专利名称：以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，具体涉及一株圆酵母(Torula.sp)B84512菌株,属于生物技术领域。
背景技术：
随着生活水平的提高，“三高”人群数量呈指数增长，现今低糖、低盐、低热量的食品成为了人们的首选。赤藓糖醇由于其具有热量低、口感佳、低吸湿性、对糖尿病人安全、对热酸十分稳定及不会引起肠胃不适等优点，成为了 21世纪最受欢迎的功能性食品添加剂。赤藓糖醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法主要是用酸碱处理经高碘酸氧化过的淀粉或纤维素，高温高压下加氢还原获得，但产物中副产物较多，收率低，产物较难分离，难以实现工业化。而以小麦或玉米等淀粉质原料，经酶降解生成葡萄糖，由耐高渗酵母或其他菌株，在高浓度下发酵后浓缩结晶分离干燥而得。与化学合成法相比，该法生产过程温和容易控制、环境污染少、产品安全，更具有生产优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种圆酵母(Torula.sp)B84512连续发酵提取赤藓糖醇的方法，以提高赤藓糖醇的发酵效率和葡萄糖转化率、简化提取工艺。按照本发明提供的技术方案，一种以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，步骤为:
Cl)细胞液体培养物的制备:挑取YPD固体培养基上的圆酵母(Torula.sp) B84512菌株一环，接种在装有50mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，在25_35°C下，置于摇床上以150-200 r/min的转速培养30_48h至对数期，即制得圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物；
Yro固体培养基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高压蒸汽灭菌20min ;固体YPD培养基在液体培养基的基础上加入20 g/L琼脂粉；
种子培养基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余为纯水，115°C高压蒸汽灭菌15min ;
(2)准备发酵培养基，培养基成分按重量百分比计如下:葡萄糖20%-30%，酵母粉
0.5%-1%，CuSO4.5H20 0.0005%-0.001%, MnSO4 H2O 0.0005%_0.001%，其余为纯水，pH 自然，110-120°C、0.1-0.2MPa 蒸汽灭菌 10_20min，待用；
(3)发酵装置连接:补料瓶与5L发酵罐相连，5L发酵罐依次连接微滤膜、纳滤膜，纳滤膜与赤藓糖醇储罐连接；
(4)发酵培养条件:将步骤(I)制备的圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物以重量比，即细胞液体培养物的重量占发酵培养基4%-8%的接种量接种在装有已灭菌的2-3L发酵培养基的5L发酵罐中，在温度为28-30°C，转速为300_600r/min，通气量为
0.5-lvvm的条件下发酵培养60_84h ；当5L发酵罐中赤藓糖醇浓度达到60g/L时，通过微滤膜过滤发酵体系，滤液继续经纳滤膜过滤，被微滤膜截留的大分子液体以0.5-lmL/min的流速回流至发酵体系再利用；通过纳滤膜选择性过滤后，即得到赤藓糖醇的发酵液，储存于赤藓糖醇储罐中，被纳滤膜截留的液体以0.5-lmL/min的流速回流至发酵体系；同时以0.4-0.6mL/min的速度流加质量浓度为15%-25%的葡萄糖，为发酵体系提供充足的底物，并维持发酵总体积不变，不断发酵培养即可连续发酵提取得到赤藓糖醇的发酵液。所述葡萄糖底物转化率达到45%以上，赤藓糖醇的发酵液提取收率达到97%。所述微孔滤膜的过滤孔径为0.1-1 μ m ;纳孔滤膜的过滤孔径为0.l_100nm。赤藓糖醇含量测定:采用HPLC法检测赤藓糖醇。色谱柱为Sugar-D色谱柱；流动相为乙腈:水=75:25 ;流速为lml/min，检测器为示差折光检测器。赤藓糖醇标准品来自于Sigma0生物材料样品保藏:一株圆酵母(7brw7a.sp) B84512菌株，保藏编号为CGMCC7582，保藏日期为2013年5月12日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。本发明具有如下优点:本发明所述的以圆酵母(7biT/7a.5/7>B84512为出发菌株连续发酵提取产赤藓糖醇的方法，延长了赤藓糖醇的发酵周期，提高了底物的转化率和产品收率，简化了提取工艺，产品质量稳定，生产成本低，该工艺可进一步推广至工业化大规模生产。
图1本发明发酵系统连接示意图。
附图标记说明:①补料瓶:内装20%葡萄糖溶液；(D 5L发酵罐；(D微滤膜:用于过滤酵母，使其回流至发酵罐；④纳滤膜:用于选择性过滤赤藓糖醇；⑤赤藓糖醇储罐。箭头为液体流向。
具体实施例方式实施例1圆酵母(Torula.sp) B84512的5L发酵罐连续发酵体系制备赤藓糖醇
1、培养基配方
(I)种子培养基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuS04 5H20 0.01 g/L，MnS04 H20 0.01 g/L，PH 自然，115°C高压蒸汽灭菌 15min。(2)发酵培养基:葡萄糖 300 g/L，酵母粉 10 g/L，尿素 I g/L，CuS04 5H20 0.01g/L, MnS04 H20 0.01 g/L，PH 自然，115°C高压蒸汽灭菌 15min。2、培养方法
(I)种子培养方法
挑取YPD固体培养基上的圆酵母(Torula.sp)B84512菌株一环，接种在装有50 mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以150-200 r/min的转速培养30-48h至对数期，即制得圆酵母(Torula.sp) B84512菌株的种子液体培养物。(2) 5L发酵罐连续发酵提取方法
将上述圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的种子液体培养物以4-8% (v/v)的接种量接种在装有已灭菌的3L发酵培养基的5L发酵罐中，在30°C条件下，转速为300-600r/min，通气量为lvvm, 50h后设定为0.5vvm,约70h后发酵液中赤藓糖醇产量达到60g/L,葡萄糖浓度降至50g/L左右，此时开启补料，以0.5 ml/min的速度补加20%的葡萄糖；同时开启微滤、纳滤装置，以0.5mL/min的速度提纯赤藓糖醇母液。发酵至240h左右，菌株活性下降，赤藓糖醇比合成速率下降至0.5g/L/h以下，停止发酵，取发酵液过滤除菌，经纳滤得到的滤过液与赤藓糖醇母液混合。经计算此发酵过程中消耗葡萄糖1920g，发酵底物转化率达45%以上，取得赤藓糖醇母液约7L，浓度为120g/L，总计840g，产品收率达97%。实施例2
一种以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，步骤为:
Cl)细胞液体培养物的制备:挑取YPD固体培养基上的圆酵母(Torula.sp) B84512菌株一环，接种在装有50mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，在35°C下，置于摇床上以200 r/min的转速培养36h至对数期，即制得圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物；YH)固体培养基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高压蒸汽灭菌20min ;固体YPD培养基在液体培养基的基础上加入20 g/L琼脂粉；
种子培养基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余为纯水，115°C高压蒸汽灭菌15min ;
(2)准备发酵培养基，培养基成分按重量百分比计如下:葡萄糖30%，酵母粉1%，CuSO4.5H20 0.001%, MnSO4 H2O 0.001%，其余为纯水，pH 自然，120°C、0.2MPa 蒸汽灭菌20min，待用；
(3)发酵装置连接:如图1所示，补料瓶I与5L发酵罐2相连，5L发酵罐2依次连接微滤膜3、纳滤膜4，纳滤膜4与赤藓糖醇储罐5连接；
(4)发酵培养条件:将步骤I制备的圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物以重量比，即细胞液体培养物的重量占发酵培养基8%的接种量接种在装有已灭菌的2L发酵培养基的5L发酵罐2中，在温度为30°C，转速为300r/min，通气量为Iwm的条件下发酵培养60-84h ；
当5L发酵罐2中赤藓糖醇浓度达到60g/L时，通过微滤膜3过滤发酵体系，滤液继续经纳滤膜4过滤，被微滤膜3截留的大分子液体以lmL/min的流速回流至发酵体系再利用；通过纳滤膜4选择性过滤后，即得到赤藓糖醇的发酵液，储存于赤藓糖醇储罐5中，被纳滤膜4截留的液体以0.5mL/min的流速回流至发酵体系；同时以0.6mL/min的速度流加质量浓度为15%的葡萄糖，为发酵体系提供充足的底物，并维持发酵总体积不变，不断发酵培养即可连续发酵提取得到赤藓糖醇的发酵液。所述葡萄糖底物转化率达到45%以上，赤藓糖醇的发酵液提取收率达到97%。所述微孔滤膜的过滤孔径为0.1-1 μ m ;纳孔滤膜的过滤孔径为0.l_100nm。实施例3
一种以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，步骤为:
Cl)细胞液体培养物的制备:挑取YPD固体培养基上的圆酵母(Torula.sp)B84512菌株一环，接种在装有5 0mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以180 r/min的转速培养42h至对数期，即制得圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物；YH)固体培养基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高压蒸汽灭菌20min ;固体YPD培养基在液体培养基的基础上加入20 g/L琼脂粉；
种子培养基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余为纯水，115°C高压蒸汽灭菌15min ;
(2)准备发酵培养基，培养基成分按重量百分比计如下:葡萄糖25%，酵母粉0.8%，CuSO4.5H20 0.0005%, MnSO4 H2O 0.001%，其余为纯水，pH 自然，115°C、0.1-0.2MPa 蒸汽灭菌15min，待用；
(3)发酵装置连接:如图1所示，补料瓶I与5L发酵罐2相连，5L发酵罐2依次连接微滤膜3、纳滤膜4，纳滤膜4与赤藓糖醇储罐5连接；
(4)发酵培养条件:将步骤(I)制备的圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物以重量比，即细胞液体培养物的重量占发酵培养基6%的接种量接种在装有已灭菌的2-3L发酵培养基的5L发酵罐2中，在温度为28-30°C，转速为500r/min，通气量为Ivvm的条件下发酵培养84h ；
当5L发酵罐2中赤藓糖醇浓度达到60g/L时，通过微滤膜3过滤发酵体系，滤液继续经纳滤膜4过滤，被微滤膜3截留的大分子液体以0.5mL/min的流速回流至发酵体系再利用；通过纳滤膜4选择性过滤后，即得到赤藓糖醇的发酵液，储存于赤藓糖醇储罐5中，被纳滤膜4截留的液体以0.8mL/min的流速回流至发酵体系；同时以0.5mL/min的速度流加质量浓度为20%的葡萄糖，为发酵体系提供充足的底物，并维持发酵总体积不变，不断发酵培养即可连续发酵提取得到赤藓糖醇的发酵液。所述葡萄糖底物转化率达到45%以上，赤藓糖醇的发酵液提取收率达到97%。所述微孔滤膜的过滤 孔径为0.1-1 μ m ;纳孔滤膜的过滤孔径为0.l_100nm。
权利要求
1.一种以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，其特征是: (1)细胞液体培养物的制备:挑取YPD固体培养基上的圆酵母(Torula.sp)B84512菌株一环，接种在装有50mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，在25-35°C下，置于摇床上以150-200 r/min的转速培养30_48h至对数期，即制得圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物； Yro固体培养基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高压蒸汽灭菌20min ;固体YPD培养基在液体培养基的基础上加入20 g/L琼脂粉； 种子培养基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余为纯水，115°C高压蒸汽灭菌15min ; (2)准备发酵培养基，培养基成分按重量百分比计如下:葡萄糖20%-30%，酵母粉0.5%-1%，CuSO4.5H20 0.0005%-0.001%, MnSO4 H2O 0.0005%_0.001%，其余为纯水，pH 自然，110-120°C、0.1-0.2MPa 蒸汽灭菌 10_20min，待用； (3)发酵装置连接:补料瓶(I)与5L发酵罐(2)相连，5L发酵罐(2)依次连接微滤膜(3)、纳滤膜(4)，纳滤膜(4)与赤藓糖醇储罐(5)连接； (4)发酵培养条件:将步骤(I)制备的圆酵母(Torula.sp)B84512菌株的细胞液体培养物以重量比，即细胞液体培养物的重量占发酵培养基4%-8%的接种量接种在装有已灭菌的2-3L发酵培养基的5L发酵罐(2)中，在温度为28-30°C，转速为300_600r/min，通气量为0.5-lvvm的条件下发酵培养60-84h ； 当5L发酵罐(2)中赤藓糖醇浓度 达到60g/L时，通过微滤膜(3)过滤发酵体系，滤液继续经纳滤膜(4)过滤，被微滤膜(3)截留的大分子液体以0.5-lmL/min的流速回流至发酵体系再利用；通过纳滤膜(4)选择性过滤后，即得到赤藓糖醇的发酵液，储存于赤藓糖醇储罐(5)中，被纳滤膜(4)截留的液体以0.5-lmL/min的流速回流至发酵体系；同时以0.4-0.6mL/min的速度流加质量浓度为15%_25%的葡萄糖，为发酵体系提供充足的底物，并维持发酵总体积不变，不断发酵培养即可连续发酵提取得到赤藓糖醇的发酵液。
2.如权利要求1所述以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，其特征是:所述葡萄糖底物转化率达到45%以上，赤藓糖醇的发酵液提取收率达到97%。
3.如权利要求1所述以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，其特征是:所述微孔滤膜的过滤孔径为0.1-1 μ m ;纳孔滤膜的过滤孔径为0.l-100nm。
全文摘要
本发明涉及一种以圆酵母菌株连续发酵提取生产赤藓糖醇的方法，具体涉及一株圆酵母(Torula.sp)B84512菌株，属于生物技术领域。本发明所述的以圆酵母(Torula.sp)B84512为出发菌株连续发酵提取产赤藓糖醇的方法，通过滤膜过滤回收滤液和添加葡萄糖延长了赤藓糖醇的发酵周期，提高了底物的转化率和产品收率，简化了提取工艺，产品质量稳定，生产成本低，该工艺可进一步推广至工业化大规模生产。
文档编号C12P7/18GK103224960SQ201310191160
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月21日 优先权日2013年5月21日
发明者陆茂林, 吴燕, 张六六, 唐宝英, 刘佳 申请人:江苏省微生物研究所有限责任公司