lOmin后取血清，-80°C冰冻保存 备用）。
[0065] 3)取右侧胫骨、股骨和第五腰椎，置装有4%PBS多聚甲醛溶液的尿杯中，待24h后 更换70%的乙醇溶液。-20°C冷冻保存。
[0066] 4)取左侧股骨、胫骨和第三、四腰椎，生理盐水纱布包裹并用锡箱纸外包裹，于密 封袋中，分装置于-80°C冰冻保存。
[0067] 1.4大鼠骨密度测定 采用双能X线骨密度仪HologicDiscoveryWI85003DXA检测第四腰椎骨（L4)和 左股骨的全骨密度（bonemineraldensity，BMD)、前端股骨骨密度（lcm)、末端股骨骨密 度（2cm)和骨矿物含量（bonemineralcontent，BMC) 〇
[0068] 1.5骨生物力学测试 测试时，将-80°C保存的股骨和椎骨置于-20°C预解冻，而后常温解冻，用生理盐水复 湿。采用Mini858Bionix材料测试系统分析左股骨(三点弯曲实验）的生物力学性能。测 试时MTS试验机上，用1mm直径的压头，加载速度为6mm/min，跨距（L)是15mm，传感器为 500N。仪器自动记录每个时刻点的载荷和桡度变化值，绘制载荷-桡度曲线，并获得相应的 参数。
[0069] 实验结果 2.1牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠体重影响 牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠体重影响见图7,各组动物给药后与给药前比较，体重 均明显增加。与SHAM组比较，0VX大鼠去卵巢十周后，体重明显增加（P〈0. 01)，提示去卵 巢使得大鼠体重明显增加。与0VX组相比，牛膝糖聚合物AB1、AB2、AB3和ABB给药组自第 七周后，体重增加开始减轻（P〈〇. 05)，阳性对照组第十周后体重增加的趋势也出现明显抑 制。说明给药组与阳性组E2均能抑制去卵巢大鼠体重的增加。
[0070] 2.2牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠子宫系数的影响 牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠子宫系数的影响见图8,与SHAM组比较，0VX大鼠去 卵巢后子宫系数明显减小（P〈〇. 05)，提示去卵巢使得大鼠子宫萎缩，重量减轻。与0VX组相 比，AB1、AB2、AB3给药组与阳性组E2能明显增加去卵巢大鼠子宫重量。说明这三个给药组 与阳性组能使去卵巢大鼠子宫萎缩得到改善。
[0071] 2.3牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠股骨与腰椎骨骨密度的影响 牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠股骨与腰椎骨骨密度（BMD，bonemineraldensity) 的影响见图9、10,与SHAM组比较，0VX去卵巢大鼠的股骨（图9)与腰椎骨（图10)骨密度 出现明显减小（P〈〇. 01)，提示去卵巢大鼠成功复制原发性骨质疏松症。与0VX组相比，AB1、 AB2、AB3给药组与阳性组E2能明显增加去卵巢大鼠股骨（图9)与腰椎骨（图10)的骨密度 (P〈0. 05)。说明相应给药组与阳性组E2能够有效的防治大鼠的骨质疏松症状。
[0072] 2.4牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠股骨与腰椎骨骨矿物量的影响 牛膝糖聚合物对去卵巢雌性大鼠股骨与腰椎骨矿物量的影响见图11、12,与SHAM组比 较，0VX大鼠股骨与腰椎骨矿物量出现明显减小（P〈0. 01)，提示去卵巢大鼠成功复制原发 性骨质疏松症。与0VX组相比，AB1、AB2、AB3给药组与阳性组E2均能明显增加去卵巢大鼠 股骨矿物量(见图11) ;AB1、AB2给药组明显增加去卵巢大鼠腰椎骨矿物量（P〈0. 05)(见图 12)，上述结果说明各牛膝糖聚合物给药组均有一定防治骨质疏松症的作用。
[0073] 2.5牛膝糖聚合物对股骨生物力学的影响 表2牛膝糖聚合物对股骨生物力学的影响
表中所有数值均为平均值土SD. *P〈 0.05，#P〈 0.01vs.OVX; #P〈 0.05， 〈0.01vs.SHAM。
[0074] 牛膝糖聚合物对股骨生物力学的影响见表2,与SHAM组比较，OVX大鼠股骨生物 力学相关参数均出现减小，提示去卵巢后大鼠生物力学性能下降；与0VX组相比，给药组均 能有效改善去卵巢大鼠生物力学性能，上述结果说明给药组均有一定防治骨质疏松症的作 用。
[0075] 本发明所提取的牛膝寡糖ABW3-1可能是发挥上述抗骨质疏松作用的有效成分之 一，也具有显著增加去卵巢大鼠股骨与腰椎骨密度以及骨矿物量的作用，其明显改善骨生 物力学性能的作用机制有待进一步研究。
[0076] 结论 雌性大鼠的卵巢切除后，雌激素水平降低、骨代谢活跃、骨转换增强、骨矿物量丢失， 是经典的模仿妇女绝经时高转换型骨质疏松症的模型。本实验研究表明，通过上述方法提 取的各个部位的牛膝糖聚合物均能显著增加去卵巢大鼠股骨与腰椎骨密度以及骨矿物量， 明显改善骨生物力学性能，因而发挥其治疗模型大鼠骨质疏松症的作用。
[0077]后续需对牛膝糖聚合物的抗骨质疏松机制进行研究，而均一糖聚合物的结构鉴定 将为探究牛膝糖聚合物抗骨质疏松的机制提供有力依据。
[0078] 以上所述的仅是本发明的一些实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例 的限制。对于本领域的普通技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下 所作的改变、修饰、代替、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种牛膝糖聚合物ABW3-1，其特征在于：该糖聚合物是由葡萄糖和果糖组成的寡 糖，其结构为：2. -种牛膝中糖聚合物的提取方法，其特征在于：该方法包括以下操作步骤： 1) 剪切：将牛膝干燥根切成小段，用水清洗干净、晾干； 2) 水提：将剪切好的牛膝进行水提，分别收集提取液和残渣； 3) 分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物ABl;将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB2 ;将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为c%，静置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB3 ;其中10彡a<b<c< 100 ; 4)碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1~IMNaOH溶液中，静置1~4h，上清液用0.1~ IMHCl进行中和，使上清液的pH为6~8,离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓 度为50~90%，静置，收集沉淀，即得碱提粗糖聚合物ABB; 5)纯化：对上述粗糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB进行纯化，即得牛膝糖聚合物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述水提的具体操作为用5~ 15倍体积的60~100°C热水对切好的牛膝进行提取，提取时间1~4h。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)中所有所述浓缩为40~70°C减 压浓缩，所有所述静置的时间为10~28h。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)中10 <a< 60,60 <b< 80,80 <c< IOOo6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将步骤5)中纯化后的糖聚合物AB3再进 行离子交换柱层析，用蒸馏水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收 集糖部分，浓缩，冷冻干燥；然后用水溶解，离心，取上清液进行分子筛凝胶柱层析，用水进 行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥后获 得牛膝糖聚合物ABW3-1。7. 牛膝糖聚合物，其特征在于：该糖聚合物的提取方法为权利要求2~6中任一所述 的方法。8. 权利要求1所述的牛膝糖聚合物ABW3-1在制备防治骨质疏松的药物或保健食品或 功能食品中的应用。9. 权利要求2所述的牛膝糖聚合物ABl、AB2、AB3、ABB在制备防治骨质疏松的药物或 保健食品或功能食品中的应用。10. 权利要求7所述的牛膝糖聚合物在制备防治骨质疏松的药物或保健食品或功能食 品中的应用D
【专利摘要】本发明公开了牛膝中的糖聚合物及其制备方法和用途，该方法为以牛膝为原料，通过水提醇沉和碱提醇沉的结合获得各部位牛膝聚合物，该提取方法在比较温和的条件下进行，完好的保存了糖聚合物的组分。该牛膝糖聚合物在抗骨质疏松症方面具有显著效果，另外，本发明通过Sevag法脱蛋白、DEAE纤维素柱层析、Sephacryl柱层析等分离纯化，获得糖聚合物纯品，结构分析显示此法得到的牛膝糖聚合物为多糖和寡糖。这些可为将来在保健品、医药等领域中的应用提供依据。
【IPC分类】A61K31/702, C07H1/08, C07H3/06, A23L1/09, A61P19/10
【公开号】CN105037447
【申请号】CN201510338431
【发明人】严春艳, 王昌盛
【申请人】广东药学院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月17日