牛膝糖聚合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药及保健食品技术领域，具体涉及植物中糖聚合物的制备方法，更 具体的说涉及怀牛膝粗糖聚合物、精糖聚合物的制备方法，还涉及该牛膝粗糖聚合物在预 防和/或治疗骨质疏松症中的应用。本发明中的糖聚合物包括多糖和寡糖。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症（osteoporosis, 0P)是一种以骨矿物量减少、骨微结构破坏、骨强度 降低，从而导致骨的脆性增加和易于发生骨折为特征的疾病。骨质疏松症是一种多发性的 老年性疾病，随着人口的老龄化日趋严重，骨质疏松症已严重危害老年人健康。绝经后女性 因受到衰老和体内激素水平下降的双重影响，成为该病最大的受害人群，约占总患病人数 70%以上。目前防治骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和矿化药物，这 些药物均属替代治疗，在长期使用过程中，具有毒副作用大，靶向性低，依从性差，费用高等 缺点。因此，有必要找寻到一种高效、低毒的药物来治疗骨质疏松症。中药在治疗骨质疏松 症方面具有悠久历史，具有全身调理、毒副作用小、价格低廉等优势，越来越受到人们的关 注。而在众多中药中，补肾壮骨类中药由于良好的疗效一直受到人们的青睐。
[0003] 牛膝（B. 1)为苋科植物牛膝的干燥根，为"四大怀药"之 一。具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功，主要用于腰膝酸痛、筋骨无力、经闭症 瘕、肝阳眩晕之症。历代本草明确记载治疗"骨痹"、"骨痿"的方剂共21个，涉及药物77种， 其中牛膝出现11次。牛膝糖聚合物作为牛膝的主要活性成分之一，已被报道具有免疫调 节、抗肿瘤、降血糖、保护肝肾等多种药理活性。
[0004] 目前，国内外对牛膝糖聚合物的研究主要集中在其抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降 糖、抗衰老等方面的活性研究，对其在防治骨质疏松症方面的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种牛膝糖聚合物ABW3-1。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种牛膝中糖聚合物的提取方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述牛膝糖聚合物在制备防治骨质疏松药物或保健 食品或功能食品中的应用。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种牛膝糖聚合物ABW3 -1，该糖聚合物是由葡萄糖和果糖组成的寡糖，其结构为：
[0009] -种牛膝中糖聚合物的提取方法，该方法包括以下操作步骤： 1) 剪切：将牛膝干燥根切成小段，用水清洗干净、晾干； 2) 水提：将剪切好的牛膝进行水提，分别收集提取液和残渣； 3) 分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB1 ;将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB2 ;将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为c%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB3 ;其中10彡a<b<c< 100 ; 4) 碱提：将水提后的残渣浸泡于0. 1~1MNaOH溶液中，静置1~4h，上清液用0. 1~ 1MHC1进行中和，使上清液的pH为6~8,离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓 度为50~90%，静置，收集沉淀，即得碱提粗糖聚合物ABB; 5) 纯化：对上述粗糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB进行纯化，即得牛膝糖聚合物。
[0010] 进一步的，步骤2)中所述水提的具体操作为用5~15倍体积的60~100°C热水对 切好的牛膝进行提取，提取时间1~4h。
[0011] 进一步的，步骤3)中所有所述浓缩为40~70°C减压浓缩，所有所述静置的时间为 10 ~28h〇
[0012] 进一步的，步骤 3)中 10 彡a< 60,60 <b< 80,80 <c< 100。
[0013] 进一步的，将步骤5)中纯化后的糖聚合物AB3再进行离子交换柱层析，用蒸馏水 进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥；然 后用水溶解，离心，取上清液进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟 踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥后获得牛膝糖聚合物ABW3-1。
[0014] 牛膝糖聚合物，该糖聚合物的提取方法为上述所述的提取方法。
[0015] 牛膝糖聚合物ABW3-1在制备防治骨质疏松的药物或保健食品或功能食品中的应 用。
[0016] 牛膝糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB在制备防治骨质疏松的药物或保健食品或功能 食品中的应用。
[0017] 牛膝糖聚合物在制备防治骨质疏松的药物或保健食品或功能食品中的应用。
[0018]本发明的有益效果是： 1.本发明利用离子交换层析和分子筛凝胶柱层析方法纯化牛膝糖聚合物，首次制备 出一种牛膝精寡糖，并且对该精寡糖的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴 定，并成功得出了该寡糖的特征结构。本发明提供了牛膝中粗糖聚合物、精糖聚合物的制备 方法及牛膝糖聚合物在抗骨质疏松方面的活性研究，为牛膝糖聚合物在医药、保健品等领 域的应用提供依据。
[0019] 2.与传统水煮法提取糖聚合物相比，本发明采用水提醇沉法和碱提法的结合，乙 醇浓度由低到高进行分级醇沉，对牛膝糖聚合物进行初步分离，同时高浓度乙醇能将极性 大、水溶性好的糖聚合物与极性小、水溶性差的糖聚合物分离，使所提取的糖聚合物组合物 含有更多种类的糖聚合物成分。且本制备工艺简单，操作方便，且可以大规模生产。
[0020] 3.本发明中通过柱层析法对牛膝粗糖聚合物进行分离纯化，效果显著，首次制备 出一种牛膝寡糖纯品。
[0021] 4.本发明对制备出的一种牛膝寡糖结构进行了鉴定，明确了该寡糖的理化性质 及结构，为探究其药理活性机制提供结构依据。
[0022] 5.本发明提供了牛膝中具有抗骨质疏松活性的成分的制备方法，并且筛选出了 含量高、活性强的糖聚合物部位。
【附图说明】
[0023]图 1 为ABW3-1 的HPGPC色谱图； 图2为ABW3-1的红外图谱； 图3为ABW3-1的13CNMR图谱； 图4为ABW3-1的1HNMR图谱； 图5为ABW3-1的HSQC图谱； 图6为ABW3-1的HMBC图谱； 图7为牛膝糖聚合物对去卵巢大鼠体重的影响； 图8为牛膝糖聚合物对去卵巢大鼠子宫系数的影响； 图9为牛膝糖聚合物对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响； 图10为牛膝糖聚合物对去卵巢大鼠腰椎骨骨密度的影响； 图11为牛膝糖聚合物对去卵巢大鼠股骨骨矿物量的影响； 图12为牛膝糖聚合物对去卵巢大鼠腰椎骨骨矿物量的影响。
【具体实施方式】
[0024] 1.牛膝中糖聚合物的提取方法，该方法包括以下操作步骤： 1) 剪切：将牛膝干燥根切成小段，用冷水快速清洗、晾干； 2) 水提：将剪切好的牛膝进行水提，分别收集提取液和残渣； 3) 分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB1 ;将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB2 ;将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为c%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB3 ;其中10彡a<b<c< 100 ;更优选的10彡a<b<c< 100,且10彡a < 60,60 <b< 80,80 <c< 100 ； 4) 碱提：将水提后的残渣浸泡于0. 1~1MNaOH溶液中，静置1~4h，上清液用0. 1~ 1MHC1进行中和，使上清液的pH为6~8,离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓 度为50~90%，静置，收集沉淀，即得碱提粗糖聚合物ABB; 5)纯化：对上述粗糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB进行纯化，即得牛膝糖聚合物。
[0025] 优选的，步骤1)中所述小段为1~2cm的小段。
[0026] 优选的，步骤2)中所述水提的具体操作为用5~15倍体积的60~100°C热水对牛 膝进行提取，提取时间1~4h。
[0027] 优选的，步骤3)中所有所述浓缩为40~70°C减压浓缩，所有醇沉静置的时间为 10 ~28h〇
[0028] 优选的，步骤4)中NaOH溶液用量体积为残渣体积的10~20倍。
[0029] 优选的，步骤5)中所述纯化具体操作为利用Sevag法分别对粗糖聚合物AB1、AB2、 AB3、ABB除蛋白，除蛋白后再经透析袋进行透析、冻干。
[0030] 优选的，上述透析袋的截留分子量为3000Da。
[0031] 优选的，对步骤5)中纯化后的