具有降血压活性的肽的制作方法

专利名称：具有降血压活性的肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有降血压活性的内源性新的肽或其类似物。
背景技术：
内源性生理活性肽的研究始于1921年胰岛素的鉴定，迄今为止很多内源性肽在 包括人在内的高等生物中被鉴定(非专利文献1)。这些内源性生理活性肽不是仅具有 单一的生理作用，很多肽因靶脏器的不同而显示不同的作用。例如，已知生长素释放肽 (ghrelin)作用于下垂体而显示促进另一种内源性生理活性肽即生长激素分泌的作用，并 且作用于下丘脑而显示摄食亢进作用等，具有各种各样的功能(非专利文献2)。此外，已知 肾上腺髓质素(adrenomedullin)作用于血管而显示血管扩张作用，并且作用于下垂体而 抑制另一种内源性生理活性肽即ACTH的分泌等，具有各种各样的功能(非专利文献3)。进而，除了上述生长素释放肽、肾上腺髓质素以外，关于内源性生理活性肽的研 究不断发展，阐明了 某些生理活性肽控制其他肽的作用表达，多种肽互相控制彼此的作 用而形成复杂的网络(network)，从而调节生物体机制等。例如，据报道，在摄食和生物 体内的能量平衡中，显示摄食亢进作用的内源性生理活性肽即生长素释放肽、刺鼠相关肽 (agouti-relatedp印tide)、神经肽Y以及显示摄食抑制作用的肽即肽YY、胆囊收缩素、瘦 素、黑皮质素、胰岛素在末梢和中枢之间进行信息传递并控制彼此的作用(非专利文献4)。另一方面，内源性生理活性肽还被用于疾病的治疗。例如，胰岛素被用作糖尿病治 疗药，甲状旁腺激素的活性片断被用作骨质疏松症的治疗药，心房肽(ANP)被用作急性心 力衰竭治疗药。由于利用这些内源性生理活性肽的药物具有难以被低分子化合物替代的作 用机制，同时利用生物体内原本存在的物质而实现生物体机制的正常化，因此被认为安全 性优异。因此，新的内源性生理活性肽的鉴定不仅是指发现具有生理活性的新的物质，而 且与新的生物体机制的阐明相关，进而，还与基于新的作用机制的新的疾病治疗法相关。作为一般的内源性生理活性肽的鉴定手法，已知如下方法以对各种评价体系的 作用作为指标，从生物体组织提取物中分离和纯化肽的手法。迄今为止，利用肠道等中的平 滑肌的松弛收缩等对摘出脏器的作用(非专利文献5、6)、培养细胞中的cAMP、Ca离子等细 胞内第二信使的变动(非专利文献7)等作为评价体系，不断鉴定了新的生理活性肽。近年 来，将利用基因组解析而鉴定和预测的配体未知的受体在培养细胞中强制表达，并利用细 胞内第二信使的变动(非专利文献8、9)、细胞外花生四烯酸代谢物量的变化(非专利文献 10)、细胞外酸化率的变化(非专利文献11)等作为评价体系，鉴定了新的内源性生理活性 肽。除此之外，还使用了充分利用最先进的科学技术如受体或受体结合蛋白的细胞内局部 存在变化(非专利文献12)、或细胞内介电谱的变化(非专利文献13)等的评价体系。但是，即使是现在，还存在很多配体未鉴定的G蛋白共轭型受体，其中27种受体被 推测为以肽作为配体(非专利文献14)。由于内源性生理活性肽在生物体内只微量存在，不 稳定且容易分解，因此即使采用最先进的科学技术，也不容易鉴定新的内源性生理活性肽。
另一方面，由于内源性生理活性肽由基因编码，因此，还利用基因组序列等进行信息学预测的尝试。具体而言，以在已知的内源性生理活性肽和前体中发现的序列上的特征 作为指标，从基因组序列和cDNA序列预测新的内源性生理活性肽序列，再通过化学合成对 所预测的肽进行大量制备，并且利用各种评价体系来评价有无生物活性。实际上，以与已知 的内源性生理活性肽的序列同源性(非专利文献15)或经常在内源性生理活性肽中发现的 羧基末端RF酰胺基序(motif)(非专利文献16 18)等作为指标，并通过信息学手法鉴定 了新的内源性生理活性肽。进而，还通过将已知的内源性生理活性肽及其前体中共同的多 种序列特征组合的方法(非专利文献19、20)，鉴定了新的内源性生理活性肽。但是，通过上述方法能够预测的肽仅限于与现有的内源性生理活性肽类似的肽， 期望更宽范围的内源性生理活性肽的预测方法。通常，内源性生理活性肽作为前体蛋白质的部分序列被基因编码，只有前体蛋白 质通过激素原转化酶在特定的位置被切断而产生的特定的分子具有生理活性。因此，在对 与已知内源性生理活性肽不相类似的新内源性生理活性肽进行预测时，正确地预测从前体 切取肽的位置是非常重要的。通常认为，前体蛋白质在Lys和Arg组合而成的2个连续碱 基残基的位置，被PC1/3、PC2等激素原转化酶切断(非专利文献21、22)。但是，这样的2个 连续碱基残基在内源性生理活性肽前体以外的蛋白质中也广泛存在，以各种生物的全基因 组作为对象，将被上述2个连续碱基残基夹住的全部序列假设为内源性生理活性肽，来评 价其活性是非常困难的。因此，还报道了尝试对作为激素原转化酶的底物的序列进行预测 (非专利文献23)，但没有达到实用的水平。这样，即使在破译了基因组序列的现在，新的生理活性肽的预测也是非常难的课 题。非专利文献 1 :Kastin、"Handbook of biologically activepeptide，，、Academic Press, New York、2006 年非专利文献2 =Hosoda, et al.，J. Pharmacol. Sci.，100，398-410 (2006)非专利文献 3 =Hinson, et al. , Endocrine Reviews, 21，138—167 (2000)非专利文献4 =Morton, et al.，Nature, 4433, 289-295 (2006)非 专利 文献 5 Kangawa, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 118, 131-139(1984)非 专禾丨J 文献 6 :Minamino, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 130, 1078-1085(1985)非 专 禾Ij 文 献 7 :Miyata, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 164, 567-574(1989)非专利文献8 =Meunier, et al. , Nature, 377, 532-535, (1995)非专利文献9 =Kojima, et al.，Nature，402，656-660，(1999)非专利文献10 =Hinuma, et al.，Nature，393，272-276，(1998)非专利文献 11 Tatemoto, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 251, 471-476(1998)非专利文献12 Johnson, et al.，J. Biol. Chem.，278，52172-52178，(2003)非专利文献 13 =Verdonk, et al.，Assay Drug Dev. Techmo 1.，4，609—619，(2006)
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非专利文献17 =Chartel, et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci.，100，15247-15252 (2003)非专利文献18 Jiang, et al.，J. Biol. Chem.，278，27652-27657 (2003)非专利文献19 :Shichiri，et al.，Nat. Med.，9，1166—1172 (2003)非专利文献 20 =Mirabeau, et al.，Genome Research, 17，320—327 (2007)非专利文献21 =Seidah, et al.，Brain Res.，848，45-62 (1999)非专利文献22 =Steiner, Curr. Opin. Chem. Biol.，2，31-39 (1998)非专利文献 23 =Duckert, et al.，Protein Eng. Des. Sel.，17，107—112 (2004)

发明内容
发明要解决的问题本发明的课题在于提供新的内源性生理活性肽。用于解决问题的方案本发明人等为了解决这样的课题而进行了深入努力，其结果，利用独特的手法，发 现了现有手法难以鉴定的生理活性肽，成功得到了具有降血压作用的新的肽。本发明中，作为编码功能未知且氨基酸序列长度不到300个残基、且具有分泌蛋 白质的结构的蛋白质的基因，从公共序列数据库中筛选符合该全部条件的序列，再从该序 列中选择编码由100个氨基酸残基构成且功能未知的前体蛋白质(HC021 序列号3)的人 基因(序列号4)，将所选择的基因克隆，以与大肠杆菌β-半乳糖苷酶的融合蛋白质的形式 产生前体蛋白质，通过激素原转化酶在试管内对该融合蛋白质进行肽的特异性切断，然后 通过质谱仪鉴定所产生的片断序列，从而确定前体蛋白质被激素原转化酶切断的位置。即， 将HC021用加工酶(Kex2蛋白酶衍生物Kex2-660)处理时，作为在内部被切断而获得的肽 鉴定了序列号5，判断出其在从HC021 (序列号3)的氨基末端起第53位Arg和第54位Gly 之间被切断。其后，根据前体蛋白质被切断的位置，推定新的内源性生理活性肽，并利用化 学合成法大量制备所推定的新的候选内源性生理活性肽，通过测定大鼠的血压变动活性， 成功发现了显示降血压作用的新的肽。这样的方法由于利用信息学手法预先确定肽前体候选基因，因此与从组织提取物 中纯化的方法相比，能够供给大量的肽样品。进而，该方法由于通过实验方法利用激素原转 化酶将肽前体蛋白质切断，因此能够检测信息学上难以预测的前体蛋白质的特异性切断位
点ο本发明中，肽的降血压活性的测定法没有特别限定，例如只要是对大鼠或小鼠等 非人动物投与该肽，并测定和评价血压降低的方法即可。具体而言，除了正常动物以外，还 可以利用Dahl食盐敏感性大鼠、自发性高血压(Spontaneoushypertensive)大鼠(SHR)、 DOCA食盐负荷大鼠、DOCA食盐负荷狗、2肾1夹(2K1C)戈德布拉特(Goldblatt)型大鼠、 脊髓破坏大鼠等高血压模型动物，作为血压的测定方法，可以利用有创血压测定法、无创血 压测定法(尾套法(tail cufTmethod))、无麻醉无拘束下血压测定法(遥测系统)等。
本发明为具有降血压活性的新的内源性生理活性肽或其药学上能够接受的盐。本 发明人等化学合成了由上述方法取得的新生理活性肽的氨基末端和羧基末端缺失的序列， 并测定该肽的降血压活性，由此确定了降血压活性所必须的核心序列为LFFRRLQAY(序列 号23)这一由9个残基构成的序列。进而，关于由上述手法取得的新的生理活性肽，化学合成了将氨基末端和羧基末 端延长的序列、以及将各种位置的氨基酸置换的序列，并测定该肽的降血压活性，由此发 现即使将与活性核心序列(P2)的氨基末端结合的大部分序列置换也能保持活性；若在活 性核心序列(P2)的羧基末端添加15个残基左右则活性增强；在活性核心序列(P2)内疏水 性侧链对活性很重要；以及即使在活性核心序列(P2)内保守性置换氨基酸时也能保持活 性。另外，关于本发明的新的生理活性肽的前体多肽(序列号3)，其氨基酸序列和 /或编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列在国际申请W02001/072800、W02002/002621、 W02002/068579 ；美国申请 US2005/0208602 ;Nature Biotechnology (2001),19(5), 440-445 ；Genome Research (2003)，13 (10)，2265-2270 中有记载，在 GenBank 等公共序列数 据库中也有注册。但是，上述文献等中公开的序列只是前体多肽或编码前体多肽的DNA，关 于本发明的新的肽或本发明的肽具有降血压活性未作任何记载。 此外，关于本发明的新的生理活性肽的前体多肽(序列号3)，其氨基酸序列和编 码该氨基酸序列的DNA的碱基序列在国际申请W02003/052377中与其他40种分泌蛋白质 一并公开了。关于蛋白质的活性，虽然记载有能够采用高血压大鼠来评价降血压活性的意 思，但只不过是作为能够成为活性指标的多种评价方法中的一种而进行了记载，而活性方 面，对表明具有活性的实验数据则没有任何记载。在上述文献中，关于本发明的新的生理活 性肽没有任何记载也没有任何暗示，就连关于来源于本发明的新的生理活性肽的前体多肽 的分泌蛋白质具有降血压活性也未言及。本发明为使用式1的肽或其药学上能够接受的盐的药物。本发明的肽或其药学上 能够接受的盐由于具有降血压活性，因此本发明提供使用式1的肽或其药学上能够接受的 盐的药物组合物、治疗方法、及药物的制造方法。根据本发明，由于能够使包括人在内的动 物的血压降低，因此能够治疗高血压和/或起因于高血压的疾病。本发明为以式1的肽作为抗原而制得的抗体、使用该抗体的内源性降血压肽的测 定方法。此外，制作了针对本发明中公开的肽的抗体、特别是针对该肽的羧基末端的抗体， 利用其能特异性识别该肽从前体多肽切出后所产生的部位，能够分别定量该肽和前体多肽 的检测方法也属于本发明。这样，本发明并不限于此，但包含以下的发明。(1) 一种肽或其药学上能够接受的盐，所述肽为(i)以下的式子所示的肽Pln-P2-P3m-Y (式 1)[式中，Pln表示从序列号2的羧基末端起连续η个残基的氨基酸序列，η为 或 1 21的整数，其中，η为0时，Pln不存在；Ρ2为序列号23的氨基酸序列； 3_ 表示由从序列号3的氨基末端起第50位氨基酸向羧基末端侧连续m个残基的氨基酸序列，m为O或1 22的整数，其中，m为O时，P3m不存在；Pln的氨基末端氨基酸的α -氨基的氢原子可以被乙酰基或焦谷氨酰基取代；Y为相当于羧基末端氨基酸的α-羧基的羟基的部分，表示OH或NH2]；或者 (ii)⑴的肽中缺失、置换和/或添加了 1个或多个氨基酸，且具有降血压活性的 肽。(2)根据⑴所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，η为0。(3)根据⑴或⑵所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，η和m为0。(4)根据⑴所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，⑴的肽由选自序列号1、 8、10 13、18 23和25 43构成的组中的氨基酸序列构成。(5)根据(1) (4)中任一项所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，Pln的氨 基末端氨基酸的α“氨基的氢原子被乙酰基或焦谷氨酰基取代。(6)根据⑴ (5)中任一项所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，Y为ΝΗ2。(7) 一种用于治疗高血压和/或起因于高血压的疾病的药物组合物，其包含(1) (6)中任一项所述的肽或其药学上能够接受的盐。(8) 一种治疗高血压和/或起因于高血压的疾病的方法，其包括对个体投与(7)所 述的药物组合物。(9) 一种针对(1) (6)中任一项所述的肽的抗体。(10) 一种肽的定量方法，所述肽为待测试样中的⑴ (6)中任一项所述的肽，所 述定量方法包括使用针对该肽的抗体来检测该肽。(11) 一种方法，所述方法为采用基因重组技术来制造(1) (6)中任一项所述的 肽的方法，其包括通过含有编码所述肽的DNA的载体，对宿主细胞进行转化；以及培养所得到的转化细胞，从培养物中提取目标肽；根据需要进行修饰反应。


图1是表示HC021-004和HC021-007使大鼠的血压降低的作用的图。图中，在 箭头所示的点投与各种试样。a是表示以IOnmol/大鼠投与HC021-004前后的血压的图， b是表示以30nmol/大鼠投与HC021-004前后的血压的图，c是表示以IOnmol/大鼠投与 HC021-007前后的血压的图，d是表示以30nmol/大鼠投与HC021-007前后的血压的图。e 和f分别表示与以IOnmol/大鼠和30nmol/大鼠投与各肽同样地投与溶剂(将0. 醋 酸用含有0.1%牛血清白蛋白(Fr. V)的生理盐水稀释10倍后的溶液)前后的血压的图。图2是表示HC021-007对于觉醒下的小鼠使其血压降低的作用的图。图表的横轴 表示投与肽后的时间(分钟)，纵轴表示以投与时作为基准的收缩期血压的变化(mmHg)。图 表中的符号表示HC021-007的0. lmg/kg投与组(η = 3)(〇)、HC021-007的lmg/kg投与 组(η = 3) ( ·)、人心房肽(hANP)的lmg/kg投与组(η = 4) ( Δ )、生理盐水投与组(η = 4) ( □)。图表中的误差棒表示标准误差。图3是表示抗[N-Cys]-HC021-004血清对各种肽序列的结合的图。a是表示对 HC021-004、HC021-006、HC021-002的结合能力的图，图表的横轴表示抗血清的稀释倍率，纵轴为ELISA的405nm处的吸光度。图中的符号为HC021_004( · )、HC021-006 (〇)、 HC021-002( □ )。b 是表示 HC021-004、HC021-006、HC021-002 的序列的图。
具体实施例方式用语说明本发明中，肽是指多个氨基酸通过肽键相连的化合物。这里所说的氨基酸(或者也表达为氨基酸残基)，除了天然氨基酸以外，还包括其D，L-光学异构体和非天然氨基酸。 此外，本发明中的肽还包括肽的氨基末端和/或羧基末端被修饰的化合物。本发明中，Kex2蛋白酶为酵母的激素原转化酶(EC3. 4. 21. 61)。此外，Kex2-660 为能够有效地分泌、表达Kex2蛋白酶的羧基末端缺失体；是在酵母中表达包含从Kex2蛋白 酶的氨基末端起第1位Met到第660位Pro为止的序列的基因，从培养上清中纯化而获得 的。本发明中HC021为具有序列号3中记载的序列的蛋白质。本发明中，将由前体 HC021获得的肽标记为在HC021后加上连字符和3位数字(例如，HC021-004等)的形式。牛理活件肽本发明的肽为以下的式1所示的肽；或者所述肽中缺失、置换和/或添加了 1个或 多个氨基酸，且具有降血压活性的肽；或它们在药学上能够接受的盐Pln-P2-P3m-Y (式 1)[式中，Pln表示从序列号2的羧基末端起连续η个残基的氨基酸序列，η为 或 1 21的整数，其中，η为0时，Pln不存在；Ρ2为序列号23的氨基酸序列；P3m表示由从序 列号3的氨基末端起第50位氨基酸向羧基末端侧连续m个残基的氨基酸序列，m为0或 1 22的整数，其中，m为0时，P3m不存在；Pln的氨基末端氨基酸的α -氨基的氢原子可 以被乙酰基或焦谷氨酰基取代；Y为相当于羧基末端氨基酸的α-羧基的羟基的部分，表示 OH 或 NH2]。在优选的方案中，本发明的肽中η或m为0 (Pln或P3m不存在)。此外，在优选的方 案中，本发明的肽中η和m为0 (Pln和P3m不存在)。此外，在优选的方案中，本发明的肽具 有选自序列号1、8、10 13、18 23和25 43所构成的组中的氨基酸序列。此外，在优 选的方案中，Pln的氨基末端被乙酰基或焦谷氨酰基取代。进而，在优选的方案中，Y为NH2。在其他优选的方案中，Pln的1 21个残基的氨基酸中，缺失、置换和/或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列也作为Pln优选。在优选的方案中，P3m表示由从序列号3的氨基末端起第50位氨基酸向羧基末 端侧连续m个残基的氨基酸序列，m为0或1 22的整数。在其他优选的方案中，P3m由 选自苯基丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸和精氨酸所构成的组中的至少一个氨基酸构成。此外， 在优选的方案中，P3m 特别优选为 Phe(m= 1)、Phe-Lys (m = 2), Phe-Lys-Gly (m = 3)、 Phe-Lys-Gly-Arg (m = 4)。在其他优选的方案中，在这样的1 22个残基的氨基酸中缺失、 置换和/或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列也作为P3m优选。进而，在其他优选的方案中，Pln的氨基酸中缺失或添加了 1个或者多个氨基酸的 氨基酸序列、或置换了 1 η个氨基酸的氨基酸序列也作为Pln优选。此外，在Ρ2的9个 氨基酸中，保守置换了 1个氨基酸的氨基酸序列也作为Ρ2优选。此外，在P3m的氨基酸中缺失或添加了 1个或者多个氨基酸的氨基酸序列、或置换了 1 m个氨基酸的氨基酸序列 也作为P3优选。在一个方案中，本发明的肽可以缺失、置换和/或添加1个或多个氨基酸。此外， 在一个方案中，本发明的肽可以缺失、置换和/或添加1个或多个氨基酸。进而，在一个方案中，本发明的肽可以缺失、置换和/或添加1、2、3、4或5个氨基酸。肽的取得方法本发明的肽可以通过常规方法获得。例如，可以通过从天然来源的原料中分离、化 学合成或重组DNA技术来制造。从天然来源的原料取得本发明的肽时，可以从表达该肽的组织或细胞中，考虑该 肽的分子量、溶解度、等电点、亲和性等，适当组合凝胶过滤、超滤、透析、SDS-PAGE、各种色 谱法等分离纯化方法而进行。此外，由组织和脏器来分离、纯化肽时，由于组织和脏器中存 在的蛋白酶的作用会阻止目标肽的分解，因此希望通过将组织和脏器在沸水中进行热处理 而使蛋白酶失活。通过化学合成来取得本发明的肽时，可以利用常规方法。肽的化学合成法已经充 分确立了各种方法，本发明的肽也可以通过公知的方法容易地制造。例如，可以利用经典的 肽合成法和固相法。具体而言，将带有保护基团的氨基酸通过液相法和/或固相法缩合，使 肽链延长，再用酸除去全部保护基团，将所得到的粗产物用上述纯化方法等进行纯化，也可 以获得本发明的肽。例如，可以通过“生化学实验讲座1蛋白质的化学”第4卷的第2章、 第3章(东京化学同人)、或者“续药物品的开发14肽合成”(广川书店)等现有书籍中记 载的方法来制造。采用重组DNA技术来取得本发明的肽时，例如，可以利用具有编码本发明的肽的 DNA的表达载体对宿主细胞进行转化，再培养该宿主细胞，并从该培养物中提取目标肽。作为基因重组的载体，可以列举例如大肠杆菌载体(pBR322、pUC18、pUC19等)、枯 草杆菌载体(PUB110、pTP5、pC194等)、酵母载体(YEp型、YRp型、YIp型)、或动物细胞载 体(逆转录酶病毒、牛痘病毒等)等，其他的载体，只要在宿主细胞内能够稳定地保持靶基 因，则均可以采用。将该载体导入适当的宿主细胞。作为将靶基因重组到质粒中的方法或 导入宿主细胞中的方法，可以利用例如Molecular Cloning(Sambrook et al.，1989)中记 载的方法。为了在上述质粒中使靶肽基因表达，而与该基因的上游连接以发挥启动子的功 能。作为本发明中使用的启动子，只要是与用于表达靶基因的宿主细胞相对应的适当的启 动子，则任何启动子均可。例如，进行转化的宿主细胞为埃希氏菌属(Escherichia)时，可 以利用Iac启动子、trp启动子、Ipp启动子、λ PL启动子、recA启动子等，为芽孢杆菌属 (Bacillus)时，可以利用SPOl启动子、SP02启动子、penP启动子等，为酵母时，可以利用 GAP启动子、PH05启动子、ADH启动子等，为动物细胞时，可以利用SV40启动子、CMV启动子、 逆转录酶病毒来源的启动子等。使用如上所述获得的含有靶基因的载体对宿主细胞进行转化时，作为宿主细胞， 可以利用细菌(例如埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)等)、酵母(酵母 菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)等)、动物细胞(CH0 细胞、COS细胞等)等。作为培养时的培养基，液体培养基是适合的，特别优选该培养基中含有对培养转化细胞的发育来说必须的碳源、氮源等。根据期望还可以添加维生素类、生长 促进因子、血清等。若以具有能够将作为前体的多肽在适当的位置切断的加工蛋白酶活性的细胞作 为宿主，则可以直接制造本发明的肽。进而，若使用除加工蛋白酶活性外还具有肽基甘氨 酸_ a -酰胺化酶活性的细胞作为宿主，则可以直接制造羧基末端被酰胺化的本发明的肽。 这样的具有加工蛋白酶和肽基甘氨酸_ a -酰胺化酶活性的宿主细胞可如下进行筛选用 包含编码该前体多肽的DNA的表达载体对宿主细胞进行转化，并确认该转化细胞产生了具 有降血压活性的肽。此外，还可以在宿主细胞中制造前体多肽，接着，在试管内由前体多肽获得目标肽 来制造本发明的肽。作为用于转化的编码前体多肽的DNA序列，可以使用编码目标肽的基 因的cDNA序列，也可以使用编码将该肽夹着加工蛋白酶的切断序列而串联排列的多肽的 DNA序列。例如，用包含编码前体多肽的DNA的载体对宿主细胞进行转化并培养后，从培养 菌体或细胞或者培养液中提取前体多肽并进行纯化，使其与Kex2-660等纯化后的加工蛋 白酶反应并将该前体多肽切断，根据需要再与纯化的羧肽酶或肽基甘氨酸_ a “酰胺化酶 反应而将羧基末端修饰，可以得到目标肽。这里，从包含本发明的肽的培养液或反应液中将 本发明的肽纯化，可以采用与取得天然来源的肽时相同的分离纯化方法。例如，通过用包含编码多肽的DNA的载体对大肠杆菌进行转化，将所得到的融合 蛋白质用加工酶(例如，作为Kex2蛋白酶衍生物的Kex2-660)进行处理，可以得到羧基末 端具有在序列号23的羧基末端添加了 Phe-Lys-Gly-Arg的序列的肽，所述多肽在从大肠杆 菌日-半乳糖苷酶的N末端到第139位残基为止的序列(将从N末端起第77位和第123 位的半胱氨酸置换为丝氨酸的序列)的羧基末端，介由能够被加工酶(例如Kex2蛋白酶) 裂解的连接子部位，融合了从HC021的氨基酸序列(序列号3)中除去分泌信号序列(从序 列号3的氨基末端到第21位的部分)的序列。进而，由于羧基末端的Arg可以通过使将碱性氨基酸游离的羧肽酶(例如，羧肽 酶-B)在试管内反应而除去作为公知的技术是已知的，因此通过将上述肽用羧肽酶处理， 能够得到羧基末端具有在序列号23的羧基末端添加了 Phe-Lys-Gly的序列的肽。进而，此外，羧基末端的Gly可以通过使肽基甘氨酸_ a _酰胺化酶在试管内 反应而转变为酰胺作为公知的技术是已知的，因此通过用羧肽酶处理后，再用肽基甘氨 酸_ a _酰胺化酶处理，能够得到羧基末端具有在序列号23的羧基末端添加了 Phe-Lys-酰 胺的序列的肽。药学上能够接警的盐本发明除了式1的肽以外，还包含其药学上能够接受的盐。作为药学上能够接受 的盐，可以列举例如与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或 酸性氨基酸的盐等。本发明中，这些盐中也最优选为钠盐、钾盐。作为与无机碱的盐的优选的例子，可以列举例如钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁 盐等碱土金属盐；以及铝盐、铵盐等。作为与有机碱的盐的优选的例子，可以列举例如与三 甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、N，N’_ 二苄基乙二胺 等的盐。作为与无机酸的盐的优选的例子，可以列举例如与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。作为与有机酸的盐的优选的例子，可以列举例如与甲酸、醋酸、三氟醋酸、富马酸、 草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等的盐。作为与碱性氨基酸的盐的优选的例子，可以列举例如与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等 的盐，作为与酸性氨基酸的盐的优选的例子，可以列举例如与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。MM.本发明的肽或其药学上能够接受的盐具有降血压作用。此外，本发明的肽或 其药学上能够接受的盐可以直接或者与公知的药学上能够接受的载体、赋形剂、增量剂 (extender)等混合后对包括人在内的动物使用。投与方式没有特别限定，对成人静脉注射时，投与量为1次0. g 8mg/kg，优选 为4 ii g 2mg/kg，更优选为8 ii g 0. 8mg/kg。希望1天1次 3次投与该量。本发明的肽或其药学上能够接受的盐可以作为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等固态 制剂；或糖浆剂、注射剂等液状制剂而经口或非经口投与。此外，根据需要，还可以采用防腐 剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等制剂添加物。本发明的肽或其药学上能够接受的盐可以与药学上能够接受的载体组合使用。作 为药学上能够接受的载体，可以采用作为制剂原材料惯用的各种有机或者无机载体物质， 可以作为固态制剂中的赋形剂、润滑剂、结合剂、崩解剂；液状制剂中的溶剂、溶解辅助剂、 悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、无痛剂等而配合。作为赋形剂的优选的例子，可以列举例如乳糖、白糖、D-甘露糖醇、淀粉、结晶纤维 素、轻质无水硅酸等。作为润滑剂的优选的例子，可以列举例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、 硅胶等。作为结合剂的优选的例子，可以列举例如结晶纤维素、白糖、D-甘露糖醇、糊精、羟 丙基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。作为崩解剂的优选的例子，可以列举例如淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、 交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠等。作为溶剂的优选的例子，可以列举例如注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、 玉米油等。作为溶解辅助剂的优选的例子，可以列举例如聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯 甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。作为悬浮化剂的优选的例子，可以列举例如硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂 基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等表面活性剂；例如聚乙烯醇、 聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤 维素等亲水性高分子等。作为等渗剂的优选的例子，可以列举例如氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。作为缓冲剂的优选的例子，可以列举例如磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等。作为无痛剂的优选的例子，可以列举例如苄醇等。作为防腐剂的优选的例子，可以列举例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苄醇、苯乙 醇、脱氢醋酸、山梨酸等。作为抗氧化剂的优选的例子，可以列举例如亚硫酸盐、抗坏血酸等。抗体和检测
从一个观点出发，本发明为针对式1的肽的抗体。以具有降血压活性的式1的肽 作为抗原的抗体可以通过公知的方法取得。本发明的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗 体中的任意一者。此外，从另外的观点出发，本发明为使用了这些抗体测定具有降血压活性的肽的 方法。在优选的方案中，本发明的抗体识别本发明的式1的肽，但不识别其前体多肽。若 使用这样的抗体，则可将本发明的新的肽选择性纯化、定量。关于上述检测方法，并不限于此，以下叙述具体的方案。S卩，作为上述检测方法，可以列举例如(i)本发明的肽等的定量方法，其包括使针对本发明的肽的抗体、与待测试样中 的待测物和被标记的本发明的肽竞争性反应，并测定与该抗体结合的被标记化的本发明的 肽等的比例；(ii)本发明的肽等的定量方法，其包括使待测试样与载体上不溶化的本发明的 抗体及被标记化的另外的本发明的抗体同时或者连续反应，测定不溶化载体上的标记剂的 活性或/和不溶化载体上没被捕捉的标记剂的活性；在上述定量方法中，一方的抗体优选为识别本发明的肽但不识别前体多肽的抗 体。此外，作为本发明的肽等的检测方法，除了使用针对该肽的抗体来进行本发明的 肽等的定量以外，还可以利用组织染色等进行检测。为了实现这些目的，可以使用抗体分子本身，此外，也可以使用抗体分子的 F(ab，)2、Fab，、或者 Fab 部分。使用上述抗体的本发明的肽等的定量法没有特别限定，只要是通过化学或物理手 段来检测与待测试样中的抗原量(例如肽量)对应的抗体、抗原或者抗体-抗原复合物的 量，并利用使用包含已知量的抗原的标准液制作的标准曲线来计算的测定法，则可以使用 任何测定法。适合使用例如比浊法(nephelometry)、竞争法、免疫测定法和夹层法，但在灵 敏度、特异性的方面，特别优选使用夹层法。作为本发明的检测方法中使用标记物质的测定法中所使用的标记剂，可以列举 例如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。本发明中作为放射性同位素，可以使用例 如125I、131I、3H、14C等。此外，作为上述酶，优选稳定且比活性较大的酶，可以使用例如
半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。进而，作 为荧光物质，可以列举例如荧光胺、异氰酸荧光素等，作为发光物质，可以列举例如鲁米诺 (luminol)、鲁米诺衍生物、荧光素酶(luciferase)、光泽精(lucigenin)等。此外，抗体或 者抗原和标记剂的结合中可以使用生物素_亲和素系。实施例以下，用实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围并不限于以下 的具体的实施例。此外，本实施例中的主要缩写的意思如下所示。HBTU:N-[(1H-苯并三唑-1-基(二甲氨基)亚甲基]_N_甲基甲铵六氟磷酸盐 N-氧化物
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HOBt 1-羟基苯并三唑Trt:三苯甲基Pmc :2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基OtBu:叔丁基酯Mtt 4-甲基三苯甲基TIPS 三异丙基硅烷实施例1 :HC021肽的化学合成考虑HC021在第53位Arg和第54位Gly之间被Kex2-660切断的信息、和通常内 源性生理活性肽前体在细胞内被加工而生物合成肽的机理(在连续2个以上的碱性氨基酸 残基的羧基末端侧被激素原转化酶切断、羧基末端的碱性氨基酸被羧肽酶除去、羧基末端 的Gly被肽基甘氨酸_ a -酰胺化酶酰胺化)，设计以下的肽序列来进行化学合成。HC021-001 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFF (序列号 6)HC021-002 LQAYFKGRGLDLGTFPNPFPTNENP (序列号 7)HC021-004 NRDLFFRRLQAYFK-酰胺(序列号 8)HC021-006 LQAYFK-酰胺(序列号 9)HC021-007 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-酰胺(序列号 10)肽链的延长主要使用肽合成机(433A，Applied Biosystems公司制)，通过芴甲氧 羰基(Fmoc)法来构建保护肽衍生物-树脂。所得到的保护肽树脂用三氟醋酸(TFA)、或者 包含各种清除剂的稀释TFA进行脱保护，将游离的肽供于纯化。通过使用了 C18柱的反相 HPLC进行纯化并确认纯度，利用质谱分析确认结构。本发明的肽可以通过通常的肽合成法来进行制造，作为代表性合成例，以下示出 HC021-004 的合成。HC021-004 的合成合成采用Applied Biosystems公司制肽合成机433A。将芴甲氧羰基-酰胺树 脂(373mg、0. 25nmol)装入反应容器中，使用FastMocO. 25程序，作为缩合剂采用HBTU/ HOBt。根据需要进行双偶联(double coupling)，构建肽树脂。最后将N末端的芴甲 氧羰基用哌啶处理而除去。将肽树脂干燥，并将肽树脂用TFA 苯酚水TIPS = 8.8 0.5 0.5 0. 2 (v/v)的脱保护试剂15ml处理2小时。反应后过滤，除去树脂，将 溶液在减压下浓缩。在残渣中添加醚进行沉淀，过滤并收集沉淀，得到粗肽352. 6mg。将其 1/2量即176. 3mg添加至YMC 0DS柱(5 u m, 2cmX 25cm)中，通过线性梯度(流速10mL/ min)进行洗脱，所述线性梯度为60分钟内使乙腈在0. 三氟醋酸中的浓度从0%上升到 60%。剩余的粗肽也同样地用YMC 0DS柱进行纯化，将2次色谱的纯度高的级分冷冻干燥， 得到267. 7mg的粉末。将该粉末添加至YMCProtein-RP柱(5 y mC4，2cmX 25cm)中，通过线 性梯度(流速10mL/min)进行洗脱，所述线性梯度为60分钟内使乙腈在0. 三氟醋酸中 的浓度从0%上升到60%。冻干后，得到目标肽245mg。ESI-MS测定值1873. 0(理论值 1873. 17)实施例2 肽对血压的效果对8 10周龄的 Sprague-Dawley 系 IGS雄性大鼠(Charles River Laboratories Japan, Inc.)腹腔内投与50mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，插入气管插管(PE 250)、大腿静脉插管(PE50)和大腿动脉插管(PE50)。大腿动脉插管与压力传感器(PE23XL，日本光电 公司制)连接，使用在多功能前置放大器装置(multi-purpose preamplifier) (RP-6004， 日本光电公司制)中组装了血压测定单元(AP-641G，日本光电公司制)和瞬时心率计单 元(AT-601G，日本光电公司制)的装置来记录血压、和心率数。血压采用立式电子血压计 (stand-type electromanometer) (MP-25S，日本光电公司制)附带的水银压力计来校正，在 记录纸上将10mm调整为lOOmmHg或者将20mm调整为lOOmmHg。作为血压变动的阳性对照， 采用溶解有乙酰胆碱(10yg/大鼠)的溶剂；作为阴性对照，采用溶解有各肽的溶剂。将各肽以ImM或者10mM的浓度溶解于0. 1 %醋酸溶液中制备肽溶液后，根据投与 量用包含0. 牛血清白蛋白(Fr.V)的生理盐水稀释。lOnmol/大鼠的投与量时，将ImM 的肽溶液稀释10倍，将其100 y L用于投与。30nmol/大鼠的投与量时，将ImM的肽溶液稀 释10倍，将其300 iiL用于投与。lOOnmol/大鼠的投与量时，将10mM的肽溶液稀释10倍， 将其lOOyL用于投与。各肽通过大腿静脉插管投与到静脉内，测定收缩期血压、舒张期血 压和心率数。结果示于表1和图1。HC021-004和HC021-007中确认到降压活性。[表1]表1 :HC021衍生物肽的活性 NT:未实施实施例3 :HC021肽的活性区域的检索根据实施例1合成各种HC021衍生物肽，通过实施例2所示的方法以lOnmol/大 鼠、30nmol/大鼠、lOOnmol/大鼠的用量对大鼠投与并测定降血压活性。各衍生物肽的降血 压活性方面，对2个体以上观察到活性的肽确认为有活性，活性的强度通过反复实验而得 的活性的中值来判定。此外，为了比较各衍生物肽的活性，降血压活性的强度如下来定义。降血压活性的强度 活性非常强(+++):收缩期血压的降低为30mmHg以上，且直至恢复的时间为5分 钟以上 活性强(++)收缩期血压的降低为20mmHg以上，且该血压降低不到30mmHg或直至恢复的时间不到5分钟 确认到活性⑴收缩期血压的降低不到20mmHg 没有确认到活性(_)结果示于以下的表2。化合物3010)21-004)、5 010)21-007)、12、14、16、17和 19 的降血压活性的增强呈
用量依赖性。从化合物1 26的结果可判断，各化合物的羧基末端侧存在的9个残基 (LFFRRLQAY 序列号23)对活性很重要(以下，活性核心序列)。由化合物3、5 10和15 17的结果可知，即使将活性核心序列的氨基末端延长，也能保持活性，由化合物3、11 15、 18、19、24、25和27 30的结果可知，即使将活性核心序列的羧基末端延长几个残基，也能 保持活性，而且若进一步延长则活性增强。此外，由化合物3、5、8 15、18、19的结果可判 断，羧基末端的酰胺结构对于活性的表现不是必须的，但使活性增强。由化合物31 33的 结果可判断，即使氨基末端的氨基被修饰，对活性也没有影响。[表2]表2 :HC021肽延长体和缩短体的活性 NT 未实施；下划线部分核心序列；pyr-焦谷氨酰基实施例4 :HC021肽的序列置换对活性的影响基于实施例1来合成各种HC021肽的序列置换体，根据实施例3的方法测定降血 压活性。结果示于以下的表3。降血压活性的强度的定义基于实施例3。由化合物34 40的结果可判断，与活性核心序列结合的氨基末端侧的序列即使 其大部分被置换也能保持活性。此外，由化合物48、49的结果可判断，与活性核心序列结合的羧基末端侧的序列即使其大部分被置换也能保持活性。进而，由化合物36 38和43 (亲 水性侧链的保守性置换)以及44 47 (疏水性/芳香族性侧链的保守性置换)的结果可 判断，即使是活性核心序列内部，如果是1个残基左右的保守性置换则也可保持活性，由化 合物46和47的结果可判断，在活性核心序列内部疏水性侧链对活性很重要。[表 3]表3 :HC021肽序列置换体的活性 NT 未实施；下划线部分HC021中被置换的氨基酸残基；Cha 环己基丙氨酸实施例5 对觉醒大鼠的降压活件对8 10 周龄的 Sprague-Dawley 系 IGS 雄性大鼠(CharlesRiver LaboratoriesJapan, Inc.)腹腔内投与50mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，为了投与肽而插入颈静脉插管 (Silascon 0. 5_1. 0)，为了测定血压而插入颈动脉插管(PE50)。手术后至少经过3小时以 上后，根据大鼠的姿势和呼吸等一般状态确认从麻醉中觉醒后，供于实验。颈动脉插管与压力传感器(PE23XL，日本光电公司制)连接，使用在多功能前置放 大器装置(RP-6004，日本光电公司制)中组装了血压测定单元(AP-641G，日本光电公司制) 和瞬时心率计单元(AT-601G，日本光电公司制)的装置记录血压、和心率数。血压采用立式 电子血压计(MP-25S，日本光电公司制)附带的水银压力计来校正，在记录纸上将20mm调整 为lOOmmHg或者将40mm调整为lOOmmHg。作为血压变动的阴性对照，采用溶解有各肽的溶 剂。将各肽以ImM的浓度溶解于5%甘露糖醇溶液中制备肽溶液后，根据投与量，用 5%甘露糖醇溶液稀释。lOnmol/大鼠的投与量时，将ImM的肽溶液稀释30倍，将其300 y L 用于投与。30nmol/大鼠的投与量时，将ImM的肽溶液稀释10倍，将其300 u L用于投与。 lOOnmol/大鼠的投与量时，将ImM的肽溶液稀释3倍，将其300 u L用于投与。各肽介由颈 静脉插管投与到静脉内，并测定收缩期血压、舒张期血压和心率数。结果示于表4。降血压活性的强度的定义基于实施例3。与实施例2、3和4中所示的使用麻醉大鼠时同样地，HC021-004、HC021-007和化 合物36对觉醒大鼠也显示出降压活性。[表4]表4 :HC021肽对觉醒大鼠的活性 实施例6 对觉醒小鼠的降压活件MWM 30g 40g 的 C57BL/6 /]、鼠(Charles River Laboratories Japan, Inc.) 放入大鼠和小鼠用无加温型无创式血压计(MODEL MK-2000，室町机械株式会社)的保持器 内，并在尾巴的根部安装缚带脉搏传感器(cuff-pulse sensor)。确认小鼠的血压稳定后， 供于实验。将肽根据投与量用生理盐水稀释制备肽溶液。0. lmg/kg的投与量时，制备 0. 02mg/mL的肽溶液，lmg/kg的投与量时，制备0. 2mg/mL的肽溶液，投与液量为5mL/kg。作 为阳性对照，采用人心房肽(hANP)，作为阴性对照，采用生理盐水。各肽采用带29G针的注 射器从尾静脉投与，投与后3分钟和10分钟测定收缩期血压和心率数。结果示于图2。
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与实施例2、3和4中所示的采用麻醉下的大鼠时同样地，HC021-007对觉醒下的 小鼠也显示出降压活性。实施例7 针对肽的抗体的制作以[N-Cys]-HC021-004(HC021-004的氨基末端结合有半胱氨酸的肽)作为抗原， 免疫兔子，制备抗血清(抗[N-Cys]-HC021-004血清)。该抗血清对于各种序列的肽的结合能力通过ProteinDetectorTM ELISA kit(AP ； BluePhos System，KPL公司制)进行研究。反应全部在室温下进行。将96孔免疫板 (MaxiSorp包被后，Nunc公司制)用各种序列的肽(lng/100 y L浓度)包被1小时(100 uL/ 孔量)，并用300 u L/孔的封闭液封闭1小时后，以100 u L/孔添加连续稀释后的该抗血清， 并反应1小时。清洗后，以100 u L/孔添加稀释500倍的Anti-rabbit IgG HRP Ab (KPL公 司制)，并反应1小时，清洗后，以100 u L/孔添加底物ABTS (KPL公司制)，30分钟后测定 405nm处的吸光度。检测结果示于图3。该抗血清对于HC021-004和HC021-006显示几乎同等的结合， 但对于HC021-002完全没有观察到结合。该结果认为，该抗血清不识别前体序列的HC021， 而识别羧基末端侧具有活性核心序列的肽。若使用针对本申请发明的肽的抗体，则可以将前体多肽区别开，而对本发明的肽
进行定量。产业上的可利用件本发明涉及新的生理活性肽。本发明的肽或其药学上能够接受的盐由于通过对人 或动物投与而使血压降低，因此作为改善起因于高血压的疾病的药物有用，针对本发明的 肽的抗体对于疾病的诊断有用。
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权利要求
一种肽或其药学上能够接受的盐，所述肽为(i)以下的式子所示的肽P1n-P2-P3m-Y(式1)式1中，P1n表示从序列号2的羧基末端起连续n个残基的氨基酸序列，n为0或1～21的整数，其中，n为0时，P1n不存在；P2为序列号23的氨基酸序列；P3m表示由从序列号3的氨基末端起第50位氨基酸向羧基末端侧连续m个残基的氨基酸序列，m为0或1～22的整数，其中，m为0时，P3m不存在；P1n的氨基末端氨基酸的α-氨基的氢原子可以被乙酰基或焦谷氨酰基取代；Y为相当于羧基末端氨基酸的α-羧基的羟基的部分，表示OH或NH2；或者(ii)(i)的肽中缺失、置换和/或添加了1个或多个氨基酸，且具有降血压活性的肽。
2.根据权利要求1所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，η为0。
3.根据权利要求1或2所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，η和m为0。
4.根据权利要求1所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，⑴的肽由选自序列号1、 8、10 13、18 23和25 43所构成的组中的氨基酸序列构成。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，Pln的氨基 末端氨基酸的α-氨基的氢原子被乙酰基或焦谷氨酰基取代。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的肽或其药学上能够接受的盐，其中，Y为ΝΗ2。
7.一种用于治疗高血压或起因于高血压的疾病的药物组合物，其包含权利要求1 6 中任一项所述的肽或其药学上能够接受的盐。
8.一种治疗高血压或起因于高血压的疾病的方法，其包括对个体投与权利要求7所述 的药物组合物。
9.一种针对权利要求1 6中任一项所述的肽的抗体。
10.一种肽的定量方法，所述肽为待测试样中的权利要求1 6中任一项所述的肽，所 述定量方法包括使用针对该肽的抗体来检测该肽。
11.一种方法，所述方法为采用基因重组技术来制造权利要求1 6中任一项所述的肽 的方法，其包括通过含有编码该肽的DNA的载体，对宿主细胞进行转化； 培养所得到的转化细胞，从培养物中提取目标肽；以及 根据需要进行修饰反应。
全文摘要
提供具有生理活性的新的肽。本发明的新的肽具有降血压活性，对于治疗起因于高血压的疾病是有用的。此外，本发明还涉及针对新的肽的抗体。
文档编号C07K7/08GK101848932SQ20088002094
公开日2010年9月29日 申请日期2008年6月27日 优先权日2007年6月28日
发明者冈本敦之, 孙田浩二, 林友二郎 申请人:阿斯比奥制药株式会社