培养基及其在发酵生产丙酸中的应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及培养基及其在发酵生产丙酸中的应用。

背景技术：

丙酸及其钙盐作为一种防腐保鲜剂，对于霉菌、酵母菌及细菌等具有广泛的抗菌作用，尤其是丙酸钙，在酸性条件下，产生游离丙酸，具有抗菌作用。丙酸钙其抑菌作用受环境pH值的影响，在pH值5.0时霉菌的抑制作用最佳；pH值6.0时抑菌能力明显降低，最小抑菌浓度为0.01％。在酸性介质(淀粉、含蛋白质和油脂物质)中丙酸及其钙盐对各类霉菌、革兰氏阴性杆菌或好氧芽孢杆菌有较强的抑制作用，还可以抑制黄曲霉素的产生，而对酵母菌无害，对人畜无害，无毒副作用，并能给人畜提供必需的钙。因此丙酸及其钙盐是食品、酿造、饲料、中药制剂诸方面的一种新型、安全、高效的食品与饲料用防霉剂，被广泛的应用于食品、饲料、医药等方面。

丙酸还是种重要的精细化工原料及产品，在有机合成工业、涂料、油漆、染料、化妆品、医药、农药、香料、林产化学产业及其它一些部门有着广泛的应用。以丙酸作原料可制得DL-丙氨酸，进而可生产维生素B6；用丙酸、乙酸和纤维素反应生成CAP，可生成一种生物可降解塑料；还用于生产农药除草剂的2-氯丙酸，用于工业、建筑等的粘着剂、防水剂的丙酸乙烯酯等，都是以丙酸作为原料；丙酸另外还可用作电镀助剂等。

现有丙酸及其钙盐生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。国际上主要采用化学合成法以石油为原料工业化生产丙酸及其钙盐，然而，化学合成法污染重、成本高、操作条件苛刻，不符合全球环保意识不断增强的潮流，因此，人们逐渐把注意力投向了微生物发酵法。

目前，国内工业上常使用甘油作为碳源发酵培养基发酵生产丙酸，所得丙酸与碱或盐进一步反应生成相应的丙酸盐，但是以甘油为碳源丙酸菌菌体生长速度缓慢，达到所需菌体密度时间较长，从而使发酵时间延长，所以缩短发酵时间进行高密度培养提高产量已成为微生物法发酵丙酸钙研究的主要方向。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供培养基及其在发酵生产丙酸中的应用，本发明在发酵培养基中添加氯化血红素、无机盐，并以葡萄糖作为碳源，从而使丙酸杆菌生长旺盛，提高了丙酸的产量。

本发明提供了一种活化产酸丙酸杆菌种子的培养基，包括：

本发明实施例中，活化产酸丙酸杆菌种子的培养基的pH值为7.0。

其中，葡萄糖的浓度为20g/L。

酵母提取物为酵母粉，蛋白胨为胰蛋白胨大豆肉汤。

本发明还提供了一种发酵培养基，包括水和：

本发明实施例中，发酵培养基中包括：

本发明实施例中，发酵培养基中包括：

本发明实施例中，发酵培养基中包括：

本发明实施例中，发酵培养基中包括：

本发明实施例中，活化产酸丙酸杆菌种子的培养基的pH值为7.0。

其中，葡萄糖的浓度为20g/L。

酵母提取物为酵母膏。

本发明提供的发酵培养基以葡萄糖为碳源，其中添加氯化血红素及硫酸锰、氯化镁，从而能够提高产酸丙酸杆菌的活性，使菌种生长良好，并且提高丙酸的产量，实验表明，采用本发明提供的发酵培养基进行发酵生产丙酸，丙酸的在培养液中的含量可达244.7ppm。发酵生产率为0.213g/(L·h)，生产速率比原发酵生产率0.143g/(L·h)提高了48.83％。

本发明提供的发酵培养基在发酵生产丙酸中的应用。

本发明还提供了一种发酵生产丙酸的方法，包括：

步骤1：以活化产酸丙酸杆菌种子的培养基将保藏编号为CGMCC 1.2232的产酸丙酸杆菌活化，制得活化菌种；

步骤2：将活化菌种接种至本发明提供的发酵培养基，经发酵至pH值恒定获得含有丙酸的发酵液；

所述发酵至120h，补加甘油及氯化血红素。

步骤1中所述活化为将保藏编号为CGMCC 1.2232的产酸丙酸杆菌接种于活化产酸丙酸杆菌种子的培养基，在无氧条件下，30℃培养48h。

活化步骤中，所述产酸丙酸杆菌与活化产酸丙酸杆菌种子的培养基的体积比为1:99。

活化步骤中，培养基的体积占培养用厌氧瓶体积的4/5。优选为，250mL厌氧瓶装200mL活化产酸丙酸杆菌种子的培养基。

其中，步骤2中活化菌种与本发明提供的发酵培养基的体积比为1:9。

为保持无氧条件需持续充入氮气。

本发明所述发酵生产丙酸的方法在发酵过程中对发酵pH进行分段控制。

所述分段控制优选为：发酵0～120小时的pH值为5.5～6.7；发酵120h后，pH值为6.8～6.99。

具体的，步骤2中发酵的条件为无氧发酵，温度为30℃～35℃，搅拌转速50rpm～150rpm，发酵前120h调节pH值为6.2；120h后调节pH值为6.9。

pH值的调节采用流加碱液的方式。

所述碱液为氢氧化钙水溶液。其中，Ca(OH)₂的质量-体积(g/mL)比为10％。

一些实施例中，步骤2中无氧发酵的温度为30℃，搅拌转速为150rpm。

氯化血红素溶解于甘油；所述补加至发酵液中氯化血红素的浓度为4mg/L；补加至发酵液中甘油的浓度为20g/L～40g/L。

本发明中，步骤2中无氧发酵于发酵罐中进行，为保持无氧条件需持续充入氮气。发酵罐中，发酵培养基占发酵罐体积的3/5。优选为，10L发酵罐装6L发酵培养基。经过流加碱液、补加含有氯化血红素的甘油、发酵后，发酵液的体积为7L。

作为优选，产酸丙酸杆菌在活化前经过前处理；前处理为将保藏编号为CGMCC 1.2232的产酸丙酸杆菌接种于前处理培养基；在无氧条件下，30℃培养60h；所述前处理培养基包括：

前处理中，所述产酸丙酸杆菌与活化产酸丙酸杆菌种子的培养基的体积比为1:99。

为了制得丙酸产品，将步骤2中获得的含有丙酸的发酵液经离心机离心后，去除菌体，取上清液进行喷雾干燥，获得丙酸产品。

本发明提供培养基，并提供了利用培养基进行发酵生产丙酸的方法，本发明以葡萄糖为碳源，其中添加氯化血红素及硫酸锰、氯化镁，从而能够提高产酸丙酸杆菌的活性，使菌种生长良好，并且提高丙酸的产量，实验表明，采用本发明提供的发酵培养基进行发酵生产丙酸，丙酸在培养液中的含量可达48.95g/L。发酵生产率为0.213g/(L·h)，生产速率比原发酵生产率0.143g/(L·h)提高了48.83％。

附图说明

图1示实施例1测量丙酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；

图2示实施例2测量丙酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；

图3示实施例3测量丙酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；

图4示实施例4测量丙酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；

图5示实施例5测量丙酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；

图6示对比例1测量丙酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度；

图7示对比例2测量丙酸含量的色谱图，其中横坐标为时间，纵坐标为高度。

具体实施方式

本发明提供了培养基及其在发酵生产丙酸中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明发酵工艺生产丙酸

一、预处理

将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1％的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中，向厌氧瓶中充氮气后，置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量为水，pH 7.0。

二、种子液

将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基)，充入无菌氮气，培养温度为30℃，时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计，二级种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量为水，pH 7.0。

三、生产发酵

1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，初始发酵培养基成分：按重量百分比计，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血红素3mg/L、硫酸锰0.015g/L、氯化镁0.02g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L，葡萄糖：10g/L，余量为水，发酵120小时后，按发酵液体积计算，补加30g/L的甘油及4mg/L的氯化血红素。

2、将种子液按照10％的接种量接种于发酵罐中；

发酵生产：培养温度为30℃，搅拌速率150rpm，并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10％的Ca(OH)₂溶液，发酵前120小时将pH值维持在6.2，发酵120小时后将pH维持在6.9。

3、发酵过程结束：

pH值不再变化，发酵停止，离子色谱法测量丙酸含量(样品稀释200倍)，丙酸含量为37.25g/L(图1)，发酵所用时间为216h，丙酸生产速率为0.172g/(L·h)，生产率提高20.58％。

实施例2本发明发酵工艺生产丙酸

一、预处理

将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1％的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中，向厌氧瓶中充氮气后，置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量为水，pH 7.0。

二、种子液

将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基)，充入无菌氮气，培养温度为30℃，时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计，二级种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量为水，pH 7.0。

三、生产发酵

1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，初始发酵培养基成分：按重量百分比计，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血红素3mg/L、硫酸锰0.015g/L、氯化镁0.02g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量为水，发酵120小时后，按发酵液体积计算，补加30g/L的甘油及4mg/L氯化血红素。

2、将种子液按照10％的接种量接种于发酵罐中；

发酵生产：培养温度为30℃，搅拌速率150rpm，并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10％的Ca(OH)₂溶液，发酵前120小时将pH值维持在6.2，发酵120小时后将pH维持在6.9。

3、发酵过程结束：

pH值不再变化，发酵停止，离子色谱法测量丙酸含量(样品稀释200倍)，丙酸含量为38.70g/L(图2)，发酵所用时间为214h，丙酸生产速率为0.181g/(L·h)，生产率提高26.47％。

实施例3本发明发酵工艺生产丙酸

一、预处理

将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1％的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中，向厌氧瓶中充氮气后，置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量为水，pH 7.0。

二、种子液

将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基)，充入无菌氮气，培养温度为30℃，时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计，二级种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量为水，pH 7.0。

三、生产发酵

1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，初始发酵培养基成分：按重量百分比计，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血红素3mg/L、硫酸锰0.015g/L、氯化镁0.02g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L，葡萄糖：30g/L，余量为水，发酵120小时后，按发酵液体积计算，补加30g/L的甘油及4mg/L氯化血红素。

2、将种子液按照10％的接种量接种于发酵罐中；

发酵生产：培养温度为30℃，搅拌速率150rpm，并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10％的Ca(OH)₂溶液，发酵前120小时将pH值维持在6.2，发酵120小时后将pH维持在6.9。

3、发酵过程结束：

pH值不再变化，发酵停止，离子色谱法测量丙酸含量(样品稀释200倍)，丙酸含量为40.35g/L(图3)，发酵所用时间为210h，丙酸生产速率为0.192g/(L·h)，生产率提高34.37％。

实施例4本发明发酵工艺生产丙酸

一、预处理

将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1％的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中，向厌氧瓶中充氮气后，置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量为水，pH 7.0。

二、种子液

将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基)，充入无菌氮气，培养温度为30℃，时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计，二级种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量为水，pH 7.0。

三、生产发酵

1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，初始发酵培养基成分：按重量百分比计，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血红素2mg/L、硫酸锰0.01g/L、氯化镁0.01g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量为水，发酵120小时后，按发酵液体积计算，补加20g/L的甘油及4mg/L的氯化血红素。

2、将种子液按照10％的接种量接种于发酵罐中；

发酵生产：培养温度为30℃，搅拌速率150rpm，并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10％的Ca(OH)₂溶液，发酵前120小时将pH值维持在6.2，发酵120小时后将pH维持在6.9。

3、发酵过程结束：

pH值不再变化，发酵停止，离子色谱法测量丙酸含量(样品稀释200倍)，丙酸含量为36.13g/L(图4)，发酵所用时间为217h，丙酸生产速率为0.166g/(L·h)，生产率提高16.43％。

实施例5本发明发酵工艺生产丙酸

一、预处理

将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1％的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中，向厌氧瓶中充氮气后，置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量为水，pH 7.0。

二、种子液

将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基)，充入无菌氮气，培养温度为30℃，时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计，二级种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量为水，pH 7.0。

三、生产发酵

1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，初始发酵培养基成分：按重量百分比计，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血红素4mg/L、硫酸锰0.025g/L、氯化镁0.03g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量为水，发酵120小时后，按发酵液体积计算，补加40g/L的甘油及4mg/L的氯化血红素。

2、将种子液按照10％的接种量接种于发酵罐中；

发酵生产：培养温度为30℃，搅拌速率150rpm，并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10％的Ca(OH)₂溶液，发酵前120小时将pH值维持在6.2，发酵120小时后将pH维持在6.9。

3、发酵过程结束：

pH值不再变化，发酵停止，离子色谱法测量丙酸含量(样品稀释200倍)，丙酸含量为48.95g/L(图5)，发酵所用时间为230h，丙酸生产速率为0.213g/(L·h)，生产率提高48.83％。

对比例1现有发酵工艺生产丙酸

一、预处理

将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1％的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中，向厌氧瓶中充氮气后，置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、甘油：40g/L，余量为水，pH 7.0。

二、种子液

将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基)，充入无菌氮气，培养温度为30℃，时间为60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、甘油：40g/L，余量为水，pH 7.0。

三、生产发酵

1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，发酵培养基成分：按重量体积百分比计，酵母粉：10g/L、蛋白胨：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、甘油：40g/L，余量为水，pH 7.0。

2、将种子液按照5％的接种量接种于发酵罐中；

发酵生产：培养温度为30℃，搅拌速率50rpm，并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10％的Ca(OH)₂溶液，将pH值维持在7.0。

3、发酵过程结束：

当pH值不再变化，发酵停止，离子色谱法测量丙酸含量(样品稀释200倍)，丙酸含量为33.7g/L(图6)，发酵所用时间为235h，丙酸生产速率为0.143g/(L·h)。

对比例2其它培养基发酵生产丙酸

一、预处理

将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1％的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中，向厌氧瓶中充氮气后，置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计，种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量为水，pH 7.0。

二、种子液

将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1％的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基)，充入无菌氮气，培养温度为30℃，时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计，二级种子培养基的成分为，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉汤：5g/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量为水，pH 7.0。

三、生产发酵

1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基，初始发酵培养基成分：按重量百分比计，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血红素4mg/L、磷酸氢二钾：2.5g/L、磷酸二氢钾：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量为水，发酵120小时后，按发酵液体积计算，补加40g/L的甘油及4mg/L氯化血红素。

2、将种子液按照5％的接种量接种于发酵罐中；

发酵生产：培养温度为30℃，搅拌速率50rpm，并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10％的Ca(OH)₂溶液，将pH值维持在7.0。

3、发酵过程结束：

当pH值不再变化，发酵停止，离子色谱法测量丙酸含量(样品稀释200倍)，丙酸含量为34.9g/L(图7)，发酵所用时间为226h，丙酸生产速率为0.154g/(L·h)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。