专利名称：从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法
技术领域：
本发明涉及一种从发酵技术培养物中直接提取纳他霉素的方法。
背景技术：
纳他霉素[Natamycin又称匹马霉素(Pimaricin)、田纳西菌素(Tenecetin)]是一种多烯大环内酯类抗生素；分子式C33H47NO13；分子量665.75道尔顿；纳他霉素是一种两性化合物，等电点为pH6.5，其结构一般存在两种构型，分别为烯醇式和酮式结构。纳他霉素的结构式为 由于纳他霉素能高效、专一性的抑制酵母菌和霉菌并具有良好的理化稳定性以及极低的毒性，因而纳他霉素被用于医疗(外用)、食品、饲料、粮储之中，特别是在食品原料保鲜、食品防腐方面的应用中显示了良好的前景。但目前由于其极高的生产成本，使纳他霉素产品商业化应用受到了极大的限制，仅作为高端防腐剂应用。因为纳他霉素通常条件下不溶于水只溶于一定条件下的有机溶媒，所以它的提取方法不能经济运行，因此有必要开发一种经济可行的纳他霉素提取工艺。
纳他霉素已通过由链霉菌经生物发酵产生，常用的链霉菌包括GB-A844289公开的纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、WO93/03171公开的褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)及恰恰努加链霉菌(Streptomyceschattanoganis)等。纳他霉素的发酵单位一般可以达到2g-15g/L。通过适当的抗生素提取技术就可以从纳他霉素发酵液中分离纯化出纳他霉素。美国专利3,892,850、WO92/07998、WO92/1058等公布了纳他霉素的提取方法，以上这些专利公布的方法都需要先从发酵液中富集或分离出菌丝体，然后再利用有机溶媒如甲醇、异丙醇等从富集或分离出的菌丝体中提取出纳他霉素。纳他霉素的发现者Struky的美国专利3,892,850公布了通过酸化甲醇萃取菌丝体后蒸馏、沉淀提取纳他霉素的方法。专利WO92/07998、WO92/1058公布的方法为向分离出的菌丝体中加入甲醇，然后调节pH值至1.0-4.5以使纳他霉素被萃取到有机相中；过滤除去菌丝体，通过调节萃取液pH值到6.0-9.0使纳他霉素结晶析出。
由于纳他霉素不溶于水，在发酵液中以固体形式附着与菌丝体表面，因此以上所述专利中的提取方法为了提高提取液中有机溶媒的浓度减少有机溶媒用量，它们在利用有机溶媒萃取纳他霉素之前都先通过离心、浓缩、过滤等固液分离方法中的一种减少发酵液中的水分，富集发酵液中的菌丝体以便提取之用，这样就造成了动力、人力费用的浪费。同时所有这些提取方法都需要使用甲醇、异丙醇等易燃、易挥发的有机溶媒，这就导致了较高的溶媒损耗、回收费用以及较高的安全设施要求、高昂的环保费用。以上这两条都造成了有机溶媒提取方法生产的产品成本较高。
WO97/29207公布了一种不需有机溶媒提取纳他霉素的方法。该方法先使用物理或化学的方法使发酵液中菌丝体细胞破碎、降解，发酵液中的纳他霉素固体悬浮在水相中，然后通过应用重力梯度离心技术使纳他霉素固体与细胞碎片分离得到产品。该方法具有工艺路线短的优点，但此工艺对发酵液中纳他霉素的含量要求较高(大于7克/升)，同时对发酵液中的纳他霉素晶体大小及均一度都有严格的要求。另外，从抗生素提取纯化专业角度来讲，利用重力梯度离心技术来彻底分离不同粒度大小的颗粒会对分离设备提出极高的要求，同时也需要高额的设备维护费用。从以上两点可看出该提取方法的应用有一定的局限性。
目前已知的对纳他霉素溶解特性的研究只局限于有机溶剂的范围，绝大多数纳他霉素的提取方法也是建立在此基础上的。
发明内容
本发明的目的是提供一种从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，以非有机溶媒法从发酵液中提取纳他霉素为特征，解决了有机溶媒法提取纳他霉素造成的纳他霉素提取生产过程中有机溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高的问题，提供了一种经济、绿色环保并适于产业化生产的提取方法。
本发明的目的是以如下方式实现的我们研究了纳他霉素在不同条件下在水中溶解度及稳定性的变化趋势，发现纳他霉素在中性条件下在水中的溶解度极低，但在酸性条件下随着pH降低及碱性条件下随着pH升高其溶解度逐渐升高，根据此特性，我们研究出不需有机溶剂从纳他霉素发酵技术培养物中直接提取纳他霉素的方法，该方法包括升高发酵液pH值使纳他霉素溶于水；去除菌丝体，收集纳他霉素水相提取液；降低提取液pH值使纳他霉素沉淀析出；回收、干燥沉淀得到纳他霉素固体。该方法的具体步骤是a.在0-35℃条件下将发酵技术培养物用碱性物质搅拌均匀调节pH值至10.0-14.0；b.固液分离收集滤液得到纳他霉素水相提取液；c.常温下酸化调节滤液pH值至5.0-9.0，纳他霉素沉淀析出得到纳他霉素的结晶液；d.结晶液经固液分离得到纳他霉素产品。
纳他霉素发酵技术培养物为纳他霉素发酵液，或纳他霉素发酵液通过固液分离技术得到的部分脱水浓菌浆或菌渣或干燥菌丝体。优选纳他霉素发酵液。菌渣或干燥菌丝体碱化前先制成与水或稀碱的悬浮液。
a步骤的碱性物质为氢氧化钠或氢氧化钾或氨水，为工业上常用的调节溶液至碱性的物质。
a步骤中将纳他霉素发酵技术培养物用碱性物质调节pH值优选11.5-12.5。
a步骤中将纳他霉素发酵技术培养物用碱性物质碱化时的温度优选5-25℃。
b步骤的固液分离方法采用一般抗生素提取纯化专业技术人员所能利用的固液分离方法，如板框过滤、重力离心、离心过滤、错流过滤，去除菌丝体，收集滤液得到纳他霉素水相提取液。
b步骤固液分离得到的纳他霉素水相提取液加入0.1-2.5％(W/V)的活性炭搅拌30分钟以上进行脱色处理。
c步骤酸化调节滤液pH值过程，滤液的温度可以保持在5-25℃，用工业上常用的酸，如盐酸、硫酸、磷酸等，或其制备得到的酸性溶液调节滤液pH值，降低纳他霉素在水相中的溶解度，使纳他霉素形成沉淀析出得到纳他霉素的结晶液。
d步骤结晶液的固液分离选用任一种常规的固液分离方法，如离心过滤、抽滤、板框过滤等，将结晶液进行固液分离得到纳他霉素晶体。
d步骤经固液分离得到的纳他霉素产品，在经无盐水洗涤2～3次后，采用常规的干燥方法在50-80℃条件下干燥至水分介于6.0-9.0％，即可得到类白色至淡黄色、含量大于80％的纳他霉素固体。常规的干燥方法如加热鼓风干燥、真空干燥等。
本发明以通过工业上常用的微生物培养手段，培养可以生产纳他霉素的链霉菌，如褐黄孢链霉菌、纳塔尔链霉菌、恰恰努加链霉菌等纳他霉素产生菌，得到纳他霉素的发酵液或发酵液经预处理后的产物为对象，生产纳他霉素成品。该提取方法具有不使用有机溶媒、成本低、环保、对发酵液及设备的特性要求低等特点。
具体实施例方式实施例1取纳他霉素发酵液3.0L，含量4.6g/l。先将发酵液降温至15℃；再用4mol/L的KOH溶液调节pH至12.0后搅拌30分钟，此过程中保持温度15℃；将碱化的发酵液在3000转速下离心15分钟后，收集离心上清液，然后用1.0mol/L的HCl溶液调节上清液pH至6.0-7.0使纳他霉素沉淀析出。抽滤结晶液以适量无盐水洗涤两次后，60℃鼓风干燥3小时得纳他霉素11.90克，含量84.5％。
实施例2将纳他霉素菌丝体200克，其中纳他霉素含量为8.9％，加入2升无盐水中搅拌使菌丝体充分悬浮，并降温至5℃。用2mol/L的氨水调节pH至11.5后搅拌30分钟，此过程中保持温度15℃，抽滤分离菌渣，收集滤液。然后用0.5mol/L的H2SO4溶液调节滤液pH至6.0-7.0使纳他霉素沉淀析出。抽滤结晶液以适量无盐水洗涤两次后，50℃、-0.09MPa条件下真空干燥3小时得纳他霉素15.0克，含量85.3％。
实施例3取纳他霉素发酵液1000L，含量3.8g/l。先将发酵液降温至20℃；再用4mol/L的NaOH溶液调节pH至12.0后搅拌30分钟，保持温度15℃；向碱化的发酵液中加入2Kg助滤剂搅拌均匀后，用板框过滤机进行过滤。收集滤液，然后用1.0mol/L的HCl溶液调节滤液pH至6.0-7.0，使纳他霉素沉淀析出。用三足式离心机分离沉淀，再以适量无盐水洗涤两次后，60℃鼓风干燥3小时，得纳他霉素3136克，含量82.4％。
权利要求
1.一种从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.在0-35℃条件下将发酵技术培养物用碱性物质搅拌均匀调节pH值至10.0-14.0；b.固液分离收集滤液得到纳他霉素水相提取液；c.常温下酸化调节滤液pH值至5.0-9.0，纳他霉素沉淀析出得到纳他霉素的结晶液；d.结晶液经固液分离得到纳他霉素产品。
2.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于纳他霉素发酵技术培养物为纳他霉素发酵液，或纳他霉素发酵液通过固液分离技术得到的部分脱水浓菌浆或菌渣或干燥菌丝体。
3.根据权利要求2所述的从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于纳他霉素发酵技术培养物为纳他霉素发酵液。
4.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于a步骤的碱性物质为氢氧化钠或氢氧化钾或氨水。
5.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于a步骤中将纳他霉素发酵技术培养物用碱性物质调节pH值至11.5-12.5。
6.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于a步骤中将纳他霉素发酵技术培养物用碱性物质碱化时的温度保持在5-25℃。
7.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于b步骤固液分离得到的纳他霉素水相提取液加入0.1-2.5％(W/V)的活性炭搅拌30分钟以上进行脱色处理。
8.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，其特征在于d步骤经固液分离得到的纳他霉素产品，在经无盐水洗涤2～3次后，采用常规的干燥方法在50-80℃条件下干燥至水分介于6.0-9.0％，得到类白色至淡黄色、含量大于80％的纳他霉素固体。
全文摘要
一种从发酵技术培养物中提取纳他霉素的方法，包括以下步骤在0－35℃条件下将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值至10.0－14.0，搅拌均匀；固液分离收集滤液得到纳他霉素水相提取液；常温下酸化调节滤液pH值至5.0－9.0时纳他霉素沉淀析出得到纳他霉素的结晶液；结晶液经固液分离得到纳他霉素产品。该提取方法具有不使用有机溶媒、成本低、环保、对发酵液及设备的特性要求低的等特点。
文档编号C12R1/465GK101062934SQ20071001583
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月31日 优先权日2007年5月31日
发明者梁景乐, 张利强 申请人:山东鲁抗医药股份有限公司