一种利用融合表达提高酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用融合表达提高酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工 程领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖二酸及其衍生物是自然界存在的一种无毒成分，在一些植物及哺乳动物中 均有发现，特别是在一些十字花科蔬菜、苹果和柑橘类水果中含量丰富。葡萄糖二酸具有重 要的生理功能，广泛的应用于食品、化工、医药等领域，被美国能源部确定为"最有价值的生 物炼制产品"。它可以降低胆固醇、用于糖尿病的治疗，预防及辅助治疗癌症，同时其钙盐也 是一种食品添加剂。葡萄糖二酸又是羟基化尼龙、聚酰胺类聚合物的基本聚合单位，可用于 合成环保型的可降解聚合物，用于洗涤剂中替代磷酸盐的使用等。葡萄糖二酸其结构与单 糖结构相似，可以通过糖转运系统进入细胞内部，能够在病灶部位聚集，并少量被缺血组织 快速吸收，因此可以作为显像剂应用于心肌梗死和肿瘤的研宄中。
[0003] 目前葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法，如硝酸氧化、以2, 2, 6, 6-四甲基哌啶 氧化物（TEMPO)及其衍生物为催化剂的共催化氧化及光催化氧化等。硝酸氧化法主要是以 葡萄糖为原料，通过硝酸氧化为葡萄糖二酸及其小分子物质。此种方法生成的产物较多，副 产物复杂，同时产生大量气体，其反应废液对环境产生污染，因此逐渐被新方法取代。TEMPO 氧化体系对糖类伯羟基的氧化选择性高、反应条件温和、能避免降解。由于葡萄糖二酸的水 溶液易形成葡萄糖1，4_内酯及葡萄糖6, 3-内酯，所以在制备过程中以制得单钾盐为最终 产物。此方法所用TEMPO可回收利用，产物纯化容易，便于操作，是目前常用的一种方法。但 是由于反应过程中的反应温度及pH不易控制，因此仍然需要改进。
[0004] 由于化学法所存在的局限较多，通过生物法来制备葡萄糖二酸越来越受到研宄者 的关注。葡萄糖二酸是存在于哺乳动物的代谢途径中，它与抗坏血酸是葡萄糖醛酸代谢途 径的终产物。然而，从D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。Prather 等通过重组大肠杆菌，分别从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和小鼠体内获取肌 醇-1-磷酸合成酶（Inol)和肌醇氧化酶（MIOX)，从丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae) 获得醛酸脱氢酶基因，克隆到大肠杆菌中，实现了葡萄糖二酸的生物合成。发明人之前通过 构建重组酵母菌株，表达肌醇氧化酶（MIOX)及醛酸脱氢酶（Udh)成功实现了葡萄糖二酸的 生成。但是葡萄糖二酸还有待提高。
[0005] 本发明采用融合酶的分子设计策略，将醛酸脱氢酶（Udh)融合在肌醇氧化酶 (MIOX)的N端，采用的构建方式为直接融合及通过添加连接肽进行融合。本发明中构建的 新型重组工程菌进一步提高了葡萄糖二酸的产量，为高产葡萄糖二酸提供了新的思路。
【发明内容】
[0006] 本发明通过将肌醇加氧酶基因（miox)及醛酸脱氢酶基因（Udh)通过融合，克隆表 达至酵母菌株中，构建重组酵母，该重组酵母菌能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合 成葡萄糖二酸。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种重组酵母菌，该重组酵母菌融合表达肌醇加氧酶 MIOX和醛酸脱氢酶Udh。
[0008] 所述肌醇加氧酶基因 miox，在本发明的一种实施方式中，来源于以下任意一种： 小鼠（mouse)、毕赤酵母（Pichia pastoris GS115)、白假丝酵母（Candida albicans)。
[0009] 所述醛酸脱氢酶基因 udh，在本发明的一种实施方式中，来源于恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)〇
[0010] 所述肌醇加氧酶和醛酸脱氢酶，在本发明的一种实施方式中，醛酸脱氢酶是NCBI 上登录号为BK006380的酶；肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 29所示。
[0011] 所述肌醇加氧酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 30所 不O
[0012] 所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，是将醛酸脱氢酶基因 Udh融合在肌 醇加氧酶基因 miox的N端。
[0013] 所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，是直接融合表达或者使用连接肽进 行融合表达，即将两个酶的编码基因首尾相连（去掉第一个酶的终止密码子）直接融合，或 者通过连接肽将两个酶的编码基因融合。
[0014] 所述连接肽，在本发明的一种实施方式中，为GGGGS，GGGGSGGGGS， GGGGSGGGGSGGGGS， ΕΑΑΑΚ,ΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚ， EAAAKEAAAKEAAAK， PTPTP， PTPTPTPTP， ΡΤΡΤΡΤΡΤΡΤΡΤΡΤΡ 及 SSSNNNNNNNNNN。优选 GGGGS、ΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚο
[0015] 所述连接肽，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的序列。
[0016] 所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，融合基因前有毕赤酵母组成型启动 子 GAP 〇
[0017] 所述重组酵母菌，在本发明的一种实施方式中，其出发宿主菌为以下任意一种：酿 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母（Candida Iipolytica)、毕赤酵母 (Pichia pastoris)。优选毕赤酵母。
[0018] 所述肌醇加氧酶基因 miox和醛酸脱氢酶基因 udh，在本发明的一种实施方式中， 为游离表达或者整合表达。优选整合表达。
[0019] 本发明的第二个目的是提供一种所述重组毕赤酵母菌的构建方法，是将GAP启动 子、udh基因及miox基因按照顺序融合，然后连接到表达载体上，再转化到毕赤酵母、酿酒 酵母或解脂假丝酵母中得到的。
[0020] 所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，还包括在udh基因和miox基因之间 添加不同的连接肽。
[0021] 所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是（1)或（2)中的任意一种：
[0022] (1):以恶臭假单胞菌（P. putida)的基因组为模板扩增udh基因，以pGAPZB质粒 为模板扩增GAP启动子，以pUC57-MI0X质粒为模板扩增miox基因，将GAP启动子、udh基 因及miox基因按照顺序融合（去除udh的终止密码子），并在融合片段上下游分别引入 了酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组 质粒，命名为pPIC9KGAP-Udh-MI0X，将重组质粒转化到宿主P. pastoris GS115中即得到 P. pastoris GSl15-(Udh-MIOX)；
[0023] (2)按照（1)中方法扩增GAP启动子、udh基因及miox基因，设计引物时在Udh的 下游引物，及MIOX的上游引物中引入不同的连接肽的核苷酸序列，将GAP启动子、udh基因 及miox基因按照顺序融合，并在udh基因及miox基因之间引入不同的连接肽，在融合片段 上下游分别引入了酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获 得正确的重组质粒，将重组质粒转化到宿主P. pastoris GS115中即得到重组酵母菌。
[0024] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述重组酵母菌生产葡萄糖二酸的方法，所 述方法是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。
[0025] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是采用摇瓶发酵培养或者发酵罐发酵培 养。
[0026] 所述摇瓶发酵培养，在本发明的一种实施方式中，是将重组酵母菌种子液以 5% -10%的接种量接种到发酵培养基中，25°C -30°C，180-220rpm培养24-96h。
[0027] 所述发酵罐发酵培养，在本发明的一种实施方式中，是将重组酵母菌种子液以 5% -10%的接种量接种到发酵培养基中，25°C -30°C，600rpm-1000rpm，通气量l-4vvm，控 制 pH 5-6,培养 24h - 144h。
[0028] 所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，其碳源为葡萄糖和/或肌醇。
[0029] 所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，为含有10g/L肌醇的Yro培养基。
[0030] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是，摇瓶发酵培养时，将种子培养液 按10%接种量接种到发酵培养基中，温度为30°C，搅拌转速为220rpm，发酵培养96h。3L 罐发酵培养时，将种子培养液按10%接种量接种到含有发酵培养基的3L发酵罐中，温度为 30°〇，控制搅拌转速为800-1000印111，通气量3-111，用50%( ￥八）的氨水控制？!15.5，发酵 培养132小时。
[0031] 本发明的第四个目的是提供一种提高重组酵母菌发酵生产葡萄糖二酸的方法，所 述方法是在酵母中融合表达肌醇加氧酶MIOX和醛酸脱氢酶Udh。
[0032] 所述融合表达是将醛酸脱氢酶基因 udh融合在肌醇加氧酶基因 miox的N端； 所述融合表达是直接融合表达或者使用连接肽进行融合表达。所述连接肽为GGGGS或 EAAAKEAAAKEAAAKo
[0033] 本发明的有益效果：
[0034] (1)本发明通过融合表达的方法，将醛酸脱氢酶基因 udh融合在肌醇加氧酶基因 miox的N端，得到了一系列葡萄糖二酸产量提高的重组酵母菌。本发明所用融合酶的设计 策略可以使多个蛋白酶集成于一体，在顺序催化反应中可以强化中间产物在两个酶或多酶 之间的传递过程，减少中间产物的其他副反应的竞争，减少中间体不稳定性导致的降解，更 重要的是增加中间产物在催化活性中心附近的局部浓度，从而加速整个顺序催化过程。通 过在两个酶之间引入连接肽，可以将两个酶的结构域适当的隔开，从而避免了不同结构域 在折叠、催化等过程中的干扰。
[0035] (2)重组菌株 P. pastoris GSl 15-Udh-(GS)「MIOX、P. pastoris GSl 15-(Udh-MIOX)、P. pastoris GSl 15-Udh-(EAK)3-MIOX 产葡萄糖二酸的量分别为 944. 67mg/L、921. 30mg/L及930. 63mg/L，相比为融合表达的对照菌株（777. 13mg/L)，分别 提高了 21. 6%、18· 6%、19· 8%。同时 P. pastoris Gs