物体。本发明的被转化的多核苷酸分子可以仍然保留在染色体外或者可以以保留所述多核苷酸分子被表达的能力的方式被整合到所转化的(即重组的)细胞的染色体内。尽管在此所讨论的肽具有抗真菌的或抗细菌的活性，可以从细菌的或真菌的宿主细胞中获得合适量的本发明的重组肽。更具体而言，肽可以被生成为融合蛋白，可以在从重组宿主细胞中回收到融合蛋白后将其加工处理。Hara和Yamakawa(1996)描述了这样一种系统的实例，其中从大肠杆菌中产生作为融合蛋白的B.morimoricin。从重组宿主细胞中收集融合蛋白，并用氰或0-邻氧碘苯甲酸将其裂解以便释放出生物学活性moricin肽。可以容易地设计出相似的系统，以便在细菌或真菌的宿主细胞内生成本发明的肽。进行转化的合适的宿主细胞包括任一可以用本发明的多核苷酸转化的细胞。本发明的宿主细胞可以是那些能够内源性地(即天然地)产生本发明的肽或者可以在被本发明的至少一种多核苷酸转化之后产生这样的肽的细胞。本发明的宿主细胞可以是任一能生成至少一种本发明蛋白的细胞，并包括细菌的、真菌的(包括酵母菌)、寄生虫的、节肢动物的、动物的和植物的细胞。宿主细胞的实例包括沙门氏菌、埃希氏菌、杆菌、李斯特菌、酵母菌、夜蛾、分支杆菌、蛾、BHK(幼仑仓鼠肾)细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、C0S(例如C0S-7)细胞、和Vero细胞。宿主细胞的其它实例是大肠杆菌包括大肠杆菌K-12衍生物、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌包括减毒株、草地夜蛾、粉纹夜蛾、BHK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS细胞、Vero细胞、以及非致癌性的成肌细胞G8细胞(例如ATCCCRL1246)。其它的合适的哺乳动物细胞宿主包括其它的肾细胞株、其它成纤维母细胞细胞株(例如人、小鼠或鸡胚胎的成纤维母细胞细胞株)、骨髓瘤细胞株、中国仓鼠卵巢细胞、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK细胞和/或HeLa细胞。特别优选的宿主细胞是植物细胞例如那些从DeutscheSamml皿gvonMikroorganismen皿dZellkulturenGmbH(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures)得至U的植物细胞。通过处理例如宿主细胞内的多核苷酸分子的拷贝数目、这些多核苷酸分子转录的效率、所形成的转录物的翻译的效率、和翻译后修饰的效率，可以用重组DNA技术提高所转化的多核苷酸分子的表达。用于增加本发明的多核苷酸分子的表达的重组技术包括，但不限于，多核苷酸分子与高拷贝数目的质粒的可操纵地连接、多核苷酸分子向一个或多个宿主细胞染色体内的整合、向质粒添加载体稳定性序列、对转录调节信号(例如启动子、操纵子、增强子)的取代或修饰、对翻译调节信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)的取代或修饰、对对应于宿主的密码子选择的本发明的多核苷酸分子的修饰、以及转录去稳定序列的缺失。转基因植物术语"植物"指的是整个植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、和植物细胞等。被预期用于本发明实践的植物包括单子叶植物和双子叶植物。优选地，转基因植物是商业上有用的农作物植物。靶农作物包括但不限于下面的种类谷类(小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、高梁和相关农作物)；甜菜(甜菜和饲料甜菜)；梨果、核果和软果(苹果、梨、梅、桃、杏仁、樱桃、草莓、覆盆子和黑莓)；豆科植物(豆、扁豆、豌豆、大豆)；油类植物(油菜、芥末、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)；黄瓜类植物(葫芦、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类水果(橙子、柠檬、葡萄柚、蜜桔)；蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、甘蓝、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯、辣椒)；樟科(酪梨、肉桂、樟脑)；或植物例如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、藤本植物、蛇麻花、覆草皮、香蕉、和天然橡胶植物，以及观赏植物(花卉、灌木、阔叶树和常绿植物例如针叶树)。特别优选的农作物包括豌豆、鹰嘴豆、小麦和大麦。在本发明的上下文中所定义的转基因植物包括植物(以及所述植物的一部分和细胞)和它们的子代，所述植物已经被重组技术所遗传修饰，造成了在所需植物或植物器官内产生至少一种本发明的肽。利用本领域已知的技术可以生成转基因植物，例如在A.Slateretal.，PlantBiotechnology_TheGeneticManipulationofPlants,OxfordUniversityPress(2003)，禾口P.ChristouandH.Klee，HandbookofPlantBiotechnology,JohnWileyandSons(2004)中所述的技术。可以在转基因植物的所有发育阶段中组成型地表达本发明的多核苷酸。根据植物或植物器官的用途，可以以阶段特异性的方式表达肽。此外，根据植物可以易感于真菌感染的特殊用途，可以组织特异地表达多核苷酸。在本发明中可以使用已知或已经发现能引起在植物中表达编码相关肽的基因的调节序列。对所用的调节序列的选择依赖于相关的靶植物和/或靶器官。这些调节序列可以从植物或植物病毒中获得，或者可以被化学合成。这些调节序列对于本领域人员是公知的。其它的调节序列(例如终止序列和多腺苷酸信号)包括任一在植物中发挥这些作用的序列，对这些序列的选择对于本领域人员是显而易见的。这些序列的一个实例是根瘤土壤杆菌的opaline合酶基因。可以得到一些用于将含有编码相关肽的核酸序列的表达构建体引入到靶植物内的技术。这些技术包括但不限于用钙/聚乙烯乙二醇法转化原生质体、电穿孔和微注射或(包被的)颗粒粒子轰击。除了这些所谓的直接DNA转化方法外，包括载体的转化系统也被广泛应用，例如病毒的和细菌的载体(例如来自土壤杆菌属的载体)。在选择和/或筛选之后，利用本领域已知的方法可以将已经被转化的原生质体、细胞或植物的一部分再生成整个植物。对于转化和/或再生技术的选择在本发明中并不重要。在Banzet等(2002)和EP798381中描述了表达抗真菌肽的转基因植物的实例。在每种情况中，重组抗真菌肽的表达造成了转基因植物可耐受真菌的感染。在这些文档中所罗列出的相似的方法可以被用于生产本发明的肽，所述肽赋予了转基因植物对真菌感染的抗性。转基因的非人动物用于生成转基因植物的技术在本领域是公知的。关于这个方面的有用的普通教科书是Houdebine，Transgenicanimals-GenerationandUse(HarwoodAcademic,1997)。例如可以将异源的DNA引入到受精的哺乳动物卵内。例如，用微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染或其它方法可以转化全能或多能干细胞，然后将所转化的细胞引入到胚胎内，然后胚胎发育成了转基因动物。在高度优选的方法中，用含有所需DNA的逆转录病毒感染发育中的胚胎，从受感染的胚胎中生成转基因动物。但是，在最为优选的方法中，合适的DNA优选地在单细胞阶段被共注射到胚胎的生殖核或细胞浆内，以及使得胚胎发育成成熟的转基因动物。另一种用于生成转基因动物的方法包括用标准方法将核酸微注射到前核阶段的卵内。然后在将其转移到假妊娠受体的输卵管之前培育受注射的卵。也可以用核转移技术生产转基因动物。利用这个方法，用整合了受调节序列控制下的相关的结合区或结合伴侣的编码序列的质粒稳定地转染来自供体动物的纤维母细胞。然后，将稳定的转染子与去核的卵母细胞融合，将其培育并转移到雌性的受体内。组合物本发明的组合物包括"可接受的载体"。可接受的载体优选地是所处理的动物、植物、植物或动物材料、环境(包括油状和水样本)所能耐受的任何物质。这些可接受的载体的实例包括水、盐水、林格液、葡萄糖溶液、Hank溶液、和其它水样的生理平衡的盐溶液。也可以使用非水性的载体例如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯、或甘油三酯。药物组合物含有治疗有效量的本发明的抗真菌肽。根据本领域已知的方法可以容易地确定出抗真菌肽的治疗有效量。药物组合物可以被制剂成含有治疗有效量的抗真菌肽以及适用于本领域已知的施用途径(局部、牙龈、静脉内、雾化吸入、局部注射)的药用可接受载体。对于农业应用，组合物包括治疗有效量的本发明的肽以及适用于所治疗的生物体(例如植物)的农业可接受的载体。短语"药用可接受载体"指的是当施用给动物(特别是哺乳动物，更特别是人类)时不会产生过敏的、有毒的或其它的不良反应的分子单体和组合物。药用可接受载体或稀释剂的有用实例包括但不限于不影响本发明的肽的活性的溶剂、分散介质、包被剂、稳定剂、保护性胶体、黏附剂、浓縮剂、触变剂、渗透剂、螯合剂、和等张剂和延迟吸收剂。通过使用包被例如卵磷脂，通过保持所需的颗粒大小(对于分散而言)以及通过应用表面活性剂可以保持正确的流动性。更为普遍的是，本发明的肽可以与对应于有用的制剂技术的任一无毒的固体或液体添加剂组合。本发明的液体组合物包括水溶性的浓縮剂、乳化的浓縮剂、乳剂、浓縮的悬浮液、喷雾剂、可湿性粉末(或用于喷雾的粉末)、糊剂和凝胶。可以使用作为用于撒粉(dusting)的粉末和颗粒的形式的本发明的肽，具体的是通过对颗粒载体的挤压、压縮、浸渗或通过对粉末、和泡腾片或锭剂的颗粒化所得到的粉末和颗粒。20表面活性剂也可以构成各种组合物中的一种组分。表面活性剂可以是等张或非等张类型的乳化剂、分散剂或湿化剂或这些表面活性剂的混合物。实例包括，但不限于，聚丙烯酸盐、木素磺酸酸盐、苯酚磺酸或萘磺酸酸盐、氧化乙烷与脂肪醇或脂肪酸或脂肪胺的縮聚物、取代酚(具体的是烷基酚或芳香酚)、硫化琥珀酸酯的盐、牛磺酸衍生物(具体的是烷基牛磺酸)、醇或酚的聚氧乙烯的磷酯、多元醇的脂肪酸酯、含有上述化合物的硫酸、磺酸和磷酸功能集团的衍生物。根据所处理的特殊病变和所选择的导向方法，可以制剂并全身或局部施用这些试剂。合适的途径可以包括例如口服、直肠、经皮、阴道、经粘膜、或肠道施用；肠外给药包括肌肉内、皮下、或髓内注射、以及鞘内、静脉内、或腹腔内注射。对于农业组合物，可以使用天然的或合成的、有机的或无机的物质，化合物可以与这些物质组合，以便有助于其应用于植物、种子或土壤。因此，该载体一般是惰性的，并且它应当是农业可用的，特别是可用于所处理的植物。该载体可以是固体(粘土、天然的或合成的硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料等)或者是液体(水、醇，特别是丁醇等)。通过用标准的农业技术例如喷雾法将抗真菌肽应用于植物部分或土壤或其它围绕在植物的根部周围的生长介质或者应用于植物的种子(在其被播种之前)可以实现植物病原体对抗真菌肽的暴露。所述肽可以以组合物的形式被应用于植物或植物生长介质，所述组合物包括与固体或液体稀释剂以及任选的各种佐剂例如表面活性剂混合在一起的肽。固体组合物可以是分散性粉末、颗粒、或谷粒的形式。本发明的组合物也可以被用于多种产品，所述产品包括但不限于手消毒皂、低敏的护手霜、洗发剂、洗面奶、洗衣用品、洗碗用品(包括barglassdip)、浴室洗涤用品、牙齿用品(例如漱口水、牙科粘胶、唾液注射滤器、水过滤器)以及去臭产品。本发明的一个实施方式是能将本发明的肽缓慢地释放到动物、植物、动物或植物材料、或环境(包括土壤和水样品)中的可控释剂型。控释剂型在此包括控释载体中的本发明的肽。合适的控释载体包括，但不限于，生物兼容的聚合物、其它聚合的基质、胶囊、微胶囊、微粒、弹丸制剂、渗透泵、弥散装置、脂质体、脂质球、和经皮转运系统。优选的控释剂型是生物可降解的(即生物可蚀解的)。优选地在范围为约1到约12个月的时间段内释放出制剂。本发明的优选的控释制剂优选地能影响治疗至少约1个月，更优选地至少约3个月，甚至更优选地至少约6个月，甚至更优选地至少约9个月，以及甚至更优选地至少约12个月。如本领域技术人员所知道的，经验上可以容易地确定出组合物中的肽、载体、或宿主细胞的有效浓度。US6，331，522提供了包括抗真菌肽的组合物的实例。技术人员可以容易地生成包括本发明的肽的相似的组合物。抗体本发明也提供了本发明的肽或其片段的单克隆的或多克隆的抗体。本发明还提供了用于生产本发明的肽的抗体的方法。本发明所用术语"抗体"包括完整分子以及其片段，诸如Fab，F(ab')2，和Fv，其能结合表位决定簇。这些抗体片段保持选择性结合本发明的肽的一些能力，其实例包括但不限于以下片段(l)Fab，所述片段保持抗体分子的单价抗原结合片段，能通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体来产生完整轻链和一个重链的一部分；(2)Fab'，这种抗体分子的片段可通过利用木瓜蛋白酶处理完整抗体，然后进行还原以产生完整轻链和部分重链来获得；每个抗体分子可获得两个Fab'片段；(3)(Fab')2，这种抗体片段可通过利用木瓜蛋白酶处理完整抗体而无需随后的还原来获得；F(ab)2是两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；(4)Fv，定义为包含表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的遗传改造的片段；(5)单链抗体(〃SCA〃)，定义为包含通过适宜多肽接头连接为遗传融合的单链分子的轻链可变区和重链可变区的遗传改造的分子；所述单链抗体可为多聚体诸如二价抗体，三价抗体和四价抗体等的形式，其可以是或不是多特异性的(见，例如，W094/07921和WO98/44001)，以及(6)单结构域抗体，通常是缺乏轻链的可变重链结构域。此外，所述抗体及其片段可为人源化的抗体，例如EP-A-239400中所述的那些。术语"特异性结合"指的是抗体与本发明的至少一种蛋白/肽结合但不与其它已知的moricin样肽例如W02005/080423所述的肽结合的能力。术语"表位"在此指的是抗体所结合的本发明的肽的一个区域。可以给动物施用表位以生成抗表位的抗体。但是，本发明的抗体优选地与整个肽背景中的表位区域特异性^口口。如果需要多克隆抗体，用免疫原性的肽免疫接种所选的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)。根据已知的方法，收集并处理被免疫动物的血清。如果含有多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，通过免疫亲和色谱法可以纯化多克隆抗体。用于生产和加工多克隆抗血清的技术在本领域是已知的。为了生成这些抗体，本发明也提供了被半抗原于用作动物中的免疫原的另一种肽的本发明的肽或其片段。本领域技术人员可以容易地生成针对本发明的肽的单克隆抗体。用杂交瘤制备单克隆抗体的常用方法学是公知的。通过细胞融合，以及通过其它技术例如致癌性DNA对B淋巴细胞的定向转化、或EpsteinBarr病毒的转染也可以生成永生的产抗体的细胞株。可以筛选单克隆抗体谱的各种性能例如同种型和表位亲和力。另一种技术包括筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在其被包被的表面上表达具有大量互补决定区(CDR)的scFv片段。该技术在本领域是公知的。本发明的抗体可以与固体支持物结合，和/或可以与合适的试剂、对照、说明书等等一起包装成合适容器中的试剂盒。优选地，本发明的抗体是被可检测标记的。容许直接检测抗体结合的示例的可检测标记包括放射性标记、荧光团、染料、磁珠、化学发光剂、胶状颗粒等。容许间接检测结合的标记的实例包括酶，其中底物可以提供显色的或荧光的产物。其它的示例的可检测标记包括共价结合的酶，其能在加入合适的底物后提供可检测的产物信号。用于缀合的适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。如果不能商品化获得，用本领域技术人员已知的技术可以容易地生成这些抗体_酶缀合物。更多的示例的可检测标记包括生物素(其以高亲和力与抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合)、荧光染料(例如22藻胆蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白、萤光素和Texas红)，它们可以与荧光激活细胞分选器、半抗原等一起使用。优选地，可检测标记(例如生物素)容许用于平板发光计中的直接检测。在本领域已知的检测本发明的肽的技术中可以使用这些标记抗体。用途本发明的肽在医学、兽医学、农学、食品防腐、家居和工业领域有着多种用途，其中它可用于减轻和/或预防真菌或细菌的感染。例如，本发明的肽可以被用于治疗真菌感染、和细菌感染(例如S.mutans、P.aeruginosa或P.gingivalis感染)的药物组合物。能适合于肽治疗的阴道、尿道、粘膜、呼吸道、皮肤、耳、口、或眼部的真菌或细菌感染包括，但不限于白色假丝酵母、伴放线放线菌、粘性放线菌、福氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、纤细拟杆菌、解脲拟杆菌、简要弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、生痰弯曲杆菌、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、溶组织梭状芽孢杆菌、啮蚀艾肯氏菌、纠缠真杆菌、具核梭杆菌、牙槽梭杆菌、微小消化链球菌、牙髓卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、变黑普里沃菌、短小棒状杆菌、铜绿假单胞菌、有害月形单胞菌、金黄色葡萄球菌、星座链球菌、格氏链球菌、中间链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、齿垢密螺旋体、食果胶密螺旋体、索氏密螺旋体、小韦荣(氏)球菌、禾口Wolinellasuccinogenes。对于农业应用而言，可以用抗真菌肽提高农作物在植物生命期内或在收获后农作物保存中的抗病性或耐病性。抑制了暴露于肽的病原体的生长。抗真菌肽可以消除已经生长于植物上的病原体或者可以保护植物避免未来的病原体攻击。病原体可以是任一生长在植物内或生长在植物周围的真菌。提高抗性被定义为与野生型植物相比较，植物或收获后的农作物增强了对真菌性病原体的耐受性。抗性可以是从疗效的轻微减低到完全消除，使得植物不受病原体存在的影响。因此，本发明的肽也可以被用于治疗和/或预防植物的真菌感染。这些植物真菌包括，但不限于，那些选自以下属的属链格孢属、壳二孢属、葡萄孢属、尾孢属、剌盘孢属、色二孢属、白粉菌属、镰孢属、小球腔菌属、顶囊壳属、长蠕孢属、壳球孢菌属、丛赤壳属、斜尖状孢子菌属、疱霉属、瘤梗孢属、疫霉属、单轴霉属、足球菌属、柄锈菌属、Puthium、核球壳素、梨孢属、腐霉属、丝核菌属、Scerotium、核盘菌属、壳针孢属、根串株霉、钩丝壳属、黑星菌属、和轮枝孢属。可以被本发明的肽所治疗的植物真菌感染的特殊实例包括谷类植物的小麦白粉病、葫芦的菊科白粉病和瓜类白粉病、苹果的苹果白粉病、葡萄藤的葡萄白粉病、棉花、苹果、水稻和草皮的丝核菌属感染、谷类植物和甘蔗的黑粉菌属感染、苹果的苹果黑星菌、谷类植物的长蠕孢菌属感染、小麦的颖枯病菌、大麦的Rhynchosporiumsecalis感染、草莓、番茄和葡萄的灰霉病菌感染(灰霉)、落花生的花生褐斑病菌感染、或各种农作物的其它斜尖状孢子菌属感染、小麦和大麦的Pseudocercosporellaherpotrichoides感染、水稻的稻瘟霉感染、马铃薯和番茄的晚疫病菌感染、各种植物中的镰孢(霉)属(例如尖孢镰孢)和轮枝孢属感染、葡萄的霜霉病、水果和蔬菜的链格孢属感染、黄瓜的霜霉病、香蕉的黑条叶斑病菌感染、芸苔的小球腔菌属感染、以及各种农作物的Colleotrichum感染。本发明的抗真菌肽也可以用作防腐剂，以便保持食物制品例如奶酪、面包、蛋糕、肉、鱼、饯、动物食品等的新鲜度和储存期。抗真菌肽也可以被用于抗微生物的食品包装例如涂覆于塑料或聚合物或结合于可食用的涂层或膜。例如，肽包被或膜可以含有足够量的用于这些产品例如奶酪、糖、毛织物等的抗真菌肽。实施例实施例1:肽纯化材料和方法昆虫用人工食谱喂养大蜡螟(蜡螟)。给末龄期幼虫注射10i！1各含有近106个细胞的大肠杆菌和藤黄微球菌的水。作为对照，给一些幼虫注射10yl磷酸缓冲液。在通过去除腹足提取血淋巴之前，将幼虫在室温下放置48个小时。在冰上将血淋巴收集于含有一些苯硫脲结晶的试管内，离心5分钟以便去除细胞碎片，并将其冷冻在-80°C。抗真菌和抗细菌活性检测利用抑制带板检测法测试样品的活性。对于细菌(大肠杆菌和藤黄微球菌)，用营养琼脂(0xoid)以及近5Xl(f个细胞/ml的细胞密度制备培养板。对于真菌，用含有0.8%琼脂糖的YPD肉汤(10g/L酵母提取液、10g/L蛋白胨、40g/LD-葡萄糖)以及近l(f个孢子/ml的孢子密度制备培养板。为了测试活性，将2iU相关样品点斑到板的表面上，生物体在合适的条件(对于细菌是37t:下过夜，对于真菌是室温下l-3天)下生长，直到可以检测出是否存在清除带。被测试的真菌是禾谷镰孢、尖孢镰孢、链格孢、狂犬壳二孢、胶孢炭疽菌、十字花科小球腔菌以及黑曲霉。肽纯化用C18固相提取分别处理两种来自不同的大蜡螟免疫接种的粗制血淋巴。用等体积的O.1%三氟乙酸(TFA)稀释融化的血淋巴(1.8ml或4.8ml)，并在冰上摇晃30-45分钟。将样品装到C18固相萃取柱(Maxi-Clean，300或900mgcartridges,Alltech)上。用20%乙腈/0.05%TFA洗涤，并用60%乙腈/0.05%TFA洗脱。在Speedvac(Savant)中干燥洗脱的样品，并重悬于100iU水中。利用上述的板检测法测试样品抗大肠杆菌、藤黄微球菌和各种真菌的活性。重悬的血淋巴样品装入到在检测225或215nm的吸光度的SystemGoldHPLC(Beckman)上运行的JupiterC18、5um、300A、250X10mmsemi-pr印柱(Phe謹e證)中。所述的柱经溶剂A(2X乙腈、0.065%TFA)平衡的并用梯度为0_70%溶剂B(95%乙腈、0.05%TFA)在70分钟内以5ml/min的速度进行洗脱。所有层析步骤的的活性部分通过如下方法选择在Speedvac中干燥每5ml部分中的30-500ii1，重悬于10ii1水，并测试抗禾谷镰孢的活性。来自semi-pr印柱的活性部分通过反相层析的数个步骤进一步纯化。对于Gm-moricinD而言，用等体积的0.05%TFA稀释活性部分，并装入到HPLC中的经10X溶剂B平衡的ProsphereC18、5iim、300A、250X4.6mm分析柱(Alltech)中。在60分钟内，用以lml/min速度流动的梯度为15-55%B洗脱柱。活性部分随后用等体积的0.05%TFA稀释相关部分，并装入到iiRPCC2/C18、3iim、100X2.lmm分析柱(AmershamBiosciences)中。该柱用在SMART系统(AmershamBiosciences)中运行的溶剂A平衡，并用以200ii1/min流动的梯度为0-100%溶剂B洗涤柱子，同时在215、254和280nm处进行Gm-moricinC3以与Gm-moricinD相似的方式纯化，但来自C2/C18柱的部分直接针对禾谷镰孢检测。肽鉴定利用0.5ill样品加上0.5ill基质，用VoyagerEliteMALDI-T0F质谱法(Pers印tiveBiosystems)分析相关部分。对于线性模式谱，基质是芥子酸以及标准物是cecropinA和肌红蛋白的混合物，对于反射模式谱，基质是a-氰基_4_羟基苯丙烯酸以及标准物是牛血清白蛋白的胰蛋白酶消化物。对于N末端的氨基酸测序，在纤维玻璃盘上干燥纯化的肽，格局产品说明书，利用ProciseModel492蛋白测序仪(AppliedBiosystems)进行Edman降解。结果和讨论用C18固相提取和C18半制备色谱法处理两批不同的粗制血淋巴。经C18固相提取部分纯化后所得到的样品显示出抗大肠杆菌、藤黄微球菌、禾谷镰孢、链格孢菌、狂犬壳二孢、胶孢炭疽菌、十字花科小球腔菌以及黑曲霉的活性。对样品在C18半制备柱上的纯化产生在近25-40%乙腈之间所洗脱出的部分，该部分显示出了抗测试生物体禾谷镰孢的活性。在C18分析柱中进一步地纯化在不同的梯度位置上所得到的两个部分。对于Gm-moricinC3，C18分析柱上的纯化产生两个表现出抗禾谷镰孢活性的部分。汇集这些部分并在C2/C18柱上进行进一步的纯化，产生三个具有抗禾谷镰孢活性的部分。其中一个具有经质谱法确定出的足够高纯化的部分被用于经Edman降解的测序。对于Gm-moricinD，C18分析柱上的纯化产生两个表现出抗禾谷镰孢活性的部分。一个部分在C2/C18柱上进行进一步的纯化，产生两个具有抗禾谷镰孢活性的部分。其中一个具有经质谱法确定出的足够高纯化的部分被用于经Edman降解的测序。MALDI质谱法和Edman测序被用于鉴定纯化的肽。Gm-moricinC3具有的表观分子量为3923.0Da以及部分氨基酸序列是KVPIGAIKKGGKIIKKGLGVIGAAGTAHEVYS(SEQIDNO:23)。注意与Gm-moricinC3共纯化的Gm-moricinCl(SEQIDNO:41的残基26-63;分子量3932.3Da)。Gm-moricinD的表观分子量为3832.8Da，以及部分氨基酸序列是KGIGSALKKGGKIIKGGLGALGAIGTGQQVYE(SEQIDNO:24)。利用BLASTP对非冗余数据库进行短配对的搜索发现这两种肽与来自家蚕和其他鳞翅昆虫的已知肽moricin具有一些相似性。实施例2:对编码大蜡螟moricin样肽的cDNA的鉴定总RNA和多聚(A)+RNA的制备在注射大肠杆菌和藤黄微球菌细胞悬浮液之后24小时，从大蜡螟中切割下脂肪体组织。将已经在冰上冷却至少30分钟的幼虫钉在Sylgard皿中的冰冷PBS下，并沿背中线下的纵向切口打开。用精细的制表镊去除肠道并收集脂肪体。将切割下的脂肪体简单地点吸于吸附组织上，并且在放置于液氮中的微量离心管中进行速冻。将冻存的组织储存在-80°C。用Trizol试剂(Astralscientific)分离出总RNA。简单地，将近500mg冷冻的脂肪体组织重悬于lmLTrizol试剂中，并在Polytron组织匀浆器中进行匀浆。利用mRNA纯化试剂盒(AmershamBiosciences)，通过两轮寡(dT)-纤维素旋转柱层析的选择分离出多腺苷酸化的RNA。根据产品说明书，将近lmg总RNA结合于寡(dT)-纤维素旋转柱，洗涤，并在lmL低盐缓冲液中进行洗脱。如上所述，将所洗脱的RNA结合于第二个旋转柱上，洗涤并洗脱，终体积为lmL。通过加入终浓度为0.1M的乙酸钠以及200ill乙醇沉淀出mRNA。通过离心回收mRNA，并将其重悬于5y1DEPC处理过的水中。cDNA文库的制备利用LambdaUniZ即cDNA合成和克隆系统(Stratagene)，从近5ygmRNA中制备出cDNA文库。将纯化的cDNA(近20ng)与1yg载体DNA连接，并用Gigapack⑧HIGold包装提取物(Amershamscientific)进行包装，以便生成滴度为每mL5乂105个菌斑形成单位的cDNA文库。在cDNA文库中通过PCR鉴定Gm_moricinC4，Gm_moricinC5和Gm-moricinDGm-moricinC3-C5和Gm-moricinD的寡核苷酸序列通过PCR利用兼并引物然后是利用特异性引物的PCR从cDNA文库扩增序列来确定。引物序列显示于表2。表2.用于分离大蜡螟moricin基因的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>引物名称引物序列GmDutr35'-TATTTGAGACAACTGGCTG-3'(SEQIDN0:68)GmDint55'-CTCAAGAAAGGCGGCAAAAT-3'(SEQIDN0:69)GmDR55'-ACCGATGGCTCCTAATGCT-3'(SEQIDN0:70)GmCint55'-GGTCAAGCCGACCCTAAGGTGCC-3'(SEQIDN0:71)GmCint35'-GGCTATATACTTCAGTGCGCTGT-3'(SEQIDN0:72)GmDint3ex5'-ATAGTCGAGAAATGGCAAAAT-3'(SEQIDN0:73)GmDint5ex5'-CTGCGCTATCGGCATACACTA-3'(SEQIDN0:74)对于Gm-moricinD，从所述肽的部分氨基酸序列设计的兼并引物(GmD-l，GmD-R)首先用于通过PCR从cDNA扩增产物。从该序列(GmDF3，GmDR5)设计的引物与载体引物一起用于巢式PCR中以确定所述基因的5'和3'区。随后设计第三组特异于5'和3'未翻译区(GmDutr5，GmDutr3)的引物并用于确定完整开放读框。Gm-moricinC3是利用巢式PCR在cDNA文库中发现的，其中利用搜索内含子(见下文)时获得的序列设计的特异性引物对(GmC3R5，GmC3R5r;GmC3F3，GmC3F3r)以及载体引物来确定所述基因的5'和3'区。随后利用特异于5'和3'非翻译区(GmC3utr5，GmC3utr3)的引物通过PCR获得全长序列。Gm-moricinC4和C5通过巢式PCR利用从以前鉴定的PCR产物的非翻译区(GmC3ulf，GmC3u2r;GmC3ulf，GmC3u4r;GmC3ul3f)设计的引物以及载体引物发现。为了检测Gm-moricin基因中的内含子，基因组DNA利用QuantumPr印AquapureGenomicDNA试剂盒(Bio-Rad)分离自大蜡螟。设计为与基因的5'和3'区域退火的引物对(GmCint5，GmCint3;GmDint5，GmDR5)用于对基因组DNA或cDNA文库池的两步PCR反应中。反应产物经纯化，连接入pGEM-TEasy(Promega)。对于Gm-moricinD，额外的内部引物(GmDint5ex，GmDint3ex)用于获得完整的内含子序列。结果和讨论对于Gm-moricinC3和Gm-moricinD，Edman降解确定的部分氨基酸序列与分离自大蜡螟fatbodycDNA文库的翻译的核苷酸序列的部分相同(图1-4)。这允许从相应的核苷酸序列提取这些肽的预测的开放读框。对于Gm-moricinC4和Gm-moricinC5，核苷酸序列通过PCR从大蜡螟fatbodycDNA文库获得(图5)。氨基酸序列从这些核苷酸序列的预测的开放读框翻译。内含子数据的分析对于区分各种moricin的独立基因和等位基因变体是重要的。单个内含子通过PCR对于Gm-moricinC4(347bp)，Gm-moricinC5(336bp)，和Gm-moricinD(1072bp)鉴别，但不能对于Gm-moricinC3鉴别。所述内含子都在成熟氨基酸序列的相同位置出现，即残基14之后。Gm-moricinC4和Gm-moricinC5的内含子有17个核27苷酸不同。核苷酸、氨基酸以及内含子序列与质谱数据的相关性允许鉴定Gm-moricinC3(图1)，Gm-moricinC4，Gm-moricinC5(图5和6)以及Gm-moricinD(图2-4)的完整序列。全长肽的长度为63个残基，并且大蜡螟中的成熟肽于裂解后在残基26开始(在序列ADP或AEP之后)。该过程与SignalP的预测以及其他昆虫抗微生物肽的知识(Boman，etal.，1989)一致。所有目前已知的moricin的ClustalW比对显示于图7。基于成熟肽序列的比对的系统发生树的构建(图7)表明Gm-moricinCl-C5肽都紧密相关。Gm-moricinD与L.obliquamoricin转录物以及家蚕蛾moricinBl-B8肽簇聚(cluster)。对于Gm-moricinC3，没有鉴定等位基因变体。最接近的已知Gm-moricinC3相关物是Gm—moricinCI禾口Gm—mo:ricinC2。成熟Gm—mo:ricinC3与Gm—moricinCI禾口Gm—mo:ricinC2分别具有97%和92%相同性。对于Gm-moricinC4和Gm-moricinC5，核苷酸序列相差4个碱基(2%)(图5)，成熟氨基酸序列相同(图6)。然而，Gm-moricinC4和Gm-moricinC5由于其内含子相差17个核苷酸而被分类为不同的基因。尽管没有作为肽而分离，通过对大蜡螟血淋巴中的蛋白酶片段的LC/MS检测显示成熟Gm-moricinC4和Gm-moricinC5序列得以表达。成熟Gm-moricinC4和Gm-moricinC5与Gm-moricinCl84%相同，与Gm-moricinC281%相同，并且由于在成熟序列中的位置16具有苏氨酸残基而在moricin家族中是独特的(图7)。对于Gm-moricinD，PCR实验鉴定了两个不同的序列，其可能是等位基因变体(图2和3)。这些序列之一符合实验确定的氨基酸序列(Gm-moricinD)，另一个序列(Gm-moricinDl)由于仅仅5个核苷酸取代而不同(2.6%)。这些差异中的两个在肽开放读框中并导致两个改变的氨基酸(V14L，K34R)(图3)。成熟Gm-moricinD与Gm-moricinCl和Gm-moricinC2分别具有57和63%相同性。除了大蜡螟，Gm-moricinD与未标注的L.obliqua转录物的翻译序列具有57%相同性，并与来自B.mori的moricinBl-B8肽具有44-47%相同性(Cheng，etal.，2006)。L.obliquamoricin仅仅被鉴定为EST并且没有作为肽而研究。没有发现家蚕蛾moricinBl-B8肽表达的证据，无论是通过RT-PCR(Cheng，etal.，2006)或是EST文库中转录物的存在。在包含L.obliqua转录物和家蚕蛾moricinBl-B8肽的moricin亚组中，Gm-moricinD是第一个被分离并显示具有任何活性，具体是抗真菌活性的肽。实施例3:合成的大蜡螟Gm-moricinD的抗各种真菌的活性利用标准的肽合成技术，用Ausp印(Melbourne,Australia)合成moricinD(SEQIDNO:7)。测试了该肽抗细菌大肠杆菌和藤黄微球菌，以及抗如在实施例1中所述的真菌禾谷镰孢、链格孢、狂犬壳二孢和十字花科小球腔菌的孢子的活性。所测试的浓度是O.1、1、10和100iiM以及1iig/ill。Gm-moricinD显示在1yg/对大肠杆菌和藤黄微球菌没有活性，但对禾谷镰孢的孢子在10M水平，以及对十字花科小球腔菌、链格孢和狂犬壳二孢的孢子在在100iiM水平显示活性。对Gm-moricinD的抗真菌活性的显示是以下亚组中的moricin肽的任何功能作用的第一证据Gm-moricinD，家蚕蛾moricinBl_B8和L.obliquamoricin。实施例4:合成大蜡螟Gm-moricinC3和Gm-moricinC4/C5的抗各种真菌的活性Gm-moricinC3(SEQIDNO:5)和Gm—moricinC4/C5(SEQIDNO:l禾PSEQIDNO:3)通过Ausp印(Melbourne,Australia)利用标准肽合成技术来合成。检测所述肽抗大肠杆菌和藤黄微球菌的活性以及抗实施例1中所述的真菌禾谷镰孢、链格孢和十字花科小球腔菌的孢子的活性。所测试的浓度是0.I，I，IOand100iiM，和liig/iil。Gm-moricinC3显示在100M对大肠杆菌和藤黄微球菌以及链格孢和十字花科小球腔菌的孢子具有活性，以及在10iiM水平对禾谷镰孢的孢子具有活性。Gm-moricinC4/C5肽在100yM显示抗革兰氏阴性菌大肠杆菌的活性，但在达1Pg/yl的受试浓度对革兰氏阳性细菌藤黄微球菌没有活性。Gm-moricinC4/C5肽对与真菌链格孢和十字花科小球腔菌的孢子在100yM具有活性，但是对于真菌禾谷镰孢的孢子没有活性。实施例5:抗真菌肽在拟南芥中的表达用大蜡螟Gm-moricinD基因对拟南芥进行土壤杆菌介导的转化将编码Gm-moricinD的DNA克隆到土壤杆菌转移载体p277(来自CSIROPlantIndustry,Canberra,Australia)内。通过将pART7的Notl片段插入到pART27内构建出了该载体(Gleave，1992)。P277载体含有用于植物表达的CaMV35S启动子和OCS终止子，用于抗生素选择的标记物、以及植物转化所需的序列。选出Gm-moricinDDNA构建体，将其转化到拟南芥内无信号肽的成熟Gm-moricinD、包括其天然信号肽的全长Gm-moricinD、以及由拟南芥空泡碱性壳质酶信号肽以及成熟Gm-moricinD序列构成的融合物。通过PCR合成这些构建体，并将其直接克隆到P277转移质粒内。利用三亲本杂交法实现了土壤杆菌GV3101的转化。这包括在非选择性的LB板上共同划线培养根瘤农杆菌GV3101、带有辅助质粒RK2013的大肠杆菌、和带有所需重组p277质粒的大肠杆菌。2『C下的过夜孵育产生混合培养物，收集并将其稀释，划线铺板到LB板上，这就选择出了带有p277重组质粒的根瘤农杆菌GV3101。用标准的方法在23t:、每天日照18个小时的条件下培养拟南芥植物。通过花浸渍进行对拟南芥植物的转化。植物生长到3-5周大，其中多个花茎上将出现处于不同发育阶段的花。将转化根瘤农杆菌GV3101的过夜培养物碎片化并将其重悬在含有湿化剂Silwet-77的5X蔗糖中。将花浸渍到细菌悬浮液中，并用摆动运动将其充分浸湿。将植物包装在塑料膜内，并将其在试验台面上室温下放置过夜，在开包之前将其放回到恒温在2rC的植物生长箱内。在l-2周后重复浸渍，以便增加转化种子的数目。在浸渍后3-4周收集种子，对于每种生态型，将其种子被膜干燥一段适宜长的时间，然后将种子灭菌并在含有选择性抗生素和抗真菌剂的Noble琼脂板上发芽。将阳性的转化体移到Arasystem罐(Betatech)内，在Araconsystemsleeves中生长到成熟，并仔细地收集种子。用PCR筛选转化的拟南芥植物(Tl代)，以便确认重组基因的存在。利用Extract-N-Amp植物PCR和Extract-N-AmpReagent试剂盒(Sigma)从经全长Gm-moricinD构建体所转化的植物的叶子中提取出基因组DNA。利用特异于Gm-moricinD基因的引物。将Tl幼苗移植并经两代培育成种子，以便最终分离出纯合的T3种子。然后可以筛选T3植物是否增加了对真菌性疾病的抗性(见下文)。T3植物也可通过逆转录酶PCR(RT-PCR)筛选来证实重组基因的表达。利用全长Gm-moricinD构建体转化的植物被随机选出用于分析。来自这些植物的叶子被快速冷冻并在液氮中利用研钵和研棒磨碎。利用RNeasyPlant试剂盒(Qiagen)分离RNA。从RNA利用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)制备cDNA。利用以下物质进行PCR:1illcDNA，重组Taq聚合酶(Invitrogen)，退火温度54°C，Gm-moricinD特异性引物。3y1每种25y1PCR反应显示于1.2%琼脂糖凝胶上。利用尖孢镰孢的接种方案从J.Manners(CSIROPlantIndustry,Queensland,Australia)得至lj了已知X寸于拟南芥为致病性的尖孢镰孢株。将真菌分离株可保持在1/2强度的PotatoDextroseAgar(PDA)上。从保持储存液中取出核心，并将其用于接种500mlPotatoDextroseBroth(PDB)。在摇晃器中28t:下孵育培育瓶7天。在用血细胞计数仪进行定量之前，经Miracloth排空接种物。用无菌的蒸馏水稀释孢子，将其用于接种拟南芥株。培育一些生态型的拟南芥进行测试，所述拟南芥包括ColumbiaO(Col_0)、Landsbergerecta(X-er)合Sg-l(来自CSIROPlantIndustry,Canberra,Australia)。将用于接种的拟南芥植物一个一个地在"jiffy"盆中生长近2-3周。在感染前近4天，停止给植物浇水。通过将5ml重悬浮的孢子直接地加入到邻近植物茎部的土壤中从而产生4X105-2X106孢子的总剂量，接种拟南芥植物。将植物孵育在25t:下，并在孵育后14天中对枯萎症状和/或死亡进行积分。为了进一步地表征特异的基因型所引起的疾病水平，用一组寡核苷酸引物(见W02005/080423的实施例4)扩增尖孢镰孢的18SrRNA的区域。引物显示与拟南芥RNA从很少同源性到没有同源性，并且作用为显示出与植物RNA比较时的真菌RNA水平的差异。本领域人员知道，在不脱离所广泛描述的发明的精神或范围的情况下，可以对在具体实施方式中所示的
发明内容进行很多变异和/或修饰。因此，这些实施方式不论在哪个方面都仅仅被认为是作为举例说明的，而不是限制的。将上面所讨论的所有文献的全部内容都并入本申请。本申请要求AU2007901600的优先权，其全文包含在此作为参考。对本说明书中已经包含的文档、技术、材料、设备、文章等的任何讨论都只针对于给本发明提供背景知识的目的。这并非承认因其存在于本申请的各个权利要求的优先权日之前，这些内容中任一内容或全部内容便构成了现有技术基础的一部分或者是本发明所属领域中的公知常识。参考文献Banzet，N.etal.(2002)PlantSci.，162;995—1006.Boman，H.G.etal.(1989)J.Biol.Chem.，264;5852—5860.Cheng，T.etal.(2006)Genomics,87;356-365.DeLucca，A.J.，andWalsh，T.J.(1999)Antimicrob.AgentsChemother.，43;1-11.Gleave，A.P.(1992)PlantMol.Biol.，20;1203-1207.Hara，S.andYamakawa，M.(1995)J.Biol.Chem.，270;29923-29927.Hara，S.andYamakawa，M.(1996)Biochem.Biophys.Res.Co匪n.，220;664-669.Harayama，S.(1998)TrendsBiotech.，16;76—82.Hemmi，H.，Ishibashi，J.，Hara，S.andYamakawa,M.(2002)FEBSLetters,518;33-38.30Needleman，S.B.andWunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.，48;443-453.权利要求一种基本上纯化的肽，其包括选自以下一组的序列i)SEQIDNO1和SEQIDNO3所示的氨基酸序列；ii)与SEQIDNO1和/或SEQIDNO3具有至少85％相同性的氨基酸序列；iii)SEQIDNO5所示的氨基酸序列；iv)与SEQIDNO5具有至少98％相同性的氨基酸序列；v)SEQIDNO7或SEQIDNO9所示的氨基酸序列；vi)与SEQIDNO7和/或SEQIDNO9具有至少64％相同性的氨基酸序列；vii)i)到vi)中任一项的生物学活性片段；和viii)包括i)到Vii)中任一项的氨基酸序列的前体，其中所述肽或其片段具有抗真菌的和/或抗细菌的活性。2.权利要求l的肽，其可纯化自昆虫。3.权利要求1或2的肽，其可纯化自螟蛾科的鳞翅昆虫。4.权利要求1到3中任一项的肽，其中所述肽具有针对真菌的抗真菌活性，所述真菌选自禾谷嫌抱(Fusariumgraminearum)、尖抱嫌抱(Fusariumoxysporum)、狂犬壳二抱(Ascochytarabiei)禾口十字花禾斗小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)。5.权利要求1到4中任一项的肽，其与至少一种其它的多肽/肽序列融合。6.—种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括选自以下一组的序列i)SEQIDNO:11-20之一所示的核苷酸序列;ii)编码权利要求1到5中任一项的肽的序列；iii)与SEQIDNO:11-14中至少一个具有至少85%相同性的核苷酸序列；iv)与SEQIDNO:15禾P/或SEQIDNO:16具有至少98%相同性的核苷酸序列；v)与SEQIDNO:17-20中至少一个具有至少64%相同性的核苷酸序列；禾口vi)在严格条件下与i)到v)中任一项杂交的序列。7.权利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗真菌和/或抗细菌活性的肽。8.—种载体，其包括权利要求6或权利要求7的多核苷酸。9.一种宿主细胞，其包括权利要求6或权利要求7的多核苷酸、或权利要求8的载体。10.权利要求9的宿主细胞，其是植物细胞。11.制备权利要求1到5中任一项的肽的方法，所述方法包括在使得编码所述肽的多核苷酸表达的条件下培育权利要求9或10的宿主细胞，以及回收所表达的肽。12.特异性结合权利要求1到5任一项的肽的抗体。13.—种组合物，其包括权利要求l到5中任一项的肽，权利要求6或7的多核苷酸，权利要求8的载体，权利要求9或10的宿主细胞和/或权利要求12的抗体，以及一种或多种可接受的载体。14.一种用于杀死真菌和/或细菌、或抑制真菌和/或细菌生长和/或繁殖的方法，所述方法包括将所述真菌和/或细胞暴露于权利要求1到5中任一项的肽。15.—种转基因植物，所述植物已经用权利要求6或7的多核苷酸转化，其中所述植物产生权利要求1到5中任一项的肽。16.—种控制农作物的真菌和/或细菌感染的方法，所述方法包括培育权利要求15的转基因植物的农作物。17.—种转基因的非人动物，所述动物已经用权利要求6或7的多核苷酸转化，其中所述动物产生权利要求1到5中任一项的肽。18.—种治疗或预防患者体内的真菌和/或细菌感染的方法，所述方法包括给患者施用权利要求1到5中任一项的肽。19.权利要求1到5中任一项的肽在生产用于治疗或预防患者体内的真菌和/或细菌感染的药物中的用途。20.—种试剂盒，包含权利要求1到5中任一项的肽，权利要求6或7的多核苷酸，权利要求8的载体，权利要求9或10的宿主细胞，权利要求12的抗体和/或权利要求13的组合物。21.—种用于杀死真菌、或抑制真菌的生长和/或繁殖的方法，所述方法包括将真菌暴露于一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列；i)包括SEQIDNO:44-48之一的残基28到65的氨基酸序列；ii)包括SEQIDNO:49的残基26到63的氨基酸序列；iii)包括SEQIDNO:50-52之一的残基26到66的氨基酸序列；iv)与i)到iii)中任一项具有至少50%相同性的氨基酸序列；禾口v)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。22.—种控制农作物的真菌感染的方法，所述方法包括培育转基因植物的农作物，所述转基因植物产生一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQIDNO:44-48之一的残基28到65的氨基酸序列；ii)包括SEQIDNO:49的残基26到63的氨基酸序列；iii)包括SEQIDNO:50-52之一的残基26到66的氨基酸序列；iv)与i)到iii)中任一项具有至少50%相同性的氨基酸序列；禾口v)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。23.—种治疗或预防患者体内的真菌感染的方法，所述方法包括给患者施用一种肽，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQIDNO:44-48之一的残基28到65的氨基酸序列；ii)包含SEQIDNO:49的残基26到63的氨基酸序列；iii)包括SEQIDNO:50-52之一的残基26到66的氨基酸序列；iv)与i)到iii)中任一项具有至少50%相同性的氨基酸序列；禾口v)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。24.—种肽在生产用于治疗或预防患者体内的真菌感染的药物中的用途，所述肽包括选自以下一组的序列i)包括SEQIDNO:44-48之一的残基28到65的氨基酸序列；ii)包括SEQIDNO:49的残基26到63的氨基酸序列；iii)包括SEQIDNO:50-52之一的残基26到66的氨基酸序列；iv)与i)到iii)中任一项具有至少50%相同性的氨基酸序列；禾口v)i)到iv)中任一项的生物学活性片段。全文摘要本发明涉及抗真菌的和/或抗细菌的肽，特别是从昆虫(特别是鳞翅昆虫)中获得的抗真菌活性的肽。本发明也提供了使用这些抗真菌肽治疗或预防真菌生长的方法，所述方法可以被用于各种目的，例如预防植物的真菌感染，治疗动物(特别是人)的真菌感染，和预防食物腐败变质。文档编号C07K16/12GK101743251SQ200880017422公开日2010年6月16日申请日期2008年3月26日优先权日2007年3月26日发明者P·D·伊斯特,S·E·布朗申请人:联邦科学技术研究组织;粮食研究发展公司