一种产香酵母及其在发酵豆乳中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酵母菌和发酵豆乳加工领域，具体涉及一株产香酵母（Pichia amethioninaY)及其在发酵豆乳中的应用。
【背景技术】
[0002] 大豆中富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、黄酮等成分，具有辅助降血脂、抑制肿 瘤和阻止动脉硬化等作用。发酵豆乳不仅保留了大豆的营养功能成分，还具有发酵豆乳特 有的发酵清香、醇香和酯香，发酵过程中产生的多种蛋白水解酶可使大豆蛋白水解为小分 子肽和氨基酸，有利于人体的消化吸收并产生新的功能特性如降血压肽。国内酸豆乳的研 究已有十余年时间，但还没有投入工业化生产，主要原因是缺少适合发酵豆乳生产的专用 菌种，导致其风味与发酵牛乳相比仍存在明显的缺陷，其中比较突出的问题就是发酵豆乳 中存在豆腥味。
[0003] 豆腥味产生的主要原因是大豆种子中的脂肪氧化酶因为浸泡萌发而活化，并催化 油脂产生氢过氧化物，再降解成小分子醇、醛、酮、酸和胺等腥味成分。目前去除豆腥味的方 法主要有通过基因工程技术培育脂肪氧化酶缺失的大豆新品种，通过酸碱处理，添加还原 剂、氧化剂来钝化脂肪氧化酶活性等物理化学方法，但这些方法有的存在一定的食品安全 隐患，有的脱腥臭的效率不高；而采用微生物发酵法不仅可以去除其豆腥味，还可以提高其 营养价值和保健功能，是目前的研究热点。因此，筛选出适合发酵豆乳生产的专用菌种，具 有重要实际意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于根据现有技术中存在的问题，提供一种生长迅速，生长温域宽， 培养条件简单，产香效率高的产香酵母（PichiaamethioninaY)。该产香酵母与乳酸菌 XPL-1种子液接种到灭菌的豆浆中，进行发酵，获得一种新型的豆乳发酵剂，解决了发酵豆 乳中豆腥味难以去除的问题，提高了发酵豆乳的风味特征。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供上述酵母（PichiaamethioninaY)在改善发酵豆 乳风味中的一种应用。
[0006] 本发明通过以下技术方案予以实现：
[0007] -种产香酵母，该产香酵母为阿米塞毕赤酵母（PichiaamethioninaY)菌株，保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCN0. 10183,保藏日期为2014年12月 15日。
[0008] 该酵母的 26SrDNA序列为SEQ.ID.N01。
[0009] -种所述产香酵母在发酵豆乳中的应用。
[0010] 所述的产香酵母在发酵豆乳中的应用，该应用方法包括如下步骤：
[0011] (1)大豆浸泡、打浆、过滤、煮沸、添加蔗糖、灭菌，制备豆浆原液，每毫升豆浆中加 入0. 06-0. 08克蔗糖；
[0012] (2)按豆浆体积计，接入5 % -10 % (v/v)的乳酸菌XPL-1种子液和5 % -10 % (v/ v)的产香酵母种子液；
[0013] (3)在32-36°C保温培养8-16h，待发酵豆乳凝乳。
[0014] 所述的灭菌方式为高压蒸汽灭菌，温度为100_115°C，时间为10_20min。
[0015] 相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
[0016] (1)将乳酸菌XPL-1种子液与产香酵母（PichiaamethioninaY)种子液接种到灭 菌的豆浆中，进行发酵，获得了一种新型的豆乳发酵剂，解决了发酵豆乳中豆腥味难以去除 的问题，提高了发酵豆乳的风味特征。
[0017] (2)该菌株生长温域宽（图3)，其最适生长温度与乳酸菌XPL-1接近，便于选择合 适的培养温度，使得乳酸菌和酵母均可稳定快速生长，以缩短培养周期，降低生产成本。
[0018] (3)该菌株产香及脱去豆腥味的效率高，培养条件简单，易于工业化生产，具有良 好的开发应用前景。
[0019] 附图表说明
[0020] 图la为本发明PichiaamethioninaY菌株的菌落形态图；
[0021] 图lb为本发明PichiaamethioninaY菌株的菌体形态图；
[0022] 图2为本发明PichiaamethioninaY菌株PCR产物电泳图；
[0023] 图3为本发明PichiaamethioninaY菌株对温度适应性曲线示意图。 具体实施例
[0024] 为了更好地阐述本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但实施 例不构成对本发明保护范围的限定。
[0025] 实施例中需要说明的是：
[0026] (1)对温度的适应性检测方法：取100mL三角瓶，加入50mL麦芽汁液体培养基， 115°C灭菌15min，冷却后接种PichiaamethioninaY菌株，37°C培养过夜，作为种子培养液 备用。在灭菌的麦芽汁液体培养基三角瓶中加入lmL种子培养物（发酵接种量为2% (v/ v))，分别在22 °C，27 °C，32 °C，37 °C，42 °C，47 °C，52 °C等温度下恒温培养，设置3组平行发 酵，18h后，用紫外-可见分光光度计在600nm处测其0D值（见图3)。
[0027] (2)对pH、酸度和持水力的测定：分别采用pH计法、NaOH滴定法和离心法测定，其 中持水力值越尚，表不样品的持水能力越强。
[0028] (3)对发酵豆乳香气成分的测定与分析：采用固相微萃取及气质联用的分析方 法。
[0029] ①固相微萃取的条件：将首次使用的50/30ymDVB/CAR/PDMS固相微萃取头（固相 微萃取装置为美国Supelco公司产品，型号为Supelco)在气相色谱进样口老化至无杂峰， 在250°C下老化30min。吸取5mL样品放入15mL样品瓶中，在40°C加热平台上保持10min， 将萃取头插入瓶中，磁力搅拌速度40r/min，40°C条件下萃取30min。
[0030] ②GC-MS参数条件：色谱柱为DB-5MSUI毛细管色谱柱（60mX0. 25mm，0. 25ym); 气质联用仪为美国Agilent公司产品（Agilent6890/5975B)。进样口温度250°C，萃取头 插入进样孔解吸3min;程序升温：始温35°C，保持3min，以3°C/min升至80°C，再以4°C/ min升至120°C，再以10°C/min升至230°C，保持8min;载气（He)流速1.OmL/min，不分流。
[0031] (4)乳酸菌及酵母种子液的制备：
[0032] ①乳酸菌XPL-1种子液：取lOOmL三角瓶，加入50ml的12% (w/v)牛奶培养基， 60°C水浴30min后，115°C灭菌15min。按0. 004g/100ml的比例接种XPL-1菌粉，37°C培养 12h，作为种子培养液备用。
[0033] ②产香酵母PichiaamethioninaY种子液：取100mL三角瓶，加入50mL麦芽汁液 体培养基，115°C灭菌15min，接种PichiaamethioninaY菌株，36°C培养24h，作为母发酵 剂。取100mL三角瓶，加入40ml的12% (w/v)牛奶培养基，60°C水浴30min后，115°C灭菌 15min。按l/40(v/v)的比例将上述母发酵剂接入牛奶培养基中，36°C培养24h，作为种子培 养液备用。
[0034] ③葡萄酒活性干酵母VIC种子液：取100mL三角瓶，加入50ml的12% (w/v)牛奶 培养基，60°C水浴30min后，115°C灭菌15min。按0. 004g/100ml的比例接种葡萄酒活性干 酵母菌粉，28°C培养24h，作为种子培养液备用。
[0035] (5)实施例中的w/v是指质量体积比，其中质量w单位为克；体积v的单位为毫升。 v/v是指体积比。
[0036] 实施例1菌株筛选
[0037] (1)使用无菌采样瓶，现场采样自然发酵而成的酸浆水，低温带回。立即使用无菌 水分别稀释至10 3、10 4、10 5倍，涂布于麦芽汁琼脂培养基上。然后放入37°C的恒温培养箱 中，培养48h。挑取疑似菌落，进行平板划线分离，如此重复4~5次，直至获得纯的单菌落。 将纯化的单菌落用接种针接种于麦芽汁琼脂斜面培养基中，于4°C冰箱内保存。
[0038] (2)从自然发酵的酸浆水中分离出菌株Y，其在麦芽汁琼脂培养基上的菌落呈圆 形、直径一般为3-5_，乳白色、不透明状，湿润粘稠，易被挑起（图la);进行革兰氏染色和 细胞形状观察，菌株Y的菌体呈圆柱形（图lb)。表明菌株Y为革兰氏阳性菌。
[0039] 实施例2菌株鉴定
[0040] 利用DNA提取试剂盒提取酵母DNA并进行琼脂糖凝胶电泳，然后设计酵母菌 26SrDNA引物，进行PCR扩增，电泳图如图2所示，条带单一，条带大小在500bp左右。（1，2 为酵母菌26SrDNA序列PCR扩增产物；M为10000bpMarker)。
[0041] 将纯化回收的DNA片段进行测序，测序结果见SEQ.ID.N01。然后利用BLAST软件 与已报到的26SrDNA进行比对，比对结果显示该DNA序列与毕赤酵母属中的东方伊萨酵母 (Issatchenkiaorientalis)、库德里阿兹威（氏）毕赤酵母（Pichiakudriav