一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 尿酸是人体嘌呤代谢的产物。正常状态下，人体血尿酸含量为200~410 y mol/ L，女性普遍低于男性。人体尿酸水平的升高通常与人体嘌呤代谢异常或肾脏排泄异常息息 相关，国际上将男性血尿酸浓度超过420 y mol/L、女性超过357 y mol/L时定义为高尿酸血 症。而高尿酸血症往往会引起通风。痛风在公元前2640年即被埃及人定义，并于公元前 400年被记录到希波克拉底的医学著作中。如今，由于饮食结构和生活方式的改变，高尿酸 血症及痛风患者也随之增加，已成为现代社会常见的一种风湿性疾病。
[0003] 人们一般很少关注自已的血尿酸水平，往往是等到出现了痛风的症状才采取治 疗。目前以消炎、镇痛治疗为主，如秋水仙碱及非留体抗炎药物，持续用药1到2周后能明显 改善痛风症状。吲哚美辛也能够治疗急性痛风，而注射促肾上腺皮质激素具有更好的、更快 速的疗效。别嘌呤醇是目前市面上唯一一款通过抑制黄嘌呤氧化酶活性而减少尿酸生成、 降低血尿酸浓度的药物，其作用靶点明确，但起效慢，且在使用初期会加剧痛风症状。但无 论是消炎、镇痛药物，还是作用机理明确的别嘌呤醇药物，在治疗时往往会出现一定的毒副 作用，因此对于已患有痛风石的患者多采取手术剔除痛风石、矫正关节来进行治疗。而在无 症状高尿酸血症的治疗中，医生建议通过调整饮食结构或口服一些食源性的药物来进行治 疗，达到缓慢降低血尿酸水平的目的。
[0004] 蛋白质是我们日常生活中必不可少的营养元素，且在蛋白质中蕴含着很多的生物 活性物质一一生物活性肽，其中可能具有降血压、降胆固醇、抗血栓、抗癌、抗氧化等生物活 性。但这些生物活性肽隐藏在蛋白质内部或仅是蛋白质的某个基因片段，当人们摄食这些 蛋白质食物时，蛋白质进入人体胃和肠道中，这些生物活性肽也不能被胃和肠道中酶系作 用而完全释放出来。现代生物酶解技术是一种可高效释放蛋白质内部生物活性肽的方法， 该法主要是模仿人体内消化系统的蛋白水解过程，且由于是在体外作用，其水解条件和蛋 白酶的种类和浓度均可调整，所以可高效获取目标生物活性的生物活性肽。
[0005] 另外，美拉德反应是食品加工或储存过程中常发生于还原糖与氨基酸、多肽、蛋白 质或任何含氮化合物之间的非酶褐变反应，其反应历程较快，内部的成分变化复杂，甚至会 生成某些具有较强生物活性的物质，如目前报道较多的是美拉德反应可以显著增强蛋白肽 的抗氧化活性，因此，美拉德反应也是一种提升蛋白肽生物活性的有效的处理手段之一。
[0006] 秋刀鱼属于海洋中上层鱼类，其肉含有丰富的蛋白质，但附加值较低，主要作为食 用或饲料，价格低廉。目前已有通过生物酶解制备抗氧化肽的研宄，仍未见利用秋刀鱼来制 备降尿酸组分的研宄。如果以秋刀鱼为原料制备出具有明显降低尿酸的蛋白肽产品，不仅 可拓展秋刀鱼的应用领域和提高其经济价值，更重要的可改善人们的生活质量，具有极大 的社会意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的在于提供一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法， 该方法的创新点在于实现酶解与美拉德反应的连续作用，以及外加单体氨基酸作为酶解体 系的底物抑制剂来达到调节酶解进程的目的。
[0008] 本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德 肽。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述的秋刀鱼美拉德肽的用途。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011] 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)秋刀鱼预处理：秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎 肉质量3~5倍的水，在40~50°C下加热搅拌1~2小时，调节体系pH值至4. 2,继续搅 拌加热1~1. 5小时，离心分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物；
[0013] (2)酶解-美拉德连续发应：往秋刀鱼沉淀物中加入其质量1~1. 5倍的水，然后 加入蛋白酶和单体氨基酸，调节体系pH值至7. 0,在50~55°C下保温水解6~9小时后， 加入还原糖，在100~121°C下加热1. 0~2. 0小时，离心，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽 液；将美拉德肽液真空浓缩、喷雾干燥，得到秋刀鱼美拉德肽干粉；
[0014] 以秋刀鱼沉淀物的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占1. 5~3. 0%，单体氨基酸 的加入量占〇. 1~〇. 3%，还原糖的加入量占0. 5~2. 5% ;
[0015] 所述的调节体系pH值是用0. 5mol/L的NaOH溶液或HC1溶液调节；
[0016] 所述的离心是5000r/min离心15~20min ;
[0017] 步骤⑵所述的蛋白酶是商业用的碱性蛋白酶和风味蛋白酶，优选诺维信公司的 喊性蛋白酶（Alcalase 2.4L)和风味蛋白酶（Flavourzyme 500MG);
[0018] 步骤（2)所述的单体氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，优选色氨酸；
[0019] 步骤（2)所述的还原糖为葡萄糖、木糖或核糖。
[0020] 由上述方法制得的秋刀鱼美拉德肽可用于制备降尿酸药物或保健品；使用时，所 述的秋刀鱼美拉德肽可以与具有降尿酸作用的中草药复配。
[0021] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0022] (1)本发明结合生物酶解和美拉德反应技术来制备具有降尿酸作用的美拉德肽， 首先通过在酶解前期添加单体氨基酸，一方面可直接增加最终酶解产物中某些氨基酸的含 量，另一方面通过对酶解体系进行底物抑制，反向调控酶解进程，促成或抑制某些氨基酸的 生成，改变酶解产物的氨基酸组成，提高酶解产物的降尿酸活性或美拉德反应活性；然后在 酶解结束后直接添加还原糖实现酶解与美拉德反应的连续作用制备出美拉德肽，既简化了 生产工艺流程，缩短生产周期，降低生产成本，又使制得的目标美拉德肽的降尿酸作用显著 增强，经大鼠动物实验表明采用本发明方法制备的降尿酸美拉德肽可显著降低大鼠的血尿 酸水平，并对大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用。
[0023] (2)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、所得美拉德肽的降尿酸活 性强。
【附图说明】
[0024] 图1是实施例2和对比例产品的尿酸峰色谱图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0026] 以下各实施例中，采用反相高效液相色谱法测定尿酸值的方法如下：
[0027] (1)溶液的配置
[0028] 0?2mol/L (pH 7. 5)磷酸缓冲液（PBS):准确称取 30. 0838g Na2HP04 ? 12H20 和 2. 4962g NaH2P04 ? 2H20,用去离子水溶解，定容至500ml。
[0029] 黄嘌呤溶液：准确称取6. 4mg黄嘌呤，先用1ml1M NaOH将其溶解，再加入100ml PBS，以1M HC1调节pH值至7. 5。
[0030] 黄嘌呤氧化酶：取120 y 1酶液，以PBS稀释至8ml。
[0031] 尿酸标曲：准确称取10mg尿酸，加入10ml水，再稀释至0? 1~0? 9mg/ml。
[0032] 醋酸胺-冰醋酸：准确称取醋酸胺3. 85g定容至1000ml，然后加入4ml冰醋酸。
[0033] (2)样品预处理：
[0034] 将样品稀释至40mg/ml，在96孔酶标板中依次加入50 y 1样品与50 y 1黄嘌呤，每 个样品做3个平行，37°C保温lOmin后加入150 y 1黄嘌呤氧化酶，37°C继续保温20min后 加入80 y 1 1M HC1终止反应，过0. 25 y m水性膜，待测。
[0035]色谱柱：ZorbaxEclipseXDB-C18 柱（5ym，4. 6 X 250mm,安捷伦），
[0036] 液相条件：洗脱液为10%甲醇+90%醋酸胺-冰醋酸溶液，进样体积为20 y L，流 速lml/min，检测波长为290nm，运行时间10min〇
[0037] (3)计算公式
[0038]
【主权项】
1. 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 秋刀鱼预处理：秋刀鱼去头、去内脏，清洗干净，过绞肉机绞碎，加入秋刀鱼碎肉质 量3~5倍的水，在40~50°C下加热搅拌1~2小时，调节体系pH值至4. 2,继续搅拌加 热1~1. 5小时，离心分离，弃除上清液和上层油脂，取沉淀物； (2) 酶解-美拉德连续发应：往秋刀鱼沉淀物中加入其质量1~1. 5倍的水，然后加入 蛋白酶和单体氨基酸，调节体系pH值至7. 0,在50~55°C下保温水解6~9小时后，加入 还原糖，在100~121°C下加热I. 0~2. 0小时，离心，取上清液，得到秋刀鱼美拉德肽液； 将肽液真空浓缩、喷雾干燥，得到秋刀鱼美拉德肽干粉； 以秋刀鱼沉淀物的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占1. 5~3. 0%，单体氨基酸的加 入量占0. 1~0. 3%，还原糖的加入量占0. 5~2. 5% ; 步骤（2)所述的单体氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸； 步骤（2)所述的还原糖为葡萄糖、木糖或核糖。
2. 根据权利要求1所述的具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，其特征在 于：步骤（2)所述的蛋白酶为碱性蛋白酶和风味蛋白酶。
3. 根据权利要求2所述的具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽的制备方法，其特征在 于：碱性蛋白酶为诺维信公司的Alcalase 2. 4L，风味蛋白酶为诺维信公司的Flavourzyme 500MG。
4. 一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽，其特征在于：是由权利要求1-3任一项所 述的方法制备得到。
5. 权利要求4所述的秋刀鱼美拉德肽在制备降尿酸药物或保健品中的应用。
6. 根据权利要求5所述的秋刀鱼美拉德肽在制备降尿酸药物或保健品中的应用，其特 征在于：所述的秋刀鱼美拉德肽与具有降尿酸作用的中草药复配。
【专利摘要】本发明公开了一种具有降尿酸活性的秋刀鱼美拉德肽及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：将秋刀鱼绞碎，加水加热搅拌，调节pH值至4.2，离心分离，取沉淀；往沉淀物中加水、蛋白酶和单体氨基酸，调节pH值至7.0，水解后再加入还原糖反应，离心，取上清液即为秋刀鱼美拉德肽液；将肽液喷雾干燥得到秋刀鱼美拉德肽干粉。本发明方法实现了酶解与美拉德反应的连续作用制备出美拉德肽，简化生产工艺流程，缩短生产周期，降低生产成本，且制得的目标美拉德肽的降尿酸作用显著，经大鼠动物实验表明采用本发明方法制备的降尿酸美拉德肽可显著降低大鼠的血尿酸水平，并对大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用。
【IPC分类】A61P19-06, A23J1-04, A61K38-02
【公开号】CN104664039
【申请号】CN201510094674
【发明人】赵谋明, 刘洋, 苏国万, 赵容钟, 赵强忠, 林恋竹
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月3日