聚合物两相系统及其用途的制作方法

专利名称：：聚合物两相系统及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种含水液体混合物，其包含两种或者多种能够形成多相系统的聚合物，其中每个相富含一种的该聚合物。本发明还包括一种使用本发明的多相系统从液体中分离至少一种目标化合物的方法以及包括用于进行这样的方法的试剂盒。
背景技术：
：由于分离方法例如色谱法和电泳的发展，使得生物技术的变革，包括现代生物制药学的发展和绘制人类基因组成为可能。这样的方法可以用于小规模以及大规模中，并且被称为灵活的方法，其可用于多种物质，包括生物物质。但是，它们需要技术和装备二者。另外，由于需要非线性规格的加热和冷却，因此一些加工例如电泳的规格导致了对于更复杂的装备的需要。在聚合物水相系统中的相之间的分配是一种可选择的方法，从二十世纪五十年代开始就对其进行了研究，但是它的商业应用严重的受限于经济的可升级的相系统的缺乏。与分离方法例如结晶和尺寸排阻(sizeexclusion)—起；分配被认为是一种分离技术。它涉及到目标物质和其他物质在两相之间的不同分配。术语"分配，，可以指的是(a)例如在典型的色谱法中的液体-固体分配，(b)在两种或者多种液相(分别是双相和多相系统)之间的分配，(c)在流动液相和固定在固体相载体表面上的另一种液相之间的分配，和(d)粒子在液相和两相的相界面之间的分配。在本专利申请中，"分配"和"分配于"指的是例如b，c或者d这样的情况，即，在液相之间分配。分配典型的被表达为系数(K),该系数与一个相中的浓度比另一个相中的浓度相关，并且对于溶质而言，K通常符合Br0nsted等式。因此K被认为是不同类型的相互作用例如静电和/或疏水相互作用的变化指数，并且其还对于溶质大小(即，与液相相互作用的面积)是敏感的。在界面分配的情况中，K被认为是界面张力的变化指数，该张力倾向于将粒子局限到该相界面中。典型的两相系统是有才几和含水两相系统，其通常在所述相之间具有显著的极性，以及显著的界面张力。这样的系统对于生物物质例如蛋白质或者细胞不是非常有用的，因为它们倾向于由于明显非极性溶液而变性和剪切损坏，该损坏与具有显著的界面张力的相系统的混合有关。对于生物物质而言更有用的是低张力的、含水聚合物两相系统。公知的是后者可以包含一些添加的有机溶剂，例如乙醇或者其他有才几添加剂，该添加剂一皮加入来增强目标物的溶解性，降^氐液相才及性，减少泡沫，充当杀菌剂等等。聚合物两相系统可以通过在水溶液中混合某些亲水性的聚合物和典型的中性聚合物来形成。这些聚合物包括葡聚糖(聚葡萄糖)和聚(乙二醇)(PEG);以及聚蔗糖(例如Ficol1)和PEG;或者线性聚丙烯酰胺和PEG。每个聚合物典型的浓度是5-10%w/w。在这样的浓度，熵力倾向于推进两相的形成，这二者都典型的是大于9(W(w/w)水，但是表现出极性，氢键特性，凝固点等等微妙的差异。该相典型的是富集一种聚合物，并且具有非常低的界面张力。在生物
技术领域：
中，PEG和葡聚糖类型的两相系统的一个优点是目标蛋白质可以有利的分配在PEG富集的相中，而细胞片段和一些污染物可以分配到界面或者补充相中。WO2004/020629(Tjerneld)涉及包含亚乙基氧(EO)基团和亚丙基氧(PO)基团的PEG类聚合物(简写成EOPO聚合物)的用途。这样的聚合物被称作"E0P0"聚合物，其表现出逆转的热溶解性，并且在WO2004/020629中建议将它们用于质粒的分离。在室温时，将较稀的、E0P0富集的上部相与EOPO和葡聚糖聚合物含水两相系统分离，并且随后将它的温度升高到37。C,该上部相经历了进一步的相分离，成为水富集的相和自締合的EOPO聚合物富集的相。有利的，该水富集的相应当包含期望的质粒。通常，这种E0P0和葡聚糖系统提供了在相聚合物成分再循环和设计有效的两阶段分配分离方法方面的优势。但是，一个缺点是系统配制所涉及的成本，这与人造的合成聚合物PEG无关，而是与生物来源的和昂贵得多的葡聚糖有关。用不同的淀粉或者其他聚糖聚合物来代替葡聚糖的努力已经取得了有限的成功。一种中等界面张力的聚合物两相系统可以通过在相对高的浓度合并PEG和某些水结构性盐例如500mM疏酸铵来形成。PEG-盐两相系统是克服成本限制的一种可能的方案，但是增加PEG和盐的浓度产生了对于加工成本产生不利影响这样的挑战。这些包括粘性相，盐试剂成本，盐处置和装置腐蚀挑战，以及与生产量有关的目标物溶解性问题。结果，聚合物经常难以再循环或者必须通过进一步下游的加工来与目标物分离。在生物
技术领域：
中，聚合物两相系统(处于具有或者不具有明显的盐两种形式中)是普遍令人感兴趣的。这是因为它们容易用在小规模以及大规模分离中，当按比例增加到更大的体积时，没有效率损失或者成本的显著变化。同样，任何常规的分离方案例如电荷基的、疏水基的、亲合性基的或者粒径基的分离可以在聚合物两相系统中进行。通常许多不期望的成分例如细胞片段、内毒素、核酸稍微倾向于分配到PEG和葡聚糖或者PEG和盐两相系统中的下部相(分别富含葡聚糖的或者富含盐的相)中。因此，如果能够观察到一个系统提供了目标物在上部(富含PEG)相中的良好分配，则可以获得有效的初级分离和目标物浓度。此外，在克服与常规的色谱和/或过滤加工相关的缺陷的努力中，和在克服每个单元操作的单个理论分配步骤的局限的努力中，通过将一个相固定在色谱载体或者能够优先润湿该相的其他固载体上，而将液体-液体分配两相系统例如PEG-葡聚糖或者PEG-盐用于色i普法应用。然后将该补充相泵送通过色谱柱，来提供用于流动相和固定相之间平衡的重复的机会。这由W,Miiller等人在二十世纪八十年代在MerckDarmstadt进行了商业开发。US5093254(Giuliano等人)涉及公开了一种含水两相蛋白质分配系统，其使用聚乙烯吡咯烷酮作为上部相和麦芽糊精作为下部相，并且提供了用于蛋白质分配的低成本系统。该系统也可以与氯三嗪染料的氨基衍生物一起使用，该染料以非共价键的方式结合到PVP上，并且充当了待分离的蛋白质的配位体。应当说明的是这种系统的一个优点是它的成本效益，因为染料能够容易的结合到聚合物相上，而不必进行色谱法和溶剂萃取，该色谱法和溶剂萃取是在现有技术的PEG/羟丙基淀粉系统中形成共价键结合所必需的。但是，缺点是这样的染料可能的致癌作用。Albertsson(P.-A.Albertsson,■PartitionofCellParticlesandMacromolecules,第2版，WileyInterscience，纽约，1971第10章PhaseDiagrams,第250-313页)公开了包含PEG和Na羧甲基基团改性的葡聚糖(CMD)的系统。所述系统的缺点是(a)聚合物仍然包括了昂贵的多糖；(b)聚合物然后进一步化学改性；(c)所提到的高分子量(Mw2200000)和特性相粘度；和(c)形成相所需的相当高的聚合物浓度，其被期望结合水分子和降低系统蛋白质的溶解性。Gupta等人(VandanaGupta,SuniiNath,SubhashChandinPolymer43(2002)3387—3390:Roleofwaterstructureonphaseseparationinpolyelectrolyte-polyethyleneglycolbasedaqueoustwo-phasesystems)涉及对于聚电解质-聚乙二醇(PEG)基含水两相系统(ATPS)相分离行为进行的研究，目的是阐明控制相行为的机理。Gupta使用了数均分子量60000的聚乙烯亚胺(PEI);和平均分子量250000聚丙烯酸(PAA)的。从这个研究可以得出结论在ATPS的相分离中，盐-辅助的聚合物改性的水结构相互作用起到了核心的作用。Saravaanen(SettuSaravaanan，JohnyA.Reena，JonnalagaddaR.Rao,ThanapalanMurugesan,andBalanchandranU.NairinJ.Chem.Eng.Data2006,51,1246-1249:PhaseEquilibrumCompositions,Densities,andViscositiesofAqueousTwo-PhasePoly(ethyleneglycol)十Poly(acrylicacid)SystemsatVariousTemperatures)涉及一种温度对于不同的质量分率(从0.O5-0.50)的聚(丙烯酸)(PAA)水溶液的密度和粘度以及在平衡时的含水两相PEG-6000+PAA+水系统的液体-液体平衡、密度和粘度影响的研究。同样这里仍然存在着对于新颖的分离方法的大的需求，该方法是相对工艺简单和容易规模化的。
发明内容本发明一方面提供了一种分离生物分子和其他化合物的方法，其提供了高的动态能力和快速的质量转移。如附加的权利要求所述，这可以根据本发明，通过将所述的生物分子和/或化合物分配到一定的体积内来实现，而不分配到不溶的多孔基质，该基质的表面提供了通过受控的吸收对于目标物的俘获。因此，本发明的一个具体方面是提供这样的方法，其同样用于胶体粒子例如细胞，染色体等，其是不受这里固体载体干扰或者变得阻塞的色谱法或者过滤方案的影响。这可以通过使用本发明的具体的聚合物两相系统来实现。本发明另一方面是提供这样的聚合物两相系统的用途，其用于分离生物分子和其他化合物，该系统形成了自然的相分离，并且优选还需要不复杂的装置。本发明另一方面是提供这样的聚合物两相系统，该系统已经在添加剂例如用于有效分离生物分子的盐方面进行了优化。本发明另一方面是提供这样的两相系统的用途以及包含本发明的优化的两相系统的试剂盒。本发明的一个或多个方面可以如附加的4又利要求所述来实现。本发明另外的目标和优点将从下面的详细公开中变得显而易见。图1是一种本发明的含水聚合物两相系统的相图，该系统使用PEG4000和NaPolyacrylate8000(其是聚丙烯酸聚合物的钠形式)来形成。图2是一种本发明的两相系统的相图，该系统包含PEG8000和Napolyacrylate8000(其是聚丙烯酸聚合物的钠形式)。图3是一种图，表示了在室温时，在含有200mM硫酸钠并且调整到pH7的系统中，本发明的富含PEG8000的相(上部)和富含NaPAA15000的相(底部)的两相系统中的分配。图4表示了用于下面的实施例3的质粒DNA和RNA分配研究的上部和下部相样品的相系统电泳分析。图5表示了分配到系统的上部相中蛋白质的百分率，该系统的组成为6%PEG1500或者4000和6%NaPAA15000，300mMNaCl和20mM磷酸钠(pH5.5-7)。图6表示了分配到系统的上部富含PEG的相中蛋白质的百分率，该系统的组成为6%(w/w)PEG1500,NaPAA15000,20mM磷酸钠(pH6或者8)和250mM或者300mMNaCl。图7是一系列的三个照片，表示了包含重组体绿色荧光蛋白质(GFP)的E.coli细胞在本发明的两相系统中的分配，该系统包含6。/。PEG8000,8%NaPAA15000和150mM石舜酸钠(pH7)。定义本申请中所用的术语"聚酸(poly(acid))"是指线性的或者支化的聚酸主链，其含有多个酸基团作为侧基和/或端基。术语"目标化合物，，在此表示了化合物以及分子和细胞，即，任何的期望从液体中进行分离的实体。具体实施方式本发明涉及一种能够形成含水聚合物多相系统的液体混合物，其包含第一聚合物、第二合成聚合物和至少一种盐，该第一聚合物是合成聚酸，该第二合成聚合物是亲水性聚醚，其中该聚酸的分子量范围是1000-100000Da。本发明的液体混合物和多相系统中所用的聚合物是含水的，意思是在与水合并时，它们形成了水相。此外，如本领域技术人员所理解的那样，在本发明的上下文中，术语液体"混合物"仅仅指的是此处所述的成分的组合。在该条件下，这样的作为单相、两相或多相存在的液体混合物是从相图中可推断出来的。本发明的液体混合物的一个优点是它们产生了这样的相，其看起来比许多通常所研究的相系统更稀薄、目视更透明和更快的分离。聚酸可以是任何的合适的聚酸。因此，所述主链可以是烃链，聚醚，聚酯，聚酰胺，聚缩醛，聚氨酯或者聚砜。在一种实施方案中，该聚酸是烃(乙烯基聚合物)或者聚醚链。本领域技术人员能够容易的制备这样的聚酸。因此，在本发明液体混合物的一种实施方案中，聚酸选自使用例如下面的酸官能化的单体所形成的聚合物丙烯酸，曱基丙烯酸，衣康酸，巴豆酸，马来酸，富马酸，乙烯基安息香酸，丙烯酰氨基乙醇酸，琥珀酸丙烯酰氧乙基酯，乙烯基磺酸，苯乙烯磺酸，丙烯酰氨基甲基丙烷磺酸，乙烯基膦酸等等。在一种有利的实施方案中，聚酸是聚(丙烯酸)(PAA)或者聚丙烯酸盐。当用于聚合物多相系统中时，富含PAA的相将是透明的，快速分离的，并且表现出比葡聚糖基系统更低的粘度。本发明的能够形成PAA基多相系统的液体混合物是通过将例如40%的市售NaPAA溶液与亚乙基氧聚合物和盐进行合并来容易的形成的。聚酸可以处于酸、酸酐或者脱质子化的形式(即盐的形式)。在本发明液体混合物的一种实施方案中，聚酸聚合物的分子量范围是900-100000Da，例如1000-20000Da。在一种实施方案中，该分子量处于400-1000000Da的宽范围内。如本领域技术人员所理解的那样，对本发明的合成聚酸和聚酸进行选择，使其在盐存在下能够形成含水两相系统。本领域技术人员基于相图能够容易地推出，所述的聚合物作为单相或多相存在于系统中时的PH值，盐浓度，分子量等。9因此，在本发明系统的一种实施方案中，聚醚能够在聚酸和盐的存在下形成两种物理不同的相的系统，其中每个相富含了一种聚合物。在本发明液体混合物的一种实施方案中，聚醚分子量范围是900-100000Da，例如1000-20000Da。在一种实施方案中，该分子量处于400-1000000Da的宽范围内。在一种有利的实施方案中，聚醚是包含亚乙基氧单元的合成聚合物。在一种有利的实施方案中，该亚乙基氧聚合物选自水溶性聚醚，其包括聚乙二醇(PEG);处于无规共聚物形式(例如Breox⑧聚合物)或者嵌段共聚物(例如Pluronic⑧聚合物)形式的环氧乙烷环氧丙烷共聚物(E0P0)。如本领域技术人员将明白的那样，这些聚合物可以包括不同的改性形式，例如单曱氧基形式的PEG。在一种有利的实施方案中，亚乙基氧聚合物是PEG。在生物分子的分离中，通过目标物的局部化，PEG经常是有利的，这是因为它是生物相容性的，并且是一种可接受的FDA赋形剂；以及因为它能够容易的与蛋白质，细胞和其他目标物分离。在另外一种有利的实施方案中，亚乙基氧聚合物是环氧乙烷环氧丙烷共聚物(E0P0)。作为本领域技术人员已知的，EOPO通过加热分离成为两相，并且因此被认为是一种热分离聚合物。因此，在一种具体的实施方案中，亚乙基氧聚合物是一种热分离聚合物，例如E0P0。在该实施方案中，本发明的系统能够分离成为三相，其将在下面的使用本发明多相系统的方法的上下文中更详细的进行讨论。对于每个所面对的用途来说，可以对本发明的液体混合物的总聚合物浓度进行优化。例如，公知的是蛋白质和其他大分子可以通过加入相对大量的水溶性聚合物而从溶液中沉淀出来。所以，如果本发明的系统被用于蛋白质的分离中，则过高的总聚合物浓度将不允许足够的蛋白质溶解度来实现成本有效的分离。因此，在本发明液体混合物的一种实施方案中，对于分离生物分子和/或粒子来说，总聚合物含量有利的是占到了系统的大约8-20%(w/w)。在一种实施方案中，该液体混合物占10-20%(w/w)。在另外一种实施方案中，该液体混合物占水的大约70%。因此，在一种实施方案中，本发明的液体混合物包含大约4-6%的每个聚合物，例如大约5%,大约4.5%或者大约4%的每个聚合物。在另外一种实施方案中，该液体混合物包含高到大约10°/。的每个聚合物，例如大约8%的每个聚合物。因此，基于相图数据和任选的非常简单的例行试验，本领域技术人员能够容易的确定这样合适的条件例如pH和温度，在该条件时多相系统例如两相系统是由本发明的液体混合物形成的。在一种实施方案中，本发明的液体混合物的pH值接近于中性。形成两相系统所用的温度范围可以是4-3(TC，例如室温。如果由富含热分离聚合物的相来形成第三相，则该阶段时使用更高的温度。在本发明系统的一种具体的实施方案中，盐的浓度范围是l-500mM，例如低于300mM或者在100-300mM的范围内。如本领域技术人员将理解的那样，形成两相系统所需的盐的量将受到聚合物匿，浓度和物理状态的影响。因此如果将它用聚酸的钠或者其他的盐形式来配制，则形成两相系统仅仅需要100mM的緩沖液盐。在一种有利的实施方案中，该盐选自NaCl,Na2P04,KPO"NaS04，柠檬酸钾，(肌)肌,乙酸钠及其组合。基于霍夫麦斯特系列(HoffmeisterSeries),本领域技术人员可以容易的预测每个具体的盐对于相分离的影响，例如蛋白质的分离。这是因为公知的是处于霍夫麦斯特系列低端的盐例如NaCl将倾向于将净正电荷的蛋白质转移到富含亚乙基氧聚合物的相；而相反，处于霍夫麦斯特系列的更高端或者右端的盐将所述的蛋白质转移到富含聚酸的相。在一种实施方案中，本发明的液体混合物包含10%或者更少的盐。在一种具体的实施方案中，本发明的液体混合物包含一种或多种色谱法配位体。当将本发明的液体混合物用于生物分子或者粒子的分离时，这样的色谱法配位体可以用作一种工具，在该情况中配位体可以结合某些目标化合物，通过该配位体来将所述的目标化合物分配到有利的相。在一种实施方案中，该配位体是亲合性配位体，其能够通过"锁/钥匙"类型的高特效相互作用(例如在受体和配位体之间，或者抗体-抗原之间的相互作用)来结合目标分子。示例性的亲合配位体是例如蛋白质A或者蛋白质A基配位体。在一种有利的实施方案中，对该亲合性配位体进行聚合物改性，来促进它们向具体相的分配。在另外一种实施方案中，加入聚合物改性的亲合性配位体，来将相互作用性目标物分配到富集聚合物的相中，该聚合物最类似于连接到配位体的聚合物。由本发明的液体混合物(其包含亚乙基氧和含有酸基团的聚合物)所ii形成的两相系统可以包含其他带电的和不带电的基团，例如是由本发明人用PEG和聚(乙烯基曱醚-共聚-马来酸酐)所形成的两相系统的情况。由于上述的多相系统对于分配所涉及到液体是有用的，因此这样的方法能够容易的在线结合到其他通常使用的从堆栈的碟式离心机到色谱法和过滤的分离步骤上。因此，本发明一种有利的用途是分离生物分子或者粒子。在第二方面，本发明涉及本发明的液体混合物或者多相系统在分离至少一种目标化合物，例如生物分子，细胞或者粒子中的用途。该目标化合物可以是蛋白质，肽，核酸，细胞，病毒，或者上述任何一个的任何的部分、片段或者融合产物。因此，在一种实施方案中，目标化合物是抗体，或者其的片段或者融合产物。示例性的抗体片段是例如Fab片段。在另外一种实施方案中，目标化合物是核酸，例如DNA或者RNA,例如质粒，染色体组的DNA,适体(aptamer)或者低聚核苷酸。在另外一种实施方案中，该目标4b合物是细胞，例如真核细月包或者原核细胞，例如成年细胞或者祖细胞。在本申请中，术语"粒子"有时候用于表示细胞。在第三方面，本发明涉及一种从液体中分离至少一种目标化合物的方法，该方法包含(a)将合成聚合物与第二合成聚合物和至少一种盐进行合并，该合成聚合物是聚酸，该第二合成聚合物是亲水性聚醚；(b)将包含至少一种目标化合物的液体加入到获自(a)的系统中；(c)柔和的混合获自(b)的系统，直到至少形成两相；和任选的，(d)从一个相中回收期望的目标化合物。在该本发明方法的一种实施方案中，在步骤(a)中，提供了根据上述的本发明第一方面的液体混合物。因此，在一种实施方案中，聚酸分子量范围是1000-100000Da。在一种有利的实施方案中，该亲水性聚醚是一种亚乙基氧聚合物。在一种具体的实施方案中，在步骤(d)中，通过一种方法来从一个相中回收期望的目标化合物，所述的方法可以包括在溶液中自由的自然聚结使所形成的相区域(小滴)成更大的区域，或者通过^L用所施加的能量(离心分离，电泳，冷却)的帮助或者通过使用一个相在不同的表面(容器，离心机，过滤器，粒子等等)上相对于另一个相的优先润湿的帮助下聚结成更大的区域。在一种具体的实施方案中，本发明的方法包括步骤在聚合物分子量和pH对盐浓度之间选择合适的平衡，在该条件时形成了富含聚酸的相和富含亚乙基氧聚合物的相。如上所述，聚醚是一种热分离的聚合物例如EOPO，因此本发明的液体混合物能够形成三相。在第一实施方案中，本发明的方法包含形成上述的两相系统，随后除去富含聚酸的相，然后加热富含热分离的聚合物例如EOPO的相来提供第二个两相系统，目标物可以从该系统进行回收。但是，本发明人出乎意料的发现当本发明的液体混合物用于分离生物分子例如蛋白质时，在对富含热分离聚合物的相进^亍加热之前，除去富含聚酸的相不是必需的。因此，在一种可选择的实施方案中，本发明的方法包含加热两相系统，直到形成三相。在一种实施方案中，在步骤(a)中，通过一个相在另一个相存在下的表面优先润湿，将聚合物局限到基质或者其他表面上来提供(thepolymer(s)hasprovidedlocalizedonamatrixofothersurfaceviapreferentialwettingofthesurfacesbyonephaseinthepresenceoftheotherphase)。这样的润湿现象是公知的，并且包括天然表面的优先润湿，例如通过在低极性的富含PEG的相存在下，高极性的富含聚酸的相在不锈钢或者其他金属或者亲水性表面上的润湿。它们还可以包括富含PEG的相在低极性表面上的优先润湿。在另外一种实施方案中，使用单粒子或者粒子聚集体，并且所述粒子的直径典型的是小于200微米和大于5nm。粒子和/或聚集体可以用聚合物共价改性或者以其它方式改性(becovalentlyorotherwisemodifiedwithpolymers);包4舌4吏用不同的聚合物改性的"配位体"例如通常用于下面中的这些配位体免疫-，外源凝集素-或者金属离子-或者其他-亲合色谱法，以及离子交换色谱法，疏水相互作用色谦法(HIC),和其他模式的色谱法，包括离子-pi，p-p和其他相互作用，包括基于范德华或者分散相互作用的这些。在第四方面，本发明涉及一种用于分离至少一种目标化合物，例如生物分子，细胞或者粒子的试剂盒，该试剂盒包含上述的本发明的液体混合物或者多相系统。在该试剂盒一种实施方案中，液体混合物或者多相系统被提供在塑料袋中。试剂盒不同的成分可以存在于容器例如塑料袋的分开的分隔间中。在一种有利的实施方案中，该塑料袋是这样的尺寸，其允许加入从其中分离一种或多种目标化合物的液体，并且包含了用于添加供料的装置以及用于混合的装置。在一种有利的实施方案中，本发明的试剂盒至少包含聚合物，其是在水溶液中的合成聚酸或者干燥形式的合成聚酸。该试剂盒可以包含用法说明，例如书写的或者其他存在的说明，用于它在目标化合物分离中的使用。在一种具体的实施方案，试剂盒还包含第二合成聚合物(其含有亚乙基氧)，和至少一种盐，其中聚酸分子量范围是1000-100000Da。附图详细说明除非另有指示，否则下面的百分比是作为重量/重量(w/w)给出的。图1表示了本发明的含水聚合物两相系统的相图，该系统使用PEG4000和NaPolyacrylate8000来形成。更具体的，该系统是用22。C的200mMNaCl形成的。双节点曲线是通过将系统滴定到与下面相关的浓度点来肉眼评^f介的圆形两相系统；正方形单相系统；和三角形明显处于双峰区域并且难以分派的系统。本发明的相在相对低的(总)聚合物浓度时形成，并且它们是透明的，相对低的粘度，和在单位重力下快速分离。此外该相双节点曲线在接近于临界点时线性更大，这表明接近于这个区域所形成的两相系统将具有显著的连线(tie-line)长度，并且因此在物理性能方面以及在分配结果方面具有更大的可再现性。应当指出的是在双峰曲线上，双峰聚合物浓度上最低的总聚合物浓度出现在大约12%，这对应于6%的每个聚合物。图2是本发明两相系统的相图，该系统包含PEG8000和Na-polyacrylate8000。该图指的是用25°C的大约230mMNa2S04(3%重量)形成的系统。相组成确定；(圓形)两相系统，(正方形)单相系统，(三角形)明显处于双峰区域并且难以分派的系统。本发明的相在相对低的(总)聚合物浓度时形成，并且是透明的，相对低的粘度，和在单位重力下快速分离。此外该相双节点曲线在接近于临界点时线性更大，这表明接近于这个区域所形成的两相系统将在物理性能方面以及在分配结果方面具有更大的可再现性。应当指出的是在双峰曲线上最低的总聚合物浓度出现在大约10%，这对应于5°/。的每个聚合物，与图1相比，其与硫酸钠盐更大的水结构效应是一致的。图3是一种图，表示了在室温时，在含有200mM^L酸钠并且调整到pH7的系统中，本发明的富含PEG8000的相(上部)和富含NaPAA15000的相(底部)的两相系统中的分配。该系统4皮表示为(x-y),这里x是PEGwt°/。，y是NaPAAwt。/。。在这种情况中，临界浓度位于每个聚合物的4°/。-4.5%之间的某处，这允许比图2更高的MWNaPAA聚合物和更低温度时更大的相形成能力。实现了大约相等的相体积的相系统。类似的结果可以在含有NaPAA8000的系统(未示出)中看到。图4表示了如下面的实施例3中更详细描述的质粒DNA和RNA分配研究的上部和下部相才羊品的相系统电泳分析。标准物和上部和下部相样品的电泳用于上表中的6%PEG8000,6°/。NaPAA8000，3%硫酸钠，lOmM磷酸钠，pH7系统。通道(Lanes)l-3是47min,用于进行pDNA，通道4-6是30分钟，用于进行RNA。通道分配是1MW标准物，2上部相，3下部相，4MW标准物，5上部相，6下部相。图5表示了分配到系统的上部相中的模型蛋白质肌球蛋白和牛血清的蛋白(BSA)百分率，该系统的组成是6。/。PEG1500或者4000和6，aPAA15000，300mMNaCl和20mM磷酸钠pH5.5-7。图6表示了分配到系统的上部富含PEG相中的蛋白质的百分率，该系统的组成为6%PEG1500，NaPAA15000，20mM磷酸钠pH6或者8和250mM或者300mMNaCl。图7是一系列的三个照片，表示了包含重组体绿色荧光蛋白质(GFP)的E.coli细胞在本发明的两相系统中的分配，该系统包含6y。PEG8000，8%NaPAA15000和150mM磷酸钠(pH7)。从该图可见，完整细胞分配到上部富含PEG的相中，相反，溶解的细胞分配到上部相中，然后在轻的离心分离之后转移到界面上。从溶解的细胞中释放的GFP和其他释放的蛋白质稍微有利的分配到上部相中。这是通过将所述的管适度的离心分离来将溶解的细胞带到界面而观察到的。这些结果表明对于NaPAA基两相系统来说，可以找到具体的相系统，其处于适于大部分细胞分配的盐浓度范围中，并且这样的系统可以将细菌或者其他细胞不对称的分配到所述的相之间。试验提供了本发明的实施例仅仅用于示例性目的，并且绝对不应当被解释为对附加的权利要求所定义的本发明的限制。实施例1-本发明的两相系统的制备和相图15原料聚合物聚(乙二醇)4000(Merck)，PEG8000(Sigma-Aldrich)，聚丙烯酸钠，来自Aldrich，CAS号:9003-04-7,分子量30000(在40wt%的水溶液中)，分子量8000(在45wt。/。的水溶液中)。NaCl和Na2S04甲醇，Ba(N03)2(来自Merck和P.A.quality)。^敬孔过滤水被用于全部的溶液中。相图的确定主干(stem)(双峰)的相边界是通过公知的方法滴定法来确定的[参见MethodsinEnzymology，第228巻,AqueousTwo-PhaseSystems,HarryWalter和G.Johanssoneds.AcademicPress,纽约,1994]。在该情况中，制造了这样的系统，其具有被怀疑处于两相区域中的组成。如果该系统在混合时变混浊，则它表明两相系统的存在。通过加入具有与所研究的系统相同盐浓度的盐溶液，该系统的聚合物被稀释。如果该聚合物浓度低于临界值，则该系统变成单相系统，其在混合时不变混浊。通过加入聚合物和继续稀释该系统，在该相边界的两侧绘制了相图，即，双节点曲线。该系统是在22°C(室温)和25°C(水浴)测量的。折射率测量在富含水的溶液(〉9oy。)中，溶液的折射率是线性增加的性能。制造了单独的已知浓度的PEG-水，聚丙烯酸钠-水，和盐-水溶液的标准曲线。折射率仪器获自CarlZeiss(Oberkochen，Wtirttemberg,德国)。PEG的确定因为盐和聚丙烯酸钠在甲醇中的溶解度非常低(<0.lwtW,而PEG具有非常高的溶解度，因此能够选择性的将PEG萃取到曱醇中，并且通过蒸发甲醇重量分析来确定PEG。将1.OOg的上部相或者底部相与至少6g的曱醇进行混合。形成了聚丙烯酸钠和盐的沉淀物，并且在3000xg离心分离10min。收集含有PEG的上清液，并且放入高度已知的15ml玻璃管中。用2g甲醇进一步清洗沉淀物，随后进行离心分离。将后者的上清液部分与第一个部分进行合并。将这个管敞开放置在排风罩中3天。大部分的曱醇被蒸发，并且将残留的曱醇在7(TC的烘箱中蒸发。称重所迷的管，并且重量分析来确定干燥的PEG。Na2S(h的确定硫酸钠盐可以通过用硫酸钡滴定来确定。但是，因为聚丙烯酸钠是通过二价阳离子沉淀的，因此在分析之前必须将这个聚合物除去。这是如下来进行的将lg样品(上部-或者底部相)加入到15ml玻璃管(A)中。将0.lgNa-polyacrylate8000，(浓度:45wt。/。水溶液)和0.3gPEG8000(浓度30wt。/。水溶液)和0.2gHCL(37wt。/。)加入到所述样品中，并且产生涡流，最后在3000xg离心分离。形成了含有底部粘稠相的两相系统，该相包含高浓度的PEG和聚丙烯酸。上部相是富含水的相。体积比是高的(〉10)。仔细的收集富含水的相，并且放入具有已知重量的另一个15ml玻璃管(B)中。加入1.5g到玻璃管(A)中的粘稠相中，旋涡化，并在3000xg离心分离。重新仔细收集富含水的相，并且放入管(B)中。在这个程序中，将PEG和聚丙烯酸与含有全部的Na2S04的水溶液分离除去。现在将1.5g的13'w't。/。Ba(NO^温水溶液加入到含有疏酸盐的管(B)中，并且立即形成BaS04的沉淀。将该管(B)在3000xg离心分离，丢弃上清液。将这个过程重复3次来除去痕量的可溶材料。将带有BaSO,沉淀物的管(B)在70。C的烘箱中干燥3天。重量分析来确定BaS04的量，然后可以计算Na2S0^的浓度。聚丙烯酸钠的确定聚丙烯酸钠的浓度是通过下面的方法，由折射率(RI)来确定的。测定稀释3倍的相的RI。该值包含了PEG和盐的贡献。由所确定的已知浓度的PEG和盐来确定它们对于折射率的贡献。所产生的值归因于聚丙烯酸钠，其是通过以前所确定的标准曲线来确定的。相分离含水聚合物相系统是根据用于这样的系统的标准来制备的。为了获得将干燥聚合物变成完全水合(其在静置的溶液中可以花费24小时)所需的大致的时间，配制了典型的30-40重量％的聚合物的储备溶液。在NaPAA的情况中，这样的储备溶液可能是市购的。在PEG的情况中，这样的储备溶液是通过操作者配制的。所以NaCl(1M)或者其他盐的储备溶液例如0.5M磷酸钠pH6.8也是配制的。为了制备1000g(大约1L)的由6%PEG,6。/。NaPAA，300mMNaCl，50mM磷酸钠组成的相系统，简单地混合150g的PEG储备溶液、150g的NaPAA储备溶液、300g的NaCl储备溶液和100g的磷酸钠储备溶液，然后加水到所期望的总量。一旦进行了配制，则这样的系统可以搅拌几分钟来确保完全混合，然后使其自然地分成两相。为了制备10ml相同的系统，将简单的需要IOO倍的更少量的每个储备溶液。两相系统是通过将PEG、聚丙烯酸钠和盐的储备溶液混合到12ml的规格的玻璃管中来形成的。该系统的总重量是10g。将系统上下混合大概15次，该系统变得完全混浊。然后使得该系统在25。C的水浴中分离。该系统通常在30min内完全分离。但是，可以将该系统放置1-2小时。所述相的折射率非常类似，所以难以发现界面。分离的相是透明的，并且具有相当低的粘度(目视观察)。下表1提供了关于不同的测试的含有PEG4000或者8000和NaPAA8000或者30000和NaCl或者硫酸钠的两相系统的信息。在22。C的PEG4000和NaPAA8000两相系统分别接近于5.28和5.68%,这与低的PEG聚合物MW相一致。比较起来，PEG4000和NaPAA30000临界浓度是大约4.7重量％的每个聚合物。表l:PEG4000或者8000和NaPAA8000或者30000两相系统*PEG聚丙烯酸钠盐类型和浓度在给定温度2小时后观察的相分离Mw4000,Mw30000,NaCl22'C明显处于双峰，并且接近于临界浓'4.7wt%4.7wt%150mM度**Mw4000,Mw8000,NaCl22。C两相系统接近于双节点(参见图1)5.42wty。5.77wt。/。200mMMw4000，Mw8000,NaCl22'C单相系统，接近于双节点5.28wt%5.68wt%200mMMw8000,Mw謂O,Na肌25'C两相系统(参见图2)5.OOwty。5.00wt%230mM*pH~7.5,1.05wt°/。NaCl是大约150mM，3.00wt°/。Na2SO4是大约230mM。**低于这个的聚合物浓度或者低于这个的盐浓度导致了系统在2小时的期间不出现分离成两相。实施例2-盐和pH对于本发明两相系统的作用如上所述来制备两相系统。研究了pH对于EOPO3900和NaPAA15000系统的作用。结果表示在下表2中，其提供在200mMNaP緩冲液中的含有EOPO和NaPAA的两相系统中，pH对于相体积比和相系统形成的作用的观察。在这些聚合物分子量、浓度和盐条件时，两相是在pH6-8形成，而非pH5。表2:盐和pH对于EOPO3900NaPAA15000两相系统的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例3-生物分子在聚合物两相系统中的分配将质粒DNA和RNA如下分配到本发明的两相系统中pDNA和RNA的分配结果进一步使用Phast⑧系统，和DRIgest111⑧分子量标准物(GEHealthcare)和用于这样的样品的出版的GEHealthcare协议，通过凝胶电泳来-险证。运行时间对于pDNA(图1，通道l-3)来i兌是47分钟，对于RNA(图1，通道4-6)来说是30分钟。结果表示在图4和下表中。表3:质粒DNA，RNA和模型蛋白质在本发明的不同的APTP系统中的单步分配<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>a.聚合物和盐的组成以Q/。w/w给出。系统处于20。CpH7。/。分配结果是平均值(X),典型的基于n=3试验，并且典型的SD<0.IX。b.系统是使用45%(w/w)NaPAA8000Sigma-AldrichNo.416029(Batch12630LC)或者35%(w/w)NaPAA15000Sigma-AldrichNo.416037(Batch05206CA)来配制的。c.系统是使用质粒DNA(pDNA),RNA和测试蛋白质样品来进行评价的。测试蛋白质是多克隆人类IgG样品(Gammanorm,0ctapha函)。a/。分配结果是平均值(X),基于n=3试验，并且典型的SD<0.IX。d.将0.25mg(360pl的0.683mg/ml储备溶液U1504:IOO)总量的pDNA(6kbp的pJV4)初始时引入到每个管中。产生了总共-O.05mg/ml的[pDNA]。将RNA(U1489088)初始溶解在2.1M(NH4)2S04水溶液中，并且在使用之前，需要使用PD-10色谱柱(GEHealthcare代号No.17-0851-01)进行脱盐。将该脱过盐的RNA储备溶液([RNA]0.16mg/ml)加入到每个管中(386pl的RNA储备溶液，62.5pg的RNA)，来产生0.025mg/ml的总[RNA]/管。权利要求1.一种能够形成多相系统的液体混合物，该液体包含第一聚合物、第二聚合物和至少一种盐，该第一聚合物是聚酸，该第二聚合物是聚醚，其中该第一聚合物的分子量范围是1000-100000Da。2.根据权利要求1的液体混合物，其中该第一聚合物选自聚(丙烯酸)和聚(曱基丙烯酸)。3.根据权利要求1或者2的液体混合物，其中该第一聚合物和第二聚合物中的至少一个是合成聚合物。4.根据任何一个前述权利要求的液体混合物，其中该第二聚合物的分子量范围是900-100000Da。5.根据任何一个前述权利要求的液体混合物，其中该第二聚合物包含亚乙基氧。6.根据任何一个前述权利要求的液体混合物，其中该亚乙基氧聚合物选自聚乙二醇、环氧乙烷环氧丙烷共聚物(EOPO)、BreoxTM、Pluronic丁M和含有乙氧基的多糖。7.根据任何一个前述权利要求的液体混合物，其中所述盐的浓度范围是l-500mM,优选的范围是100-300mM。8.根据任何一个前述权利要求的液体混合物，其中所述的盐选自NaCl、Na2P04、KP04、NaS04、柠檬酸钾、(NH,)2S04和乙酸钠;或者其任意的组合。9.根据任何一个前述权利要求的液体混合物，其中总聚合物含量占到了大约8-20%(w/w)。10.根据任何一个前述权利要求的液体混合物，其包含三种或更多种聚合物。11.一种多相系统，其是通过权利要求1-10中任何一个所述的液体混合物来形成的。12.多相系统在至少一种的生物分子、细胞或者粒子的分离中的用途，该多相体系是根据权利要求1-10中任何一个的液体混合物来形成的。13.—种从液体中分离至少一种生物分子或者粒子的方法，该方法包含(a)将第一聚合物与第二聚合物和至少一种盐进行合并，该第一聚合物是聚酸，该第二聚合物是亲水性聚醚；(b)将包含至少一种生物分子或者至少一种粒子的液体与获自(a)的系统进4亍合并；(c)柔和地混合获自(b)的液体混合物，直到至少形成两相；和任选的，(d)从一个相中回收期望的生物分子或者粒子。14.根据权利要求13的方法，其中该聚酸的分子量范围是1000-100000Da。15.根据权利要求13或者14的方法，其中该聚醚包含亚乙基氧。16.根据权利要求13-15中任何一个的方法，其中在步骤(a)中，提供了根据权利要求1-9中任何一个的液体混合物。17.根据权利要求13-16中任何一个的方法，其中在步骤(a)中，通过优先润湿将聚合物局限到基质上来提供。18.根据权利要求11-13中任何一个的方法，其中使用单粒子或者粒子的聚集体，并且其中所述粒子的直径典型的是小于200微米和大于5nm。19.根据权利要求18的方法，其中该粒子和/或聚集体用聚合物共价改性或者以其它方式改性。20.—种用于分离至少一种的目标化合物，细胞或者粒子的试剂盒，该试剂盒包含根据权利要求1-10的任何一个的液体混合物，或者通过权利要求1-10任何一个的液体混合物所形成的多相系统。21.—种用于分离至少一种目标化合物的试剂盒，该试剂盒包含在分开的分隔间中的第一聚合物、第二聚合物和至少一种盐，以及使用它的书面说明，该第一聚合物是聚酸，该第二聚合物是聚醚，其中该聚酸的分子量范围是1000-100000Da。22.根据权利要求20或者21的试剂盒，其中所述的成分提供在塑料袋中。23.—种用于进行权利要求13-18中任何一个的方法的试剂盒，该试剂盒包含至少一种在水溶液中的聚酸或者干燥形式的聚酸。24.根据权利要求23的试剂盒，其还包含含有亚乙基氧的第二聚合物，和至少一种盐，其中该聚酸的分子量范围是1000-100000Da。25.—种试剂盒，这里一种或多种聚合物富集的相位于容器、粒子或者过滤器的表面上。全文摘要本发明涉及一种液体混合物，其包含第一聚合物、第二聚合物和至少一种盐，该第一聚合物是聚酸，该第二聚合物是聚醚，其中该聚酸的分子量范围是1000-100000Da。对该第二聚合物进行选择，来使得其能够在聚酸和盐的存在下形成不混溶的水相。该聚酸可以选自聚(丙烯酸)和聚(甲基丙烯酸)，并且该第二合成聚合物可以包含亚乙基氧。本发明可以用于分离生物分子，细胞或者粒子。文档编号C07K1/20GK101679480SQ200880020822公开日2010年3月24日申请日期2008年6月16日优先权日2007年6月19日发明者E·马塞多,G·马尔姆奎斯特,H·O·约翰松,J·沙纳加,J·范阿尔施泰恩,K·拉基,R·约特申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司