专利名称：一种微生物联合发酵制备牛蒡子提取物的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵制备中药材提取物的方法技术领域，具体涉及一种微生物联合发酵制备牛蒡子提取物的方法。
背景技术：
牛蒡子(Fructus Arctii),主要含有牛蒡苷(Arctiin)和牛蒡子苷元(ArCtigenin，ACT)等木脂素类化合物。牛蒡苷在体内被分解为牛蒡子苷元而产生众多药理作用。牛蒡子苷元具有显著的抗菌，抗病毒，抗肿瘤，抗炎及钙拮抗活性。且牛蒡子苷元来源丰富，其前体牛蒡苷在中药牛蒡和毛头牛蒡果实中含量较高，具有很高的新药开发价值。目前国内已有利用蜗牛酶对提取的牛蒡苷进行体外酶解的报道，但存在一些不足:工艺复杂、成本 过高；而早期研究早已证明木脂素类化合物在酸或碱的情况下可以分解，但会发生异构化，改变原有的结构，从而引起药效的降低。因此，本申请人拟采用微生物联合发酵的方法制备牛蒡子苷元提取物，利用微生物产生丰富的酶系，在温和条件下分解转化物质的能力强，比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。同时还具有减少环境污染、降低生产成本等优点，在体外可控条件下温和地将牛蒡苷有效地转化成牛蒡子苷元，以达到产业化生产转化，有效地提高了牛蒡子提取物中牛蒡子苷元的含量。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种微生物联合发酵制备牛蒡子提取物的方法。本发明的目的通过以下技术方案得以实现:一种微生物联合发酵制备牛蒡子提取物的方法，其特征在于:所述微生物为泡盛曲霉变种和里氏木霉菌。进一步，所述泡盛曲霉变种和里氏木霉菌和分别为泡盛曲霉变种Aspergillusawamori var.CICC2203 和里氏木霉 Trichoderma reesei CICC40932。进一步，所述泡盛曲霉变种和里氏木霉菌的接种量比为1:2。与现有技术相比，本发明方法的优点和有益效果在于:1、采用微生物发酵法制备牛蒡子提取物，与体外酶解法制备牛蒡子提取物相比，工艺简单，成本低，不发生结构异化，完整地保持了牛蒡子提取物有效成分的原有化学结构，保持提取物的优良药效;2、采用微生物发酵法制备牛蒡子提取物，与物理或化学方法制备牛蒡子提取物相t匕，在温和条件下利用微生物产生丰富的酶系、分解转化物质能力强的优点，大幅度地改变药性，提高了有效成分的转化效率和疗效，降低毒副作用，扩大适应症，大大地减少了有机试剂对生态环境的污染；3、本发明采用微生物联合发酵的方法，确定泡盛曲霉变种和里氏木霉菌为最佳发酵组合，与单一菌株发酵相比，很大程度上提高了牛蒡子中牛蒡苷转化为牛蒡子苷元的转化率，达到99.9%，有效地解决了牛蒡苷转化为牛蒡子苷元转化率低的问题，为牛蒡子提取物产业化生产解决了技术难题。
图1是牛蒡子苷元色谱图；图2是不同菌种及其组合发酵效果比较结果图；图3是碳源对发酵效果的影响示意图；图4是氮源对发酵效果的影响示意图；图5是时间对发酵效果的影响示意图；图6是装液量对发酵效果的影响示意图；图7是pH对发酵效果的影响示意图；图8是接种量对发酵效果的影响示意图；图9是正交试验优化结果示意图。
具体实施例方式以下内容用于进一步阐述本发明的技术方案，以使本领域技术人员对本发明有更深入的理解，但以下内容不应以任何方式被理解为对本发明权利要求书请求保护范围的限制。本研究室主要从事中兽药和动物疾病方面的研究，牛蒡子是我国的传统中药瑰宝，具有很高的药用价值，本研究室前期的研究发现牛蒡子苷元具有良好的抗圆环病毒的特性，同时还具有良好的抗炎、免疫调节等作用，牛蒡子苷元这些优良的药用特性，增加了我们浓厚的研究兴趣，准备开发为国家新兽药。但牛蒡子苷元的规模化提取成为我们的巨大难题，目前在国内外也没有很好解决这一难题，我们采用化学提取方法，成功地在实验室制得了牛蒡子苷元纯品，但工艺复杂，成本高，大量化学试剂污染环境，无法实现大规模生产。在采用微生物单菌株发酵的时候，做了多次试验，效果均不理想；在一次发酵试验中，突然发现有一组试验结果中牛蒡苷转化为牛蒡子苷元的转化率相当高，转化率几乎达到100%，最后发现是在平板接种的过程中，里氏木霉菌种平板中混入了泡盛曲霉变种孢子所致，于是我们拟采取联合发酵，后面的试验进一步确证了试验结果。菌种的选择确实具有很强的目的性，所选取的菌种都是一些常用的，从古至今，人们在生产、生活中都在利用这些真菌进行微生物发酵，微生物可以产生丰富的酶系，因而有着在温和条件下非常强大的分解转化物质的能力，并能产生丰富的次生代谢产物，通过微生物的生长代谢和生命活动来发酵炮制中药，可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。同时还具备减少环境污染、减低生产成本等优点。基于微生物所具有的上述独特优点，本研究采用体外微生物发酵法模拟体内肠道微生物转化的方式对牛蒡苷进行有效的转化而生成牛蒡子苷元，利用筛选保藏的这六株β_葡萄糖苷酶的高产菌株与牛蒡子进行共发酵， 利用微生物的酶系作用使牛蒡子苷的糖苷键断裂而生成牛蒡子苷元和葡萄糖。在体外可控条件下温和地实现将牛蒡苷转化为牛蒡子苷元，以达到向产业化生产转化，有效地提高牛蒡子提取物中牛蒡子苷元的含量。
I试验材料1.1 菌种海率曲霉Aspergillus phoenicis CICC2216 ;里氏木霉 Trichoderma reeseiCICC40932 ;泡盛曲霉变种 AspergiIIus awamori var.CICC2203 ;米曲霉 AspergiIIusoryzae CICC2014购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。黑曲霉Aspergillus nigerATCC16404 ;绿色木霉Trichoderma viride CICC41495由华中农业大学生命科学技术学院郝勃教授馈赠。1.2仪器与设备超净工作台(SW-CJ-1FD)，JY2002型电子天平，高压灭菌锅，恒温培养箱，恒温培养摇床，安捷伦1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，KQ-100B型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司生产)，SZ-93型自动双重纯水蒸馏器，RE-5203A型旋转蒸发仪(上海精密科学仪器有限公司)，AUY120型分析天平(日本Shimadzu公司)，CS101型电热鼓风干燥箱(重庆试验设备厂)，显微镜，pH计，电磁搅拌器,索氏回流装置,锥形瓶(2501111^、501]11^),容量瓶，血球计数板，玻璃球，毛细管，展开室，移液管，移液枪，试管，脱脂棉，纱布。1.3药物与试剂
牛蒡子苷元对照品，纯度> 99%，批号120307，牛蒡苷对照品，纯度> 99%，批号110107，上海融禾医药科技发展有限公司；牛蒡子粉(200目)，批号20110402，武汉强康药业有限公司；麸皮、玉米粉、豆柏粉，批号20120302，武汉安佑饲料有限公司；鹿糖、甲醇、乙醇、三氯甲烷、冰醋酸、正丁醇、葡萄糖、琼脂、无菌水、磷酸二氢钾、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锌、氯化钴、盐酸、氢氧化钠、硫酸、吐温80、蛋白胨，分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；GF254硅胶板，批号20120108，青岛海洋化工有限公司。2试验方法2.1培养基的制备2.1.1平板培养基PDA (Potato Dextrose Agar)其做法是先将马铃薯洗净去皮,再称取200g切成小块，加水煮烂(煮沸20-30min,能被玻璃棒戳破即可),用四层纱布过滤，向滤液中加入20g葡萄糖和15g琼脂，再补足水分至1000mL，12rC灭菌15min，制成平板培养基，冷却后贮存备用。2.1.2种子培养基Mandel营养液:磷酸二氢钾2g,硫酸铵1.4g,尿素0.3g,硫酸镁0.3g,氯化隹丐
0.3g,硫酸铁5mg,硫酸猛1.56mg,硫酸锌1.4mg,氯化钴0.2mg,无菌水定容至1000mL。向Mandel营养液中加入吐温802mL/L,蛋白胨lg/L,葡萄糖10g/L,用硫酸调pH至
5.0-6.0，115°C灭菌20min，得到种子培养液。2.1.3发酵培养基 称取牛蒡子粉8g，麸皮5g，玉米粉5g，蛋白胨0.6g，装入250mL锥形瓶中，121 °C灭菌15min。然后加入无菌Mandel营养液20mL，并注入无菌水将装液量定容为130mL，121°C灭菌15min。2.2菌种的活化
菌种冻干粉存储于真空干燥管内并低温保存，取出后恢复至室温，转移至超净工作台内。以沾有75%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管尖端。滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂。取出隔热纤维质和内管，以灭菌过的镊子取出内管棉塞。用无菌吸管吸取
0.3-0.5mL无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5mL无菌水的灭菌试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30-60min。取0.1-0.2mL菌体悬浮液均匀涂布于制作好的PDA平板培养基上,做分离培养，培养温度为28-30°C。检验菌种纯度及活化情况。2.3种子菌液的制备取活化好的菌种，采用无菌操作对PDA平板培养基进行接种。于培养箱内，28-30°C培养5-6d。培养完成后即可产生成熟孢子。取已培养好的菌种平板，加入IOml无菌水，轻轻晃动将琼脂表面的孢子冲下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml锥形瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的三层纱布进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液体积达到10.0ml，待测孢子悬浮液即得。将孢子悬浮液用无菌水稀释100-1000倍，吸取适量的稀释液至血球计数板的计数室内，然后加上盖玻片，静置约5mi·n，先在低倍镜下找到计数室，再转换成高倍镜观察并计数。计算孢子浓度，并将其配制成浓度为IO6-1O7个/mL的孢子悬浮液备用。取50mL制备好的种子培养基置于250mL锥形瓶中，吸取2mL制备好的IO6-1O7个/mL的孢子悬浮液进行接种。175rpm，28-3(TC条件下培养l_2d，即得种子菌液。2.4牛蒡子粉中牛蒡苷与牛蒡子苷元的含量测定2.4.1标准液的配制 精确称取牛蒡苷标准品4.59 mg、牛蒡子苷元标准品11.68 mg溶解于25mL甲醇中，配制成牛蒡苷与牛蒡子苷元标准品摩尔浓度分别为3.435X10_4mmol/L和
1.246 X I(T3HimoI/L的混合标准溶液。2.4.2色谱检测条件发酵所得样品采用Agilent高效液相色谱仪，280nm波长下进行检测；图1为泡盛曲霉变种和里氏木霉菌组合发酵样品中牛蒡子苷元色谱行为。2.4.2牛蒡苷及牛蒡子苷元的提取称取8g牛蒡子粉，用10倍质量的80%乙醇进行回流提取，提取3次，每次lh。合并3次的提取液，用旋转蒸发仪蒸干后，取出烧瓶里的浸膏并烘干，用50mL甲醇定容，制成待测溶液。按相同方法提取三份平行样品。按上述HPLC条件，对提取物进行检测。采用外标法分别计算牛蒡子粉中牛蒡苷与牛蒡子苷元的物质的量浓度(Ctll与Ctl2),从而作为未经发酵药物原粉对照样品，按下式计算经过发酵药粉的转化率，溶出率及损失率。T (%) = (C01-Cel) /C01X 100 ；S (%) = (Cel+Ce2) / (C01+C02) X 100 ；L (%) =100%-S (%)式中:T-转化率；S_溶出率；L_损失率Ktll-未经发酵药粉中牛蒡苷物质的量浓度(mol/mL) 经过发酵药粉中牛蒡苷物质的量浓度(mol/mL) Kci2-未经发酵药粉中牛蒡子苷元物质的量浓度(mol/mL) ;(^2_经过发酵药粉中牛蒡子苷元物质的量浓度(mol/mL)。
2.5牛蒡子粉的发酵炮制2.5.1发酵菌种的筛选分别将制备好的海枣曲霉CICC2216，里氏木霉CICC40932，泡盛曲霉变种CICC2203，米曲霉CICC2014，黑曲霉ATCC 16404和绿色木霉CICC 41495种子菌液按下表I所示接种量及排列组合接种至已配制好的发酵培养基内，每组做3个平行样品。28-30°C，175rpm,发酵时间为168h。表I接种试验表
权利要求
1.一种微生物联合发酵制备牛蒡子提取物的方法，其特征在于:所述微生物为泡盛曲霉变种和里氏木霉菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述泡盛曲霉变种和里氏木霉菌和分别为泡盛曲霉变种awamori var.CICC2203 取里氏木霉 Trichoderma reeseiCICC40932。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述泡盛曲霉变种和里氏木霉菌的接种量比为1:2。
全文摘要
本发明属于微生物发酵制备中药材提取物的方法技术领域，具体公开了一种微生物联合发酵制备牛蒡子提取物的方法。本发明采用泡盛曲霉变种Aspergillusawamorivar.CICC2203和里氏木霉TrichodermareeseiCICC40932联合发酵来制备牛蒡子提取物，并对发酵工艺条件进行了优化研究，很大程度上提高了牛蒡子中牛蒡苷转化为牛蒡子苷元的转化率，达到99.9%，有效地解决了牛蒡苷转化为牛蒡子苷元转化率低的问题，为牛蒡子提取物产业化生产解决了技术难题。
文档编号C12R1/665GK103233056SQ20131011409
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月2日 优先权日2013年4月2日
发明者陈洁, 何斌, 陆征, 操继跃, 钱运国, 杨文海, 童新红, 叶胜强, 韩艳云, 童伟文, 陶弼菲, 夏瑜, 孙书林 申请人:武汉市畜牧兽医科学研究所