针对il-25的抗体的制作方法

专利名称：针对il-25的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对白介素25 (IL-25)的抗体，包括其结合片段。本发明优选的实施 方案使用抗体2C3的抗体VH和/或VL结构域。另一方面本发明提供了分别移植到人VH 和VL框架区域中的本文中所公开VH和VL结构域的一种或更多种CDR。

背景技术：
哮喘是常见的气道慢性炎症，患者的数量在最近的数十年间急剧上升，世界卫生 组织估算世界范围内有3亿人患有哮喘。过敏性哮喘特征为无法控制的气道高反应性 (AHR)，其由多种激发性剌激诱导，与肺的2型炎性浸润有关。 2型细胞因子在介导寄生蠕虫感染的保护免疫、调节效应器功能例如B细胞生长 和IgE分泌、诱导杯状细胞增生和相关的粘液生成、嗜曙红细胞增多、肥大细胞增生病和纤 维化中起重要作用(1)。这些细胞因子在这些效应器功能调节中的核心作用使之成为哮喘 的关键治疗靶标。实际上，这些细胞因子过表达的小鼠模型显示显著的哮喘特征。然而令 人惊讶的是，通过阻断特异性2型细胞因子(除了抑制IL-13)改善实验性哮喘的努力已证 明是不成功的。 IL-13的抑制同时抑制了 AHR和气道炎症，但其机制仍不清楚(2， 3)。然而，由于
哮喘复杂的病理生理学和有限的病因学了解，靶向各个途径是否能最终证明是成功的治疗 是不确定的。 最近，结构相关的IL-17细胞因子家族元件IL25/IL17E(8)的过表达已显示能在 体内诱导2型应答(4-6)，并增加对气道激动剂的应答性(7)。 1125—小鼠不能排出蠕虫寄 生虫，这是无效2型应答的关键指标(9， 10)。 抗体的基本结构在本领域是公知的。天然存在的抗体通常具有四条多肽链两条 相同的重链和两条相同的轻链，其通过二硫键连接。重链和轻链各自具有恒定区和可变区 (或结构域)。可变区主要负责抗体的结合。在每个可变区内，三个已知为互补决定区(CDR) 的亚区与抗原接触。各个可变结构域的CDR从N端至C端编号为CDR1、CDR2和CDR3。在N 和C端与CDR之间是4个所谓的框架区，其与抗原的接触即使有也很少。关于抗体结构的 更多详细情况在许多下文中所引用文献中进行了阐述，其通过援引并入本文。

发明内容
本发明人们制备了针对IL-25的抗体，并鉴定了与IL-25以高度亲和性和特异性 结合的抗体分子。由于人和小鼠1卜25共有80%的序列同一性，认为不大可能通过小鼠 或大鼠常规的免疫接种产生有效的抗IL-25抗体，因为该相似度能减少免疫原性表位的数 目。此外，受体配体界面(interface)很可能显示最大程度上的保守性，因此阻碍了能阻 断IL-25与其受体相互作用的抗体的产生。为了解决这些问题，本发明人们对经设计缺乏 IL-25 (IL-25-/-)表达的小鼠进行了免疫，相信该方法能增加开发针对IL-25/IL-25R界面 抗体的可能性。 该方法在产生针对IL-25的抗体方面是非常成功的，其很可能源于IL-25本身增
4强了体液免疫应答。然而，即使使用本方法，从70个候选物中仅鉴定到2个阻断抗体，其中 仅有1个可被回收。 通过常规方法克服了被认为阻碍了有效阻断抗体的产生的鼠和人IL-25之间相 似性的问题后，认为该序列相似性可产生等价有效阻断小鼠和人IL-25与其受体相互作用 的抗体。本发明现说明这的确如此。 尽管已有针对IL-25的其他抗体存在，相信本发明是首次说明所述能阻断IL-25 生物活性的抗体。具体而言，本文提供了在哮喘鼠模型中进行的试验，其显示本发明的抗体 尤其在体内预防或降低气道高反应性(哮喘的关键症状)中具有优点和意料不到的性质。
虽然已报道施用可溶性IL-25R-Fc融合蛋白可降低2型气道炎症，其效果显著低 于本文中报道的那些，并且关键是未评价AHR(ll)。我们现证明IL-25在气道炎症和AHR中 起关键作用，最初增强2型细胞因子介导的炎症，并且在诱导不依赖于经典2型细胞因子的 AHR中起重要作用。IL-25依赖的AHR的鉴定使鉴别新的IL-25下游治疗靶标成为可能。目 前我们不知道IL-25是否直接作用于气道平滑肌以诱导支气管收縮，或其效果通过诱导已 知的支气管收縮物例如白三烯类介导。然而，IL-25的双相活性使其成为体内抑制气道炎 症和抑制气道高反应性的出色治疗靶标。 因此，本发明涉及新的抗体，更普遍为包含所述抗体CDR序列的靶标结合元件，以 及所述靶标结合元件在治疗状况例如哮喘中的应用。 在一个实施方案中，本发明提供了结合IL-25的靶标结合元件，其包括抗体VH结 构域，所述抗体VH结构域包括具有氨基酸序列SEQID NO. 7的VH CDR3。其为本发明抗体 2C3的VH CDR3序列。 在更具体的实施方案中，本发明的靶标结合元件是VH结构域，其包括SEQ ID NO :
7的VH CDR3，以及SEQ ID NO :5的CDR1和SEQID NO :6的CDR2。 所述VH结构域可具有人框架区，或SEQ ID N0:2所示的框架区。所述VH结构域可与本发明的VL结构域配对，例如具有SEQ IDNO :8的CDR1、 SEQ
ID NO :9的CDR2和SEQ ID NO :10的CDR3的VL结构域。这些CDR可位于具有人框架区的
VL结构域内，或为SEQID NO :4的VL结构域。 因此在一个方面，本发明提供了结合IL-25的靶标结合元件，其包括2C3 VH结构 域(SEQ ID NO :2)和/或2C3 VL结构域(SEQ IDNO :4)。 本发明还提供了编码本发明靶标结合元件的分离的核酸，包含所述核酸的载体和 在宿主细胞中表达所述核酸以生产本发明靶标结合元件的方法。 本发明还提供了本发明的靶标结合元件，例如以药物组合物形式，用于治疗包括 哮喘的疾病中的用途。 本发明的这些和其他方面在下文进一步详细描述，参照所附的实施例。


图1显示了致敏前和哮喘攻击期间IL-25的中和。(A)最后一次气雾化抗原攻击 一天后测定OVA-致敏的小鼠的乙酰甲胆碱敏感性。合并2次试验的数据，其表示14-18小 鼠/组的平均值±SEM。 (*与同种型对照相比p < 0. 05， **与同种型对照相比p < 0. 01) (B)肺部切片用giemsa染色，进行血管周围浸润评分，每组n = 8。 (C)通过肺部切片高碘酸Schiff (PAS)染色测定粘液含量，每组n = 8。 (D)通过ELISA测定抗原特异性血清IgE， 0D读取值通过与标准血清进行比较转化为任意单位，每组n = 8。 (E)通过用giemsa染色 的细胞离心涂片器的差别细胞计数测定BAL中嗜曙红细胞的比例，每组n = 6。 (F)来自重 剌激纵隔淋巴结细胞的抗原诱导的细胞因子生成。通过ELISA测定蛋白水平，每组n = 6。 符号代表各个动物，平均值用柱表示。数据代表至少2次独立的试验。Sens二致敏前施用 的抗体，aero =每次气雾剂攻击前4小时施用的抗体。 图2显示了仅哮喘攻击期间IL-25的中和。(A)最后一次气雾化抗原攻击一天后 测定OVA-致敏的小鼠的乙酰甲胆碱敏感性。合并2次试验的数据，其表示14-18小鼠/ 组的平均值士SEM。 (*与同种型对照相比。<0.05，**与同种型对照相比。<0.01)。 (B) 肺部切片用giemsa染色，进行血管周围浸润评分，每组n = 8。 (C)通过肺部切片高碘酸 Schiff(PAS)染色测定粘液含量，每组n = 8。 (D)通过用giemsa染色的细胞离心涂片器 的差别细胞计数测定BAL中嗜曙红细胞的比例，每组n = 6。 (E)通过ELISA测定抗原特异 性血清IgE， OD读取值通过与标准血清进行比较转化为任意单位，每组n = 8。 (F)来自重 剌激纵隔淋巴结细胞的抗原诱导的细胞因子生成。通过ELISA测定蛋白水平，每组n = 6。 符号代表各个动物，平均值用柱表示。数据代表至少2次独立的试验。Sens二致敏前施用 的抗体，aero =每次气雾剂攻击前4小时施用的抗体。 图3显示了首次用于实验的小鼠的rmlL-25施用。向野生型(A) 、 ill3—y—(B)或 i14—i15—i19—i113—(C)小鼠鼻内施用1. 8ii g rIL-25或PBS。在攻击后16小时测定乙 酰甲胆碱敏感性。*与同种型对照相比P < 0. 05，**与同种型对照相比p < 0. Ol，n = 4-8/ 组。数据代表至少2次独立的试验。
序列 本发明的靶标结合元件参考下述序列鉴别号在本文中进一步描述SEQIDNO. 12C3VH编码核苷酸序列SEQIDNO. 22C3VH氨基酸序列SEQIDNO. 32C3VL编码核苷酸序列SEQIDNO. 42C3VL氨基酸序列SEQIDNO. 52C3VH CDR1氨基酸序列SEQIDNO. 62C3VH CDR2氨基酸序列SEQIDNO. 72C3VH CDR3氨基酸序列SEQIDNO. 82C3VL CDR1氨基酸序列SEQ IDNO. 92C3VL CDR2氨基酸序列SEQIDNO. 102C3VL CDR3氨基酸序列 其他序列在所附的序列表中列出。
发明详述
耙标结合元件 此处描述了分子对的元件，所述分子对之间互相具有结合特异性。该特异性结合 对的元件可为天然来源的或全部或部分人工合成产生的。所述分子对的一个元件在其表面 具有区域，或空腔，其特异性的结合所述分子对另一元件的特定空间和极性结构并因此与 之互补。因此，所述对的元件具有互相特异性结合的性质。特异性结合对的类型的例子有抗原_抗体、生物素_抗生物素蛋白、激素_激素受体、受体_配体、酶_底物。 本申请与抗原-抗体类反应有关，因此，本申请的靶标结合元件将包括至少部分
的抗体分子，更具体为至少部分的所述分子的抗原结合结构域。 —般而言，抗体的重链可变区(VH结构域)在抗体与抗原的结合中起重要作用。已 发现VH结构域的CDR3区比CDR1和CDR2区更为多变，因此在大多数抗体中具有对所述抗 体靶标的特异性。因此，本发明的靶标结合元件基于2C3抗体的VH CDR3区。本发明的靶 标结合元件更优选包括2C3抗体VH区的所有三个CDR。 包含CDR的本发明靶标结合元件的结构通常具有抗体分子的重链或轻链序列或 其基本部分，其中所述CDR位于相应于重排(rearranged)免疫球蛋白基因编码的天然存 在的VH和VL抗体可变结构域的CDR的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可参 照Kabat，E. A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第四片反.US D印artment of Health and Human Services. 1987，及其更新版本而确定。许多学术和商用 在线资源可用于查找该数据库。例如，参见Martin，A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database byComputer PROTEINS :Structure， Function and Genetics, 25(1996) ， 130-133以及相关的在线资源，当前的网址为http:〃www. bioinf. org. uk/abs/ simkab. html 。 —般而言，耙标结合元件包括与VL结构域配对的VH结构域，以提供抗体的抗原结 合结构域，尽管如下文所讨论的，单独的VH结构域也可用于结合抗原。在一个优选的实施 方案中，所述2C3VH结构域(SEQ ID NO. 2)与2C3VL结构域(SEQ ID NO. 4)配对，由此形成 抗体的抗原结合位点，其同时包括所述2C3 VH和VL结构域。在另外实施方案中，所述2C3 VH与2C3VL以外的VL结构域配对。 轻链混杂性在本领域是公知的，如本文中其他部分所讨论。 根据本发明的靶标结合元件可以与2C3基本类似，例如±10%，的亲和性结合 IL_25。靶标结合元件通常是对IL-25特异性的。因此所述靶标结合元件不会对其特异性 结合伴侣以外的分子显示任何显著的结合。例如，已发现2C3抗体不与IL-4、IL-5和IL-13 交叉反应。因此避免与哮喘和类似过程有关的其他细胞因子交叉反应是本发明的靶标结合 元件所需要的特征。 通常，可通过结合测定的方法测定特异性，例如使用一套抗原的ELISA。根据本发
明的耙标结合元件可识别IL-25，但不识别IL-17家族的其他元件，尤其是IL-17A、 IL-17B
和IL-17C中的任何一个，更优选所有三种IL-17A、 IL-17B和IL-17C。根据本发明的靶标
结合元件与IL-25的结合可通过与重组IL-25竞争而消除。 可在适宜的条件下比较不同靶标结合元件的结合亲和性和中和效价。 抗体分于 这里描述了天然或部分或全部合成产生的免疫球蛋白。已显示完整抗体的片段可 行使结合抗原的功能。这样对抗体的引用还包括任何包含抗体结合片段的多肽或蛋白质。
结合片段的实例有(i)由VL、VH、CL和CHl结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和 CHl结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH 结构域组成的dAb片段(Ward, E. S.等，Nature 341,544-546(1989)) ; (v)分离的CDR区; (vi) F (ab' ) 2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中
7VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头使两个结构域一起形成抗原结合位点 (Bird等，Science, 242， 423-426， 1988 ;Huston等，PNAS USA， 85， 5879-5883， 1988) ;(viii) 双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)"双抗体"，由基因融合构成的多价 或多特异性片段(W094/13804 ;P. Holliger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA906444-6448, 1993)。 Fv、 scFv或双抗体分子可通过引入连接VH和VL结构域的二硫化物桥而稳定 (Y. Reiter等，Nature Biotech, 14， 1239-1245， 1996)。还可制备包括与CH3结构域连接的 scFv的Minibody(S. Hu等，Cancer Res. ，56,3055-3061， 1996)。 使用双特异性抗体时，其可以是常规的双特异性抗体，可通过多种途径制备 (Holliger，P.禾P Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4， 446-449 (1993))，例如通过化 学方法或从杂交体杂交瘤制备，或可以是任一前述的双特异性抗体片段。双抗体和scFv可 不使用Fc区、仅使用可变结构域构建，潜在减少了抗个体基因型反应的影响。
与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也是特别有用的，因为它们可方便地 构建和在大肠杆菌(E.coli)中表达。具有适当结合特异性的双抗体(以及许多其他多 肽例如抗体片段)可使用噬菌体展示技术(W094/13804)从文库中方便的选择。如果所 述双抗体的一条臂保持恒定，例如，具有针对IL-25的特异性，则可构建另一条臂变化的 文库，选择适当特异性的抗体。双特异性完整抗体可通过knobs-into-holes工程制备 (J. B. B. Ridgeway等，Protein Eng. ， 9， 616-621， 1996)。可以获取单克隆和其他抗体，使用 重组DNA技术产生保留了原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。这样的技术可包括向不 同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区引入编码抗体的免疫球蛋白可变区、或互补决定 区(CDR)的DNA。例如参见EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A_239400。
优选地，所述CDR区被移植到人框架区。人框架区可通过多种方法选择，例如，通 过比较小鼠框架区或小鼠V区序列与已知的人框架或V区序列，选择氨基酸相似性或同一 性程度最高或最高之一的人框架区。对天然的人序列框架区可进行修饰，以进一步优化得 到的CDR移植抗体。 虽然在本发明的一个优选的方面，优选包括一对VH和VL结构域的抗体分子，但基 于VH或VL结构域序列的单个结合结构域构成了本发明的其他方面。已知单个免疫球蛋白 结构域，尤其是VH结构域能以特定的方式结合靶标抗原。 在任一单链结合结构域的情况下，这些结构域可用于筛选能形成可结合IL-25的 双结构域靶标结合元件的互补结构域，如下文进一步所述。 本发明的抗体分子可进一步包括抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可在其C 末端与抗体轻链恒定区连接，所述恒定区包括人CK或CA链，优选CA链。类似的，基于 VH结构域的靶标结合元件可在其C末端与衍生自任何抗体同种型的完整免疫球蛋白重链 或其部分连接，所述抗体同种型例如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同种型亚类，尤其是IgGl 和IgG4。优选IgG4。也可采用W099/58572中公开的Fc区，例如Anab禾口 Anac。
因此包括与另一多肽融合的靶标结合结构域或其等价物的嵌合分子。嵌合抗体的 克隆与表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023中。 本发明抗体分子的框架区还可包括糖基化序列，其包括一个或更多个糖基化位 点。糖基化模式可依赖于耙标结合元件表达的宿主细胞而不同。因此，编码糖基化位点的 核酸构建体可进行修饰以除去所述位点或可在蛋白内引入此类位点。例如，真核蛋白中的N-糖基化位点特征为氨基酸三联体Asn-X-Y，其中X是除Pro外的任何氨基酸，Y是Ser或 Thr。对编码所述三联体的核苷酸序列的适当取代、添加或缺失可预防Asn侧链上附着糖残 基。选择改变单个核苷酸，使得Asn被不同的氨基酸替换，例如足以灭活N-糖基化位点。灭 活蛋白质中N-糖基化位点的已知方法包括美国专利号5，071，972和EP 276,846中描述的 那些。 抗原结合结构域 此处描述了抗体分子的一部分，其包括与抗原的部分或全部特异性结合并与之互 补的区域。在抗原较大的情况下，抗体可能仅与该抗原的特定部分结合，该部分称为表位。 抗原结合结构域可通过一个或更多个抗体可变结构域提供(例如由VH结构域组成的所谓 的Fd抗体片段)。优选地，抗原结合结构域包括至少抗体轻链可变区(VL)的基本部分和至 少抗体重链可变区(VH)的基本部分。 免疫球蛋白可变结构域的基本部分包括至少三个CDR区以及其间插入的框架区。 优选地，该部分还包括至少50%第一和第四框架区之一或两者，所述50%为第一框架区的 C末端50%和第四框架区的N末端50% 。所述可变结构域基本部分的N末端或C末端其他 残基可以是与天然存在的可变结构域区非通常相关的那些。例如，通过重组DNA技术制备 的本发明的靶标结合元件构建可引入引入的接头编码的N或C末端残基以利于克隆或其他 操作步骤。其他操作步骤包括引入接头以连接本发明的可变结构域和其他蛋白序列，其包 括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在制备双抗体中)或蛋白标签，如下文更详细讨 论的。 包括 其通常以包含的意义使用，即允许一个或更多特征或成分的存在。
分离的 其是指根据本发明，本发明靶标结合元件或编码所述结合元件的核酸通常存在的 状态。元件和核酸不含或基本不含其天然相关的物质，例如在其天然环境或当在体外或体 内通过重组DNA技术制备时在其制备环境中(例如细胞培养物)中与其一起发现的其他多 肽或核酸。 靶标结合元件和核酸可与稀释剂或佐剂一起配制，为了实践目的仍然是分离 的——例如所述元件如果用于在免疫测定中包被微量滴定板时通常与明胶或其他载体混 合；或当用于诊断或治疗时与药学上可接受的载体或稀释剂混合。靶标结合元件可以天然 被糖基化或通过异源真核细胞(例如CH0或NS0(ECACC 85110503)细胞)糖基化，或者其 可以是(例如通过在原核细胞中表达产生时)未糖基化的。
耙标结合元件的其他特征 除了抗体序列外，根据本发明的靶标结合元件可包括其他氨基酸，例如形成肽或 多肽诸如折叠结构域，或使该分子具有除结合抗原的能力外的其他功能性特征。本发明的 靶标结合元件可携带可检测的标记，或可与毒素或酶缀合(例如通过肽基键或接头)。
可检测的标记包括放射性标记，例如1311或"Tc，其可使用抗体成像领域中已知的 常规化学方法与本发明的抗体连接。标记还可包括酶标记，例如辣根过氧化物酶。标记还 可包括化学部分，例如生物素，其可通过与特异性同源检测部分例如标记的抗生物素蛋白 结合进行检测。
在所述其他特征是多肽结构域或标记的情况下，所述靶标结合元件可通过重组技 术产生，即通过表达编码所述靶标结合元件和其他结构域的融合物的核酸产生。
本发明的其他靶标结合元件
序列变体 本文列出了其序列的VH和VL结构域和CDR的，并且可用于IL-25的靶标结合元 件的变体可通过序列改变或突变和筛选的方法获得。本发明同样提供了此类方法。
根据本发明的靶标结合元件也可以与任何靶标结合元件竞争结合抗原，所述任何 靶标结合元件结合抗原并包括本文中公开的靶标结合元件，VH和/或VL结构域，或2C3的 VH CDR3，或任何序列基本上如本文中所列出的这些的变体。因此，本发明的另一方面提供 了包含人抗体的抗原结合位点的靶标结合元件，其与2C3竞争结合IL-25。结合元件间的竞 争可在体外方便地测定，例如采用ELISA和/或通过向一个结合元件标记特定的报告分子， 其可在其他未标记结合元件存在下检测，进而能鉴定结合同一表位或重叠表位的靶标结合 元件。 本领域中有多种方法可用于获得针对IL-25的靶标结合元件，其可与2C3竞争结 合IL-25。 根据本发明，可使用其序列在本文中具体公开的任何VH和VL结构域的可变结构 域氨基酸序列变体，如前面所讨论的。具体的变体可包括一个或更多个氨基酸序列的改变 (添加、缺失、取代和/或插入氨基酸残基)，可能低于约20个改变、低于约15个改变、低于 约10个改变或低于约5个改变、4、3、2或1个改变。改变可在一个或更多个框架区和/或 一个或更多个CDR中进行。 —方面，基本上如本文所示的CDR氨基酸序列是人可变结构域的CDR或其基本部 分。基本上如本文所示的VH CDR3序列代表了本发明优选的实施方案，优选地，每一所述序 列为人重链可变结构域的VH CDR3或其基本部分。"基本上如......所示"表示本发明有关的CDR或VH或VL结构域与其序列在本
文中所示的特定区域相同或高度相似。"高度相似"理解为在CDR和/或VH或VL结构域中 可进行1至5、优选1至4，例如1至3或1或2，或3或4个氨基酸的取代。
本发明耙标结合元件的序列变体可通过2C3 VH和/或VL基因之一或两者的随机 诱变在整个可变结构域中产生突变产生。这样的技术由Gram等人描述(1992，Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA， 89 :3576-3580)，其使用了易错PCR。 另一种可使用的方法是VH或VL基因CDR区的定向诱变。此类技术由Barbas等人 (1994， Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA， 91 :3809-3813)和Schier等人(1996， J. Mol. Biol. 263 : 551-567)所公开。 所有上述技术在本领域中是已知的，其本身不构成本发明的一部分。本领域技术
人员能使用此类技术通过本领域常规方法提供本发明的靶标结合元件。 因此，另一方面本发明提供了一种获得针对IL-25抗体的方法，其包括 提供编码靶标结合元件的起始核酸，其具有一种或更多种SEQ IDN0:2或SEQ ID
NO :4的CDR序列； 修饰所述核酸，改变所述CDR序列；
表达所述修饰的靶标结合元件；以及
10
测试所述修饰的靶标结合元件与IL-25的结合。 优选地，所述修饰可在复数种起始核酸分子上进行，以提供具有不同结合亲和性 的修饰的序列库。 —方面，所述起始核酸包括SEQ ID NO :2的所有三种重链CDR，其以SEQ ID NO :2 本身的形式或在其他框架序列中的形式存在。 在一个实施方式中，所述修饰可针对单种CDR，例如CDR3，或所述修饰可同时针对 两种或三种CDR区。 某于CDR3靶标结合元件的牛产 本发明中采用的可变结构域可从任何种系或重排的人可变结构域获得，或可以是 基于已知的人可变结构域共有序列的合成可变结构域。本发明的CDR序列(例如CDR3)可 通过重组DNA技术引入缺乏CDR(特别是CDR3)的可变结构域库。 例如，Marks等人(Bio/Technology， 1992， 10 :779-783)描述了生产抗体可变结构 域库的方法，其中使用针对可变结构域区域5'端或邻近的通用引物和针对人VH基因第三 框架区的通用引物，以提供缺乏CDR3的VH可变结构域库(r印ertoire) 。 Marks等人还描 述了该库如何与特定抗体的CDR3组合。使用类似的技术，本发明的CDR3衍生的序列可与 缺乏CDR3的VH或VL结构域库改组(shuffle)，改组的完整VH或VL结构域与同源的VL或 VH结构域组合以提供本发明的靶标结合元件。所述库可随后在适宜的宿主系统中展示，例 如W092/01047的噬菌体展示系统，由此选择适宜的耙标结合元件。库可由超过104个元件 组成，例如106至108或101Q个元件。 类似的改组或组合技术同样由Stemmer公开(Nature, 1994,370 :389-391)，其描 述了与内酰胺酶基因相关的技术，但发现所述方法可用于产生抗体。
因此，本发明另一方面提供了一种制备对IL-25特异性的靶标结合元件的方法， 该方法包括 (a)提供编码VH结构域的核酸起始库，所述核酸包括将被替换的CDR3或缺乏 CDR3编码区； (b)使所述库与编码基本上如本文所示VH CDR3的氨基酸序列的供体核酸组合，
这样所述供体核酸插入到上述库的CDR3区，从而提供编码VH结构域的核酸产物库； (c)表达所述产物库的核酸； (d)选择对IL-25特异性的靶标结合元件；并且 (e)回收所述靶标结合元件或编码其的核酸。 所述产物库可从相同载体或不同载体中与VL结构域共表达。该VL结构域可以是 本发明的VL结构域，或可以是一种或更多种如下文所述与链改组有关的不同VL结构域。
可采用类似的方法，其中本发明的VL CDR3与编码VL结构域的核酸库组合，所述 核酸包括将被替换的CDR3或缺失CDR3编码区。使用前述方法，该VL产物库可从相同载体 或不同载体中与VH结构域共表达。该VH结构域可以是本发明的VH结构域，或可以是一种 或更多种如下文所述与链改组有关的不同VH结构域。 类似地， 一种或更多种，或所有三种CDR均可被移植到VH或VL结构域的库中，随 后筛选该库中对IL-25特异性的靶标结合元件。 通过这种方式获得的靶标结合元件构成了本发明的另 一个方面。
链改组 本发明的另一方面提供了获得针对IL-25的抗体的抗原结合结构域的方法，该方 法包括使本发明的靶标结合元件的VH结构域(包括前述讨论的变体)与一种或更多种VL 结构域组合，以及测试所述VH/VL组合的针对IL-25的抗体的抗原结合结构域。
所述VL结构域可具有基本上如本文所列出的氨基酸序列。 可采用类似的方法，其中将本文中公开的VL结构域的一种或更多种序列变体与 一种或更多种VH结构域组合。 这可以通过噬菌体展示筛选方法完成、使用如W092/01047中公开的所谓的等级 二元组合方法(hierarchical dual combinatorialapproach)，其中使用含有H或L链克隆 的单个菌落感染编码另一条链(L或H)的完整克隆库，根据例如该参考文献中描述的那些 的噬菌体展示技术选择得到的双链靶标结合元件。 因此，本发明提供了选择针对IL-25抗体分子的方法，该方法包括 (a)提供包括靶标结合元件的VH结构域，所述靶标结合元件结合IL-25并且包括
抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含具有SEQID NO. 7氨基酸序列的VH CDR3 ; (b)使所述VH结构域与复数种抗体VL结构域组合，获得抗体分子； (c)筛选所述抗体分子与IL-25的结合；并且 (d)选择与IL-25结合的抗体分子。 所述VH和VL结构域可以以通过重组DNA、尤其是通过噬菌体或噬菌粒DNA表达的 蛋白的形式提供。 所述复数种VL结构域可由超过104种各个结构域组成，例如106至108或101Q种 结构域。 抗体分子和编码这些分子的核酸可构成本发明的另一方面。IL-25
11-25，在本领域中同样指IL-17E，可从商业来源获得(例如R&DSystems， MN， USA)，或可参考本领域中已有的IL-25序列克隆或合成。Hurst等人，2002 (下文参考文献 7)描述了鼠IL-25 (NCBI蛋白NP_542767) 。 Fort等人描述了人IL_25(NCBI蛋白Q9H293) (下文参考文献4)。为生产抗体或在免疫测定中使用，可使用重组IL-25的片段，尤其 是N末端截短的那些。例如，可商业获得的重组人IL-25 (IL-17E)包括登记号Q9H293的 Tyr33-Gly177成熟蛋白序列，可商业获得的鼠IL-25包括小鼠IL_17E(登记号NP_542767) 的残基Vall7-Alal69。
核酸和载体 在其他方面，本发明提供了分离的核酸，其包括编码根据本发明的靶标结合元件、 VH结构域或VL结构域的序列；本发明还提供了制备本发明的靶标结合元件、VH结构域或 VL结构域的方法，其包括在条件下表达所述核酸，生产所述靶标结合元件、VH结构域或VL 结构域，以及回收上述物质。 本发明的另一方面提供了通常分离的核酸，其编码本文中公开的VH CDR或VL CDR 序列，尤其是选自SEQ ID NOs :5、6和7的VHCDR，选自SEQ ID NOs :8、9禾P 10的VL CDR，最 优选2C3 VHCDR3 (SEQ ID NO. 7)。 本发明的核酸可包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的序列或其相关部分(例如 CDR编码区)。然而，密码子使用可以不同，例如为在所需要的宿主细胞中优化所述序列的表达。 本发明还提供了编码本发明的靶标结合元件的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。 在一个优选的方面，本发明提供了编码如前文所定义的本发明CDR或VH或VL结构域的核酸。 根据本发明的核酸可包括DNA或RNA，可以是完全或部分合成的。除非上下文中另 外要求，本文中列出的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA，也包括具有指定序列的RNA， 其中用U代替T。 本发明还提供了载体，例如以质粒、病毒，例如噬菌体、或噬菌粒、粘粒、转录或表 达盒的形式，其包括至少一种上述核酸。 可选择或构建适宜的载体，包含适当的调控序列，包括启动子序列，终止子序 列，多腺苷酸序列，增强子序列，标记基因和其他适宜的序列。更多详细情况参见例如 Molecular Cloning :a LaboratoryMa皿al : 第二片反，Sambrook等，1989， Cold Spring Harbor LaboratoryPress。 本发明的载体还包括能在体内感染人细胞的病毒载体，例如腺病毒、逆转录病毒 或腺相关病毒载体。此类载体可用于在人或动物受试者细胞内表达本发明的靶标结合元 件，以生产和向所述受试者递送该靶标结合元件。 编码本发明靶标结合元件的核酸序列在一个方面可操作地与启动子连接，以在宿 主细胞中表达该靶标结合元件。所述序列可在5'端包括先导序列以促进靶标结合元件在 宿主细胞内的表达和/或从宿主细胞分泌。本领域已知多种适宜的先导序列，可由本领域 普通技术人员根据宿主细胞进行选择。 许多用于操作核酸的已知技术和方法，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA 引入细胞和基因表达，以及蛋白分析，详细描述于Current Protocols in Molecular Biology,第二版，Ausubel等eds. ， John Wiley & Sons，1992中。Sambrook等人和Ausubel 等人的公开通过援弓I并入本文。
宿主细胞和靶标结合元件的产生 另一方面提供了用本发明核酸(例如以载体形式的核酸序列)转化的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明的核酸被整合至宿主细胞的基因组(例如染色体)中。 按照标准技术，可通过包含促进与基因组重组的序列促进所述整合。 另一方面提供了生产本发明靶标结合元件的方法，该方法包括引发编码核酸的表
达。这样的方法可包括在用于生产所述靶标结合元件的条件下培养宿主细胞。 通过表达生产后，VH或VL结构域或靶标结合元件可使用任何适宜的技术分离和/
或纯化，随后适当时使用。生产的方法可包括分离和/或纯化所述产品的步骤。 纯化产品后，所述靶标结合元件可通过物理或化学方法修饰，例如引入改变、例如
增加所述蛋白稳定性或生物半衰期的保护基团。例如，PEG化蛋白以获得所述效果在本领
域是已知的，本发明的靶标结合元件可以是PEG化的形式。 制备方法可包括将产品制成组合物，其包括至少一种附加成分，例如药学上可接 受的赋形剂。 本发明还提供了重组宿主细胞，其包括一种或更多种上述核酸或载体。所提供的 编码任何CDR、 VH或VL结构域或靶标结合元件的核酸本身构成了本发明的一个方面，包括
13从其编码核酸表达的生产所述编码的产物的方法也是如此。 在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是公知的。适宜的宿主细胞包括细 菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中可获得的用于表达异源性多肽的哺乳动 物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾细胞、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0 大鼠骨髓瘤细胞和多种其他细胞。通常优选的细菌宿主是大肠杆菌。 抗体和抗体片段在原核细胞例如大肠杆菌中的表达在本领域已非常成熟。综述 例如参见Pliickthun， A. Bio/Technology 9:545-551(1991)。作为生产耙标结合元件的一 种选择，在培养物中的真核细胞内表达也是本领域技术人员可用的。最近的综述例如参见 Ref，M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4 :573-576 ;Trill J.J.等(1995) Curr. Opinion Biotech 6 :553-560。
组合物 因此，根据本发明，以及用于根据本发明的用途，的药物组合物除活性成分外，可 包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他本领域技术人员公知的物质。这 些物质必须是无毒的，并且不应干扰所述活性成分的功效。载体或其他物质的精确性质将 依赖于施用的途径，其可以口服或注射，例如静脉内注射。 靶标结合元件的治疗剂可通过将所需纯度的靶标结合元件与任选生理上可 接受的载体、赋形剂或稳定剂混合制备成冻干粉或水溶液的形式用于储存(参见例如 "Remington :The Science and Practice ofPharmacy ，，， 20片反，2000， pub丄ippincott， Williams & Wilkins.)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者 是无毒的，包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐，以及其他有机酸；包括抗坏血酸的抗氧化 剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水 聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸； 单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇 或山梨醇；成盐平衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如吐温(Tween)、普郎尼克
(Pluronics)或聚乙二醇(PEG)。 用于体内施用的靶标结合元件必须是无菌的。这可以在冻干和重构前后用无菌过
滤膜过滤方便的完成。所述靶标结合元件通常以冻干形式或溶液存储。 用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包括固相
载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液相载体，例如水、石油、动物或植物油、 矿物油或合成油。也可包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液，或二醇类，例如乙二醇、丙 二醇或聚乙二醇。 对于静脉内注射，或在痛苦(affliction)位点的注射来说，活性成分可以是肠胃 外可接受的水溶液形式，其是无热原的，并且具有适宜的pH、等渗性和稳定性。本领域技术 人员可使用例如等渗载体例如氯化钠注射液、林格(Ringer' s)注射液、乳酸林格注射液制 备适宜的溶液。如果需要，可加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
本发明的治疗用途 本发明首次提供了针对IL-25的抗体能有效体内预防或降低气道高反应性(哮喘 的主要症状)的证明。因此，一方面本发明提供了一种预防或降低需要治疗的受试者(例 如人)的气道高反应性的方法，其包括向所述受试者施用与IL-25结合的靶标结合元件，尤
14其是抗体分子。另一方面本发明提供了一种预防、降低或治疗需要治疗的受试者中哮喘的 方法，其包括向所述受试者施用与IL-25结合的靶标结合元件，尤其是抗体分子。
上述方法可采用本发明的靶标结合元件(包括其组合物)，其能有效结合，并优选 拮抗IL-25的作用，在多种IL-25起作用的疾病和病症中具有治疗潜能。所述方法也可采 用其他与IL-25结合的靶标结合元件(包括其组合物)，其可如下文所附实施例所述获得。
根据本发明的靶标结合元件(包括其组合物)可用于人或动物受试者的治疗(包 括预防性治疗)或诊断方法中。所述治疗或诊断方法(其可包括预防性治疗)可包括向所 述受试者施用有效量的本发明靶标结合元件。示范性的疾病和病症在下文进一步讨论。
还提供了本发明的靶标结合元件(包括其组合物)在制备用于向人或动物受试者 施用的药剂中的用途。 抗IL-25靶标结合元件可用于提供治疗益处的临床适应症包括任何IL-25具有病 理学后果的状况。因此，通常本发明的靶标结合元件可用于治疗与不必要的Th-2应答相关 的任何状况。例如，本发明的靶标结合元件可用于治疗过敏和哮喘，尤其是哮喘。
抗IL-25治疗可通过注射(例如静脉内)或局部递送方法给予。抗IL-25可通过 基因介导的技术递送。备选的制剂策略可提供适于口服或栓剂途径的制剂。施用的途径取 决于治疗的理化性质和疾病的特殊考虑，以优化功效或最小化副作用。
根据本发明，可向个体施用组合物。优选以"治疗有效量"施用，其足以显示对患 者的益处。所述益处可至少为至少一种症状的改善。施用的实际量，以及施用率和时间过 程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。治疗处方，例如关于剂量等的决定在普通从业医 师和其他医生的职责范围内。抗体的适宜剂量在本领域是公知的，参见Lederma皿J.A.等， (1991)Int. J. Cancer 47 :659-664 ;Bagshawe K. D.等，(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4 :915—922。 精确的剂量依赖于多种因素，包括该抗体用于诊断还是治疗，所治疗区域的尺寸
和位置，所述抗体的精确性质(例如全抗体、片段或双抗体)，以及任何可检测标记或其他
与抗体连接的分子的性质。典型的抗体剂量范围为0.5mg-1.0g，可通过静脉推注施用。其
他施用模式包括数小时内的静脉内输注以获得类似的总累积剂量。这是对于成年患者的单
次治疗剂量，对于儿童和婴儿可按比例调节，对于其他抗体形式也可按分子量比例调节。可
按每日一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复治疗，由医师判定。 另一种给药模式采用预涂布或整合入内在的(indwelling)装置，其抗体的最佳
量通过适当试验确定。 在本发明的某些优选的实施方案中，抗体分子是单体的片段，例如F(ab)或scFv。
此类抗体片段可具有半衰期相对较短、血小板活化风险(其可由受体群集引起)较低的优
点。导致血小板活化的群集例如可为IL-25分子的或IL-25与Fc y RII分子的。 如果使用全抗体，优选以不能活化和/或破坏血小板的形式使用。优选使用IgG4
同种型或衍生自IgGl骨架的"设计者"同种型(新的Fc基因构建体，W099/58572， Clark，
Armour，Williamson)。可使用较小的抗体片段，例如F(ab') 2。此外，可使用具有双表位特
异性(例如由scFv2C3识别的表位)的全抗体或片段(例如F(ab')2或双抗体)。尽管这
样的实施方案可促进受体群集，与各个受体的高缔合速率可排除这一问题。 本发明的靶标结合元件通常以药物组合物的形式施用，其可包括除靶标结合元件外的至少一种成分。 依赖于所治疗的状况，本发明的靶标结合元件可单独或与其他治疗同时或顺序组 合施用。其他治疗可包括施用适当剂量的镇痛药物，例如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、醋 氨酚(paracetamol)、布洛芬或酮洛芬)或麻醉剂例如吗啡，施用抗催吐药，或施用至少另 一种对哮喘有活性的化合物，通常为支气管扩张剂，其导致气道舒张或增强粘液清除，例如 P激动剂(例如沙丁胺醇、沙美特罗)，色甘酸二钠、类固醇或PDEIV抑制剂。
测定方法 本发明提供了一种包括引发或允许本文中所提供的靶标结合元件与IL-25结合 的方法。如前所述，该结合可以在体内发生，例如在施用靶标结合元件、或编码靶标结合元 件的核酸后发生结合，或者在体外发生，例如在ELISA、蛋白质印迹、免疫细胞化学、免疫沉 淀或亲和色谱中。 可测定靶标结合元件与IL-25的结合量。定量可以是关于测试样品中抗原的量， 其可能是诊断相关的。 抗体对样品的反应性可通过任何适宜的方法测定。放射免疫测定(RIA)是一种可 能的选择。放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合，与所述抗体结合。从未 结合抗原中物理分离结合的抗原，测定与抗体结合的放射性抗原的量。测试样品中存在的 抗原越多，与抗体结合的放射性抗原越少。竞争性结合测定也可使用非放射性抗原，其使用 与报告分子连接的抗原或类似物。所述报告分子可以是荧光染料、磷光剂或激光染料，其具 有光谱分离的吸收或发射特性。适宜的荧光染料包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和得克萨斯 红。适宜的发色染料包括二氨基联苯胺。 其他报告物包括大分子胶粒或颗粒物例如乳胶珠，其为染色的、磁性或顺磁性的； 能直接或间接引起可检测信号用于视觉观察、电子检测或其他记录的生物或化学活性剂。 例如，这些分子可以是酶类，其催化产生或改变颜色、或引起电性质变化的反应。它们可以 是分子可激发的，这样不同能级之间的电子跃迁导致特征性光谱吸收或发射。它们也可以 包括与生物传感器联用的化学实体。可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物 素蛋白和碱性磷酸酶检测系统。 各个抗体_报告物缀合物产生的信号可用于衍生样品(标准和试验)中结合的相 关抗体的可定量绝对或相对数据。 本发明还提供了上述靶标结合元件在竞争性测定中测定抗原水平中的用途，即通 过在竞争性测定中应用本发明提供的靶标结合元件测定样品中抗原水平的方法。这可以是 不需要结合与未结合抗原物理分离的情况。连接报告分子和靶标结合元件，使得结合时发 生物理或视觉变化是一种可能。报告分子可直接或间接产生可检测的、优选可测量的信号。 报告分子的连接可直接或间接，共价(例如通过肽键)或非共价。通过肽键的连接可以是 编码抗体和报告分子的基因融合物重组表达的结果。 本发明还通过例如在生物传感器系统中使用根据本发明的靶标结合元件直接测 定抗原水平。 测定结合的模式不是本发明的特征，本领域技术人员能根据其偏好和常识选择适 宜的模式。 本发明还扩展至与任何靶标结合元件竞争结合IL-25的靶标结合元件，所述任何靶标结合元件结合抗原并且包含包括CDR的V结构域，所述CDR具有基本上如本文所示氨 基酸，或包含具有基本上如本文所示的氨基酸序列的V结构域。结合元件间的竞争可在体 外方便地测定，例如通过在一个结合元件上标记特异性报告分子，其可在其他未标记结合 元件存在下检测，以鉴别结合同一表位或重叠表位的靶标结合元件。竞争可使用ELISA或 流式细胞法测定。 竞争性反应可用于选择一种或更多种靶标结合元件，例如2C3的衍生物，其可具 有一种或更多种额外的或改善的性质。这类似于根据本发明的2C3选择方法，除了 IL-25 并非从其微配体洗脱，而是从抗体分子洗脱。这是重要的，因为其会产生直接与母体竞争的 更高比例的子代抗体。实际上如此选择的所述子代抗体可能具有比母体更高的抗原亲和性 (允许增强亲和力，其可能是由于每个噬菌体展示超过1个抗体分子)。选择具有改进的亲 和性的"子代"噬菌体抗体的现有方法包括 使用低于原始母体抗体的解离常数的(标记)靶抗原的浓度； 使用过量未标记的靶抗原作为竞争者，如Hawkins等人所述(1992)。然而，他们并
没有必要地规定"改进的"抗体必须替换/占据母体的同一表位。加入洗脱步骤可产生更
高比例的替换母体的子代抗体。通过这种方法选择的子代抗体可结合与其母体抗体非常类
似的表位，但具有更高的亲和性。 在竞争性测试中可使用所述抗原的肽片段，尤其是包括感兴趣表位的肽。可使用 具有表位序列加上任一端一个或更多个氨基酸的肽。这样的肽可称为"基本上由所述的指 定序列组成"。根据本发明的靶标结合元件可以使得其与抗原的结合被具有或包括上述序 列的肽所抑制。在该测试中，可使用具有任一序列加上一个或更多个氨基酸的肽。
通过用所述肽淘选(pan)，可例如从噬菌体展示文库中分离结合特定肽的靶标结 合元件。
实施例 本发明的方面和实施方案现通过参考下述实验的实施例进行说明。
实施例1 :针对IL-25抗体的产生 对在针对鼠IL-25 (R&D Systems)免疫的il25—y—小鼠中产生的一大组抗体进行 筛选。在体外生物测定中，发现这些抗IL-25抗体其中之一 (2C3)能剂量依赖性地抑制 rmIL-25和可溶性mlL-25R-Fc融合蛋白的相互作用以及抑制原始小鼠非B、非T细胞的 IL-25依赖性的IL-13生成。该抗体还抑制hIL-25和可溶性hIL_25R_Fc融合物的相互作 用。这些性质的组合进一步在体内系统中进行了研究，以证明能有效用于治疗哮喘。
实施例2 :过敏性哮喘的实验模型 在用气雾化OVA攻击前，BALB/c小鼠首先用抗原卵清蛋白(OVA)致敏，致敏和攻 击的BALB/c小鼠发展了特征性的哮喘表型。上述特征表现为与用PBS攻击的对照BALB/c 小鼠相比，在暴露于剌激物乙酰甲胆碱后AHR增加、气道嗜曙红细胞浸润、杯状细胞增生和 血清IgE分泌(图1)。 作为对比，在每次致敏和用OVA气雾化前施用抗IL-25mAb导致用气雾化的乙酰甲 胆碱攻击后AHR的显著消除，其具有与PBS对照小鼠相当的抵抗值(图1A)。施用同种型匹 配的对照mAb并没有抑制AHR(图1A)。
该抗IL-25mAb还显著降低了肺部脉管系统周围细胞浸润的水平(图1B和3A)、气 道杯状细胞增生(图1C和3B)和抗原特异性血清IgE水平(图1D)。 支气管肺泡灌洗(BAL)分析表明，在施用抗IL-25mAb后，与同种型对照处理的小 鼠相比，嗜曙红细胞浸润同样被显著抑制(图1E)。由于已知2型细胞因子能调节这些效 应子作用，我们测定了从分离自抗原重剌激后引流(draining)纵隔淋巴结的细胞分泌的 细胞因子水平。与通过BALB/c小鼠中0VA致敏和攻击诱导的2型细胞因子，IL-4、IL-5和 IL-13的水平升高相比，抗IL-25mAb的施用导致了这些细胞因子水平显著下降(图1F)。
这些数据支持了下述假设阻断IL-25信号传导可抑制2型细胞因子的产生，导致 消除了 2型效应子作用，包括炎症和AHR。因此，若从应答起始就开始施用，IL-25的拮抗剂 能有效抑制2型炎症。
材料和方法:
小鼠 BALB/c小鼠获自Harlan區，并且在SABU/CBS或国立心肺研究所实验室中于无特 异病原体环境下饲养。本报告中列出的所有动物实验经UK内政部批准进行。
致敏和变应原暴露 在第0天和第12天，向BALB/c小鼠(6_12周)腹膜内施用铝络合卵清蛋白 (20iig/注射)或仅仅铝(对照)进行致敏。随后在第19、20、21天气雾剂施用1%的卵清 蛋白，每天20分钟。在第22天使用体积描记法分析动物，评价AHR。
抗rmIL-25单克隆抗体的施用 如前所述诱导气道高反应性(AHR)，在每次腹膜内OVA致敏前一天、向肺中起始 OVA攻击和每次OVA气雾化前4小时腹膜内施用抗IL-25mAb (500 P g/剂)。在其他实验中， 仅在每次气雾化前当天腹膜内施用抗IL-25mAb(500ii g/剂)。对照小鼠接受盐水或同种型 对照(500iig/剂)代替抗IL-25单抗。同种型对照为抗-c-myc(小鼠IgGl，克隆9E10. 2)。
气道反应性的测量 麻醉动物，切开气管置于通风机上(SAR-830系列，CWE公司)，频率为150次 (breath)/分，潮气量0. 2ml。在全身体体积描记器(EMKATechnologies， Paris)中监测小 鼠，通过线内转导器评价经肺压。记录稳定的基线肺阻力后，通过气雾剂施用增加浓度的乙 酰-e-碘甲胆碱氯化物(乙酰甲胆碱)(Sigma， Dorset,區)，每个浓度下使用超声喷雾器 施用15秒，记录5分钟内的肺阻力。使用10X软件分析气道阻力、顺应性和标准肺参数。
支气管肺泡灌洗(BAL) 颈脱位法处死小鼠，通过气管造口术注入4X500ii1等分量PBS并回收。在用 giemsa染色的细胞离心涂片器上进行150细胞的差别细胞计数。
实施例3 :攻击之前施用 我们还评价了仅在0VA气雾化攻击前施用时抗IL-25mAb是否有效。使用抗 IL-25mAb的治疗显著减少了乙酰甲胆碱激发试验诱导的气道阻力，即使在应答之后施用也 是如此(图2A)。作为对比，施用对照同种型匹配的mAb并没有消除AHR。
显著地，肺部组织切片分析表明，抗IL-25mAb治疗的小鼠和OVA攻击的BALB/c对 照或同种型匹配的mAb治疗的对照之间血管周围的细胞浸润水平(图2B)或气道杯状细胞 增生(图2C)没有显著变化。
此夕卜，施用抗IL-25mAb后，嗜曙红细胞在BAL液中的比例(图2D)或抗原特异性血 清IgE的水平(图2E)均没有显著的下降。令人惊讶的是，在抗原重剌激后，2型细胞因子 IL-5和IL-13的水平仍然维持与OVA攻击的BALB/c对照或同种型匹配的mAb治疗的对照 相当(图2F) ， BAL中的IL-13水平也没有变化。这样，在应答的攻击期间施用抗IL-25可 特异性的消除AHR，即使2型细胞因子及其下游效应子并没有被下调。这些发现表明IL-25 可通过独立于经典2型应答的途径启动AHR。
材料和方法 材料和方法如实施例2所述，外加
肺组织收集和组织学 将肺在福尔马林(在0.9%盐溶液中的10%甲醛)中固定以供组织学分析。肺部 切片用giemsa染色用于杯状细胞的炎性浸润和过碘酸-Schiff (PAS)。使用数字评分系统
盲法测定气道上皮中PAS染色的杯状细胞(0 :< 5%杯状细胞；1 :5-25% ;2 :25_50% ;3 :
50-75%;4 :> 75% )。将各个肺气道评分总和除以检测的气道数，20-40气道/小鼠，以任
意单位的PAS评分表示。使用数字评分系统评价炎症以评估血管周围的浸润细胞数(0:血 管周围的浸润炎症细胞层<2个细胞厚度；1 :2-4个细胞厚度；2 :5_8个细胞厚度；3>8个
细胞厚度)。将各个肺气道评分总和除以检测的血管数，20-40气道/小鼠，以任意单位表 示。 实施例4 :IL-25通过独立于2型的途径作用 我们对在缺乏抗原致敏或攻击的情况下外源性施用rmIL-25是否能增强AHR进行 了评价。向BALB/c小鼠鼻内施用rmIL-25后16小时我们检测到气道阻力显著上升(图 3A)。之前的报道表明IL-13在哮喘表型、尤其是AHR中起中心作用。为确定IL-25是否 通过IL-13在AHR中起作用，我们向i113——小鼠施用了 rmIL-25。我们再一次观察到使用 rmIL-25处理后AHR升高(图3B)。由于其他2型细胞因子同样显示对哮喘表型起作用，我 们同样评估了 i14——i15—i19——i113——对鼻内施用rmIL-25的应答。即使在缺乏所有经典 2型细胞因子的情况下，用IL-25处理增强了乙酰甲胆碱激发试验后的AHR(图3C)。这些 数据支持了 IL-25通过独立于2型细胞因子的途径加剧AHR的作用。
材料和方法 材料和方法如实施例2和3所述，外加
小鼠 BALB/c背景下的转基因i14-八i15-7-i19-7-i113-八小鼠(P. G. Fallon等，2002. Immunity 17，7)和i113—y—小鼠(G. J. McKenzie等，1998. Curr Biol.8，339)如前所述。 C57BL/6x129 F2背景下的1125+小鼠如前所述(P. G. Fallon等2006. J. Exp. Med. 203， 1105)。 鼻内IL-25施用 在第0天向小鼠鼻内施用1.8iig rIL-25(R&D Systems)或 1. 8ii grlL-13(P印rotech)的40 PBS/鼠。对照动物仅接受PB S。
实施例5 :克隆2C3的可变结构域 分离来自3个2c3亚克隆的RNA，通过逆转录反应制备cDNA。 使用保守的5'VH区引物MHV7(SEQ ID NO :11)与IgGl恒定区引物MHCG1 (SEQ IDNO :12)的组合通过PCR扩增免疫球蛋白的重链(IgH)cDNA。 类似的，使用保守的5' IgK区引物MKV9(SEQ ID NO : 13)与k即pa恒定区引物
MKC(SEQ ID NO :14)的组合扩增免疫球蛋白轻链(IgK)。在整个PCR反应中使用耐热聚合酶Phusion(NEB F-531L)。 使用TOPO-blunt cloning⑧试剂盒(Cat 45-0245)，将来自3个独立的cDNA的采 用VH7+MHCG1作为引物的PCR反应的2c3扩增产物直接连接到pCRI1⑧Blunt- T〇p〇
载体中，同样处理轻链扩增反应扩增产物。通过将白色菌落挑取到琼脂网格上的PCR筛选 混合物中，将用所述连接的pCRII-bl皿t载体构建物转化的大肠杆菌T0P10细菌克隆至 LB-氨苄西林-XGal琼脂平板上。PCR扩增克隆的质粒插入物。凝胶电泳扩增产物，鉴定预 测的产物。产生正确大小的PCR扩增产物的每一克隆的过夜培养物(5ml)用QIApr印Spin Minipr印试剂盒方案(cat 27106)处理，产生小量制备的DNA质粒。 使用BigDye⑧Terminator v3. 0循环测序快速反应试剂盒(ABI cat. 4390242)
对质粒进行测序。每一选择的质粒使用M13正向和反向引物从两个方向测序，在
GeneAmp9600 PCR仪上循环。电泳序列分析在ABI毛细管测序仪上进行。 重复进行RT-PCR、克隆、DNA序列分析的完整循环以获得每一免疫球蛋白链三套
完全独立的序列信息。 VH和Vka卯a基因的全推断核苷酸序列分别如SEQ ID NO :15和SEQ ID NO :16所 示。这些序列包括每一可变基因片段头部的先导序列，其编码用于将新合成的抗体链转运 至内质网的信号序列；它们并不出现在最终的重链和轻链中。
参考文献 1. P. G. Fallon等，Immunity 17， 7 (Jul, 2002)。
2. G.G進ig等，Science 282,2261(1998)。
3.M.Wills_Karp等，Science 282,2258(1998)。
4. M. M. Fort等，Immunity 15， 985 (Dec, 2001)。
5.]\1尺.1(1111等，8100(1 100， 2330 (Oct 1,2002)。
6.G.Pan等，J Immunol 167， 6559 (Dec 1,2001)。
7. S. D. Hurst等，J Immunol 169， 443 (Jul 1,2002)。 8. T. A. Moseley， D. R. Haudenschild， L Rose, A. H. Reddi， CytokineGrowth Factor Rev 14，155 (Apr,2003)。 9. P. G. Fallon等，J Exp Med 203， 1105 (Apr 17,2006)。
10. A.M. 0wyang等，J Exp Med 203， 843 (Apr 17,2006)。
11. T. Tamachi等，J Allergy Clin Immunol 118， 606 (S印，2006)。
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权利要求
结合IL-25的靶标结合元件，其包括抗体VH结构域，该抗体VH结构域包括具有基本上如SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的VHCDR3。
2. 权利要求1所述的靶标结合元件，其中所述VH结构域还包括具有基本上如SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的CDRl，和具有基本上如SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的CDR2。
3. 权利要求1或2所述的靶标结合元件，其中所述VH结构域包括人框架区。
4. 权利要求1或2所述的靶标结合元件，其中所述VH结构域包括SEQ ID NO :2。
5. 前述任一权利要求所述的靶标结合元件，其还包括VL结构域，该VL结构域包含具有 基本上如SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的CDR1，具有基本上如SEQ ID N0:9所示氨基酸序 列的CDR2，以及具有基本上如SEQ ID NO :10所示氨基酸序列的CDR3。
6. 权利要求5所述的靶标结合元件，其中所述VL结构域包括人框架区。
7. 权利要求5所述的靶标结合元件，其中所述VL结构域包括SEQ ID NO :4。
8. 前述任一权利要求所述的靶标结合元件，其为Fab、F(ab' )2、scFv抗体片段。
9. 权利要求1-7任一项所述的靶标结合元件，其包括抗体恒定区。
10. 权利要求9所述的靶标结合元件，其中所述恒定区是IgGl或IgG4恒定区。
11. 权利要求9所述的靶标结合元件，其包括全抗体。
12. 分离的核酸，其包括编码前述任一权利要求所述的靶标结合元件的核苷酸序列。
13. 用于表达前述任一权利要求所述的靶标结合元件的表达载体，该表达载体包括可 操作地与启动子连接的权利要求12的核酸。
14. 携带权利要求13所述表达载体的宿主细胞。
15. 生产靶标结合元件的方法，该方法包括在用于生产所述靶标结合元件的条件下培 养根据权利要求14的宿主细胞。
16. 根据权利要求15所述的方法，还包括分离所述靶标结合元件。
17. 根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其还包括将所述靶标结合元件制成包 括至少一种附加成分的组合物。
18. 组合物，其包含权利要求1-11任一项所述的靶标结合元件和药学上可接受的载体。
19. 冻干粉形式的权利要求18所述的组合物。
20. 治疗或预防哮喘的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的权利要 求1-11任一项所述的靶标结合元件或权利要求18的组合物。
21. 用于治疗或预防哮喘的权利要求1-11任一项所述的靶标结合元件或权利要求18 的组合物。
22. 生产针对IL-25抗体的方法，该方法包括(a) 提供VH结构域，其包括靶标结合元件，所述靶标结合元件结合IL-25并且包括抗体 VH结构域，所述抗体VH结构域包含VHCDR3，所述VH CDR3具有基本上如SEQ ID NO. 7所示 氨基酸序列；(b) 使所述VH结构域与复数种抗体VL结构域组合以提供抗体分子；(c) 筛选所述抗体分子与IL-25的结合；并且(d) 选择与IL-25结合的抗体分子。
23. 权利要求22所述的方法，其中所述VH结构域如权利要求2-4任一项所定义。
24. 生产针对IL-25的抗体的方法，该方法包括(a) 提供编码VH结构域的核酸起始库，所述核酸包括将被替换的CDR3或缺乏CDR3编 码区；(b) 使所述库与供体核酸组合，所述供体核酸编码具有基本上如SEQ ID N0:7所示氨 基酸序列的VH CDR3，这样所述供体核酸插入到上述库的CDR3区，从而提供编码VH结构域 的核酸产物库；(c) 表达所述产物库的核酸；(d) 选择对IL-25特异性的靶标结合元件；并且(e) 回收所述靶标结合元件或编码其的核酸。
25. 权利要求24所述的方法，其中所述产物库与VL结构域共表达。
全文摘要
本发明提供了抗体2C3和结合白介素25的基于2C3的靶标结合元件。它们在治疗、例如治疗哮喘中是有效的。
文档编号C07K16/24GK101711256SQ200880020620
公开日2010年5月19日 申请日期2008年4月17日 优先权日2007年4月18日
发明者A·N·J·麦肯兹, S·巴兰坦 申请人:医疗研究局